Submitted by Lucas Moreira Silva null (lucas_silvamg@hotmail.com) on 2018-09-11T11:36:07Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado LUCAS MOREIRA SILVA.pdf: 1668807 bytes, checksum: 0e91732240a421d8109ffd07d2bda313 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-09-13T13:49:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_lm_me_araiq_int.pdf: 1649414 bytes, checksum: ad9e66c28797edd0c19dcbe90b8e00a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-13T13:49:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_lm_me_araiq_int.pdf: 1649414 bytes, checksum: ad9e66c28797edd0c19dcbe90b8e00a3 (MD5) Previous issue date: 2018-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O desenvolvimento de métodos analíticos com maior seletividade e sensibilidade tem ampla importância para a determinação de diferentes compostos químicos. O emprego de polímeros molecularmente impressos, do inglês “Molecularly Imprinted Polymers” (MIP), que são obtidos por polimerização na presença de uma molécula molde (template) a ser impressa, de tal forma que um esqueleto polimérico é formado ao redor do. No caso deste trabalho, o template utilizado foi a ciprofloxacina, antibiótico amplamente empregado no tratamento de doenças de seres humanos e animais. Desta maneira foi realizado a síntese das nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, pelo método de co-precipitação, estas foram recobertas com MIP em sua superfície, formando assim um material híbrido do tipo Core-Shell. Foram realizadas duas sínteses distintas, sendo um primeiro MIP utilizando apenas o ácido acrílico como monômero funcional (Mag-MIP1), e um segundo MIP tendo em sua estrutura o ácido acrílico e o 1-vinilimidazol como monômeros funcionais (Mag-MIP2). Os materiais foram caracterizados fisicamente por diferentes técnicas. Foram realizados experimentos de otimização do Mag-MIP1 e Mag-MIP2, foi observado que o Mag-MIP1 exibiu um tempo ótimo de interação de 120 min em meio aquoso, enquanto que o Mag-MIP2 apresentou um tempo ótimo de interação de 30 min em meio de água/metanol (70:30) v/v. No que se refere ao parâmetro de seletividade, o Mag-MIP2 exibiu um valor de seletividade (S) ≥ 2, enquanto que o Mag-MIP1 apresentou valores de S ≥ 1. Os materiais desenvolvidos foram aplicados como fase dispersiva extratora em amostras de leite bovino do tipo integral e do tipo desnatado. Sob as mesmas condições experimentais, foi avaliada a capacidade de extração da ciprofloxacina adsorvida nos materiais sintetizados. O Mag-MIP1 apresentou um percentual de recuperação médio de 85% para amostras de leite bovino do tipo integral e 90% para amostras de leite bovino do tipo desnatado. O Mag-MIP2 exibiu o valor de 80% para amostras de leite bovino do tipo integral e 55% para amostras de leite bovino do tipo desnatado, sugerindo que neste caso precisa-se ainda otimizar a dessorção do analito para obtenção de resultados satisfatórios para o Mag-MIP2. Contudo, os Mag-MIP desenvolvidos mostraram-se promissores para serem utilizados como fase adsorvente em sistemas de extração em fase sólida e, evidencia que o uso de dois monômeros funcionais poderá melhorar a eficiência dos polímeros molecularmente impressos, uma vez que mostrou maior seletividade e menor tempo de interação para a adsorção de ciprofloxacina, contribuindo para o avanço no grupo e na área de pesquisa. / The development of analytical methods with greater selectivity and sensitivity is of great importance for the determination of different chemical compounds. The use of molecularly imprinted polymers (Molecularly Imprinted Polymers) (MIP), which are obtained by polymerization in the presence of a template molecule to be printed, such that a polymeric backbone is formed around the polymer. In the case of this w ork, the template used was ciprofloxacin, an antibiotic widely used in the treatment of diseases of humans and animals. In this way the synthesis of iron oxide magnetic nanoparticles was performed by the co - precipitation method, these were covered with MIP on their surface, forming a hybrid material of the Core - Shell type. Two distinct syntheses were performed, a first MIP using only acrylic acid as a functional monomer (Mag - MIP1), and a second MIP having acrylic acid and 1 - vinylimidazole as functional mono mers (Mag - MIP2). The materials were physically characterized by different techniques. Mag - MIP1 and Mag - MIP2 optimization experiments were performed, Mag - MIP1 showed an optimal interaction time of 120 min in aqueous medium, while Mag - MIP2 showed an optimal interaction time of 30 min in water / methanol (70:30) v / v medium. As for the selectivity parameter, the Mag - MIP2 exhibited a selectivity value (S) ≥ 2, while the Mag - MIP1 presented values of S ≥ 1 . The materials developed were applied as extractive phase dispersion in samples of bovine milk of the whole type and skimmed - mi lk type. Under the same experimental conditions, the extraction capacity of ciprofloxacin adsorbed on the synthesized materials was evaluated. Mag - MIP1 presented an average recovery percentage of 85% for bovine whole milk samples and 90% for skim milk type samples. Mag - MIP2 showed the value of 80% for bovine milk samples of the integral type and 55% for samples of bovine milk of the skimmed type, suggesting that in this case it is still necessary to optimize the desorption of the analyte to obtain satisfact ory results for the Mag - MIP2. However, the developed Mag - MIPs have shown to be promising to be used as an adsorbent phase in solid phase extraction systems, and it shows that the use of two functional monomers may improve the efficiency of the molecularly printed polymers since it showed greater selectivity and lower interaction time for adsorption of ciprofloxacin, contributing to the advancement in the group and in the research area.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de novos métodos cromatográficos em conjunto com técnicas de microextração para determinação de parabenos em produtos cosméticos e leite humano e rifampicina em amostras de plasma. Destaca-se também o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para extração em fase sólida (SPE) de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo I descreve a avaliação da extração sortiva em barra de agitação (SBSE) em conjunto com a cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de parabenos em produtos cosméticos para fins de controle de qualidade. As variáveis do processo de extração SBSE, tais como tempo e temperatura de extração, pH e força iônica da amostra e condições de dessorção foram otimizadas para aumentar a sensibilidade analítica do método e diminuir o tempo de análise. O método SBSE/LC-UV desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (LQ) a 2,50 µg. mg-1 e coeficientes de determinação maiores que 0,993. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 5,0% para todos os parabenos analisados e a exatidão variou de 90 a 100%. O método desenvolvido foi aplicado para análises de amostras de produtos cosméticos comerciais (cremes hidratantes, antitranspirantes em creme e filtros solares). O método SBSE/LC-UV padronizado e validado resultou nas seguintes vantagens em relação aos métodos convencionais: simplicidade no preparo de amostra, redução do volume de solvente orgânico e da quantidade de amostra utilizada. O capítulo II descreve o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para SPE de parabenos em amostras de leite humano e análises por cromatografia em fase líquida com detecção espectrofotométrica (SPE/LC-UV). Os polímeros de impressão molecular, materiais sintéticos baseados em sistemas biomiméticos, foram sintetizados através do processo sol-gel tendo como molde, o benzilparabeno. Após a remoção do molde, cavidades seletivas (sítios de reconhecimento molecular) ao benzilparabeno e análogos estruturais foram reveladas. O método SPE/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação a 150 ng. mL-1 e coeficientes de determinação 0,992. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 13% e a exatidão variou de 86 a 117%. A aplicabilidade do método SPE/LC foi demonstrada através das análises de amostras de leite humano de lactantes. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método padronizado SPE/LC-UV é adequado para análises de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo III descreve a avaliação da microextraçao em fase sólida no capilar (in-tube SPME) acoplada à cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de rifampicina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis in-tube SPME, tais como fase estacionária da coluna capilar, volume de amostra, ciclos aspirar/dispensar e vazão foram otimizadas visando obter maior eficiência do processo. O método in-tube SPME/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (0,1 µg. mL-1) a 100 µg. mL-1 e coeficientes de determinação igual a 0,998. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 2% e a exatidão variou de 83 a 92%. A aplicabilidade do método in-tube SPME/LC, padronizado e validado foi comprovada através das análises de amostras de plasma de pacientes em tratamento com rifampicina. O método in-tube SPME/LC resultou na automação do processo de análise, maior precisão analítica, menor tempo de análise, menor volume de solvente orgânico e de fluido biológico. / This work describes the development of chromatographic methods in combination with microextraction techniques for the determination of parabens in cosmetic and human milk samples and of rifampicin in plasma samples. The design of a molecularly imprinted extraction phase for the solid-phase extraction (SPE) analysis of parabens in human milk samples is also reported. Chapter I describes the evaluation of the stir bar sorptive extraction (SBSE) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of parabens in cosmetics aiming at quality control. The SBSE variables such as extraction time, temperature, pH of the matrix, ionic strength, and desorption conditions have been optimized, in order to establish the parabens partition equilibrium in a short analysis time. The linear range of the SBSE/LC method lay from LOQ to 2.5 µg. mg-1, with a coefficient of determination higher than 0.993. The interday precision of the SBSE/LC method presented a coefficient of variation lower than 5%, and the accuracy ranged from 90 to 99%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of commercial cosmetic products such as body creams, antiperspirant creams, and sunscreens has been proven. Therefore, the combination of SBSE with liquid desorption, followed by LC analysis, provides a simple, and selective tool for the analysis of parabens in cosmetic products using minimized volume of organic solvent as well as very small amount of the target sample. Chapter II presents the development of a molecularly imprinted extraction phase for the SPE analysis of parabens in human milk samples. The molecularly imprinted polymers, which are synthetic materials based on biomimetic systems, were synthesized by the sol-gel technology in the presence of the template (benzilparaben). After template removal, selective cavities (benzilparaben) were revealed for parabens selective extraction. The linear range of the SPE/LC method lay from LOQ to 150 ng. mL-1, with a coefficient of determination higher than 0.992. The interday precision of the SPE/LC method presented a coefficient of variation lower than 13%, and the accuracy ranged from 86 to 117%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of human milk samples has been demonstrated. According to the evaluated analytical validation parameters, the SPE/LC-UV method is suitable for the analysis of parabens in human milk samples. Chapter III depicts the evaluation of solid-phase microextraction in the capillary (in-tube SPME) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of rifampicin in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The in-tube SPME/LC method was linear over the LOQ (0.1) to 100 g. mL-1 range, with a linear coefficient value (r2) of 0.998. The inter-assay precision presented coefficient of variation 2%, and the accuracy ranged from 83 to 92%. The effectiveness and practicability of the proposed method have been by analysis of plasma samples from ageing patients undergoing therapy with rifampicin. The in-tube SPME/LC method allowed for automated continuous sample preparation (extraction, concentration, desorption, and injection of analytes) and minimized the analysis time as well as the volumes of organic solvent and biological fluid.

As sulfonamidas são antibióticos amplamente utilizados na medicina humana e animal. Por apresentarem um custo relativamente baixo, além de seu uso medicinal são comumente utilizadas como aditivos nos alimentos para promover o crescimento de animais. O alto consumo das sulfonamidas é preocupante, pois grandes quantidades desses compostos são descartadas no ambiente por meio de excreções humanas, excreções animais e por águas residuárias industriais e hospitalares. A presença de sulfonamidas no ambiente, mesmo em níveis de traços, pode gerar uma toxicidade direta nas espécies expostas bem como a proliferação seletiva de bactérias resistentes, que podem transferir os genes de resistência para outras espécies bacterianas. O impacto ambiental negativo ocasionado por esse tipo de composto exige o monitoramento adequado e o consequentemente desenvolvimento de técnicas e métodos de análise e de preparo de amostra que consigam atingir suficientes intervalos e limites de detecção. Na atualidade a SPE é uma técnica bastante utilizada para extração de analitos em amostras ambientais, pois permite trabalhar com um consumo de solvente reduzido, sua reprodutibilidade é alta, o tempo de preparo de amostra é curto e permite a automatização. No formato automatizado on-line a fase extratora é empacotada em uma pré-coluna e ligada ao sistema cromatográfico geralmente por meio de uma válvula de seis pórticos. Dentre as possíveis fases para a SPE os polímeros molecularmente impressos (MIP) têm tornado-se atrativos por causa de sua alta seletividade em comparação com as fases extratoras tradicionais; além disso, permitem, mediante procedimentos simples, associar a tecnologia MIP com a tecnologia de materiais de acesso restrito - RAM (do inglês: restricted access media) obtendo assim os materiais RAM-MIP. Nesse trabalho foi sintetizado e avaliado o desempenho de um polímero de impressão molecular (MIP), e três polímeros de impressão molecular restritos à ligação de macromoléculas (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-MIP-BSA) para a pré-concentração seletiva de sete sulfonamidas (SNs) em amostras complexas para análise em sistema HPLC-bidimensional. Os materiais obtidos foram avaliados em termos de fator de retenção, seletividade, seletividade competitiva e capacidade de eliminação de macromoléculas. O polímero BSA-MIP apresentou os melhores resultados, demonstrando-se muito mais seletivo para sulfonamidas do que para alguns interferentes como fluoroquinolonas, cafeína, ácido acetilsalicílico entre outros, também demonstrou uma capacidade de exclusão de macromoléculas de 97,63% ao ser testado com uma solução de 44 mg mL-1 de BSA. / Sulfonamides are antibiotics widely used in human and veterinary medicine. Due to their relatively low cost and their therapeutic effects, they are frequently employed as growth promoting additive in animal food. This high consumption causes that high amounts of them are being ejected to the environment through the animal and human excrements or industrial and hospital wastewater. Even in trace amount, these compounds can produce direct toxicity in several species and the selective spread of the antibiotic resistant bacteria that can transfer the resistance genes to others bacteria species. This negative impact has to be adequately monitored and, thus, there is a claim to the development of analytical and sample preparation techniques and methods that permit reaching to very low detection limits and intervals. Currently solid phase extraction (SPE) is the technique commonly used for isolation of analytes from environmental samples, since it allows working with smaller volumes of solvent, shorter sample preparation times, achieving high reproducibility and allowing automation. In automated on-line SPE the extracted phase is packed into a precolumn and linked to the chromatographic system, generally by a 6-port valve. Among the possible phases for SPE the molecular imprinted polymer (MIP) has become interesting because it is more selective than traditional extraction; moreover, through simple procedure it can be associated with the restricted acess media (RAM) producing the RAM-MIP and the MIP-BSA materials. Here we synthesized and evaluated the performance of one MIP and three molecular imprinted polymers linked to macromolecules (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-MIP-BSA) for a selective preconcentration of seven sulfonamides in complex samples for two-dimensional HPLC analysis. The synthesized materials was evaluated regarding the retention factor, competitive selectivity and elimination capacity of macromolecules. The BSA-MIP option showed the best results, achieving high selectivity for sulfonamides against others interferences such as fluoroquinolone, caffeine and acetylsalicylic acid; additionally presenting an exclusion capacity of 97,63% of macromolecules when was tested with a BSA solution at 44 mg ml-1.

As sulfonamidas são antibióticos amplamente utilizados na medicina humana e animal. Por apresentarem um custo relativamente baixo, além de seu uso medicinal são comumente utilizadas como aditivos nos alimentos para promover o crescimento de animais. O alto consumo das sulfonamidas é preocupante, pois grandes quantidades desses compostos são descartadas no ambiente por meio de excreções humanas, excreções animais e por águas residuárias industriais e hospitalares. A presença de sulfonamidas no ambiente, mesmo em níveis de traços, pode gerar uma toxicidade direta nas espécies expostas bem como a proliferação seletiva de bactérias resistentes, que podem transferir os genes de resistência para outras espécies bacterianas. O impacto ambiental negativo ocasionado por esse tipo de composto exige o monitoramento adequado e o consequentemente desenvolvimento de técnicas e métodos de análise e de preparo de amostra que consigam atingir suficientes intervalos e limites de detecção. Na atualidade a SPE é uma técnica bastante utilizada para extração de analitos em amostras ambientais, pois permite trabalhar com um consumo de solvente reduzido, sua reprodutibilidade é alta, o tempo de preparo de amostra é curto e permite a automatização. No formato automatizado on-line a fase extratora é empacotada em uma pré-coluna e ligada ao sistema cromatográfico geralmente por meio de uma válvula de seis pórticos. Dentre as possíveis fases para a SPE os polímeros molecularmente impressos (MIP) têm tornado-se atrativos por causa de sua alta seletividade em comparação com as fases extratoras tradicionais; além disso, permitem, mediante procedimentos simples, associar a tecnologia MIP com a tecnologia de materiais de acesso restrito - RAM (do inglês: restricted access media) obtendo assim os materiais RAM-MIP. Nesse trabalho foi sintetizado e avaliado o desempenho de um polímero de impressão molecular (MIP), e três polímeros de impressão molecular restritos à ligação de macromoléculas (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-MIP-BSA) para a pré-concentração seletiva de sete sulfonamidas (SNs) em amostras complexas para análise em sistema HPLC-bidimensional. Os materiais obtidos foram avaliados em termos de fator de retenção, seletividade, seletividade competitiva e capacidade de eliminação de macromoléculas. O polímero BSA-MIP apresentou os melhores resultados, demonstrando-se muito mais seletivo para sulfonamidas do que para alguns interferentes como fluoroquinolonas, cafeína, ácido acetilsalicílico entre outros, também demonstrou uma capacidade de exclusão de macromoléculas de 97,63% ao ser testado com uma solução de 44 mg mL-1 de BSA. / Sulfonamides are antibiotics widely used in human and veterinary medicine. Due to their relatively low cost and their therapeutic effects, they are frequently employed as growth promoting additive in animal food. This high consumption causes that high amounts of them are being ejected to the environment through the animal and human excrements or industrial and hospital wastewater. Even in trace amount, these compounds can produce direct toxicity in several species and the selective spread of the antibiotic resistant bacteria that can transfer the resistance genes to others bacteria species. This negative impact has to be adequately monitored and, thus, there is a claim to the development of analytical and sample preparation techniques and methods that permit reaching to very low detection limits and intervals. Currently solid phase extraction (SPE) is the technique commonly used for isolation of analytes from environmental samples, since it allows working with smaller volumes of solvent, shorter sample preparation times, achieving high reproducibility and allowing automation. In automated on-line SPE the extracted phase is packed into a precolumn and linked to the chromatographic system, generally by a 6-port valve. Among the possible phases for SPE the molecular imprinted polymer (MIP) has become interesting because it is more selective than traditional extraction; moreover, through simple procedure it can be associated with the restricted acess media (RAM) producing the RAM-MIP and the MIP-BSA materials. Here we synthesized and evaluated the performance of one MIP and three molecular imprinted polymers linked to macromolecules (RAM-MIP, BSA-MIP e RAM-MIP-BSA) for a selective preconcentration of seven sulfonamides in complex samples for two-dimensional HPLC analysis. The synthesized materials was evaluated regarding the retention factor, competitive selectivity and elimination capacity of macromolecules. The BSA-MIP option showed the best results, achieving high selectivity for sulfonamides against others interferences such as fluoroquinolone, caffeine and acetylsalicylic acid; additionally presenting an exclusion capacity of 97,63% of macromolecules when was tested with a BSA solution at 44 mg ml-1.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-09-19T17:06:54Z No. of bitstreams: 1 JosimarAraujo.pdf: 950712 bytes, checksum: 6ec752a1c9c3751ffeba0d040eb09762 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T17:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JosimarAraujo.pdf: 950712 bytes, checksum: 6ec752a1c9c3751ffeba0d040eb09762 (MD5) Previous issue date: 2017-09-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The present work describes a study of the construction of an electrochemical sensor involving sol-gel process and molecular imprinting for detection of triclosan. The sol-gel process is a process in which a network is formed from a solution, by progressively changing a liquid precursor, from a sol to a gel and, in most cases, finally to a dry network. In turn, molecular imprinting is a method of induced formation of some predetermined selectivity recognition element for some template molecule. Thus, for the determination of the template molecule triclosan, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)-phenol, the following steps were performed: 1) verification of a glassy carbon electrode modified with chitosan and multi-walled carbon nanotubes, and molecularly imprinted siloxanes, would be suitable for the voltammetric detection of triclosan; 2) to observe if a network would be formed with the sol-gel process and to evaluate the mechanical stability of the electrochemical sensor constructed; 3) to evaluate the modified electrode as an electrochemical sensor with selectivity, specificity and detection limit for the determination of triclosan in aqueous solutions; 4) to verify the applicability of the proposed sensor by detecting of triclosan oxidation in real samples. The results showed that glassy carbon electrode modified with chitosan, multi-walled carbon nanotubes and molecularly imprinted siloxanes, constructed by sol-gel and molecular imprinting processes, presented mechanical stability, sensitivity, selectivity, specificity and applicability as an electrochemical sensor for the detection of triclosan in commercial samples of physical moisturizer and of toothpaste. / O presente trabalho descreve um estudo da construção de um sensor eletroquímico envolvendo processo sol-gel e impressão molecular para detecção de triclosan. O processo sol-gel é um procedimento no qual uma rede é formada a partir de uma solução. Esta formação é por meio de uma mudança progressiva deste líquido inicial, de um sol para um gel e, na maioria dos casos, finalmente para uma rede seca. Por sua vez, a impressão molecular é um método de formação induzida de elementos de reconhecimento com seletividade predeterminada para alguma molécula molde. Assim, para a determinação da molécula molde triclosan, 5-cloro-2- (2,4-diclorofenoxi)-fenol, as seguintes etapas foram executadas: 1) verificar se um eletrodo de carbono vítreo modificado com quitosana, nanotubos de carbono de paredes múltiplas e siloxanos molecularmente impressos seria adequado para a detecção voltamétrica do triclosan; 2) averiguar a formação de uma rede com o processo sol-gel e avaliar a estabilidade mecânica do sensor eletroquímico construído; 3) avaliar a sensibilidade do eletrodo modificado como um sensor eletroquímico com seletividade, especificidade e limite de detecção para a determinação de triclosan em soluções aquosas; e 4) comprovar a aplicabilidade do sensor proposto mediante a detecção de sinal de oxidação de triclosan em amostras reais. Os resultados mostraram que eletrodos de carbono vítreo modificados com quitosana, nanotubos de carbono de paredes múltiplas e siloxanos molecularmente impressos, construídos por processo sol-gel e impressão molecular, apresentaram estabilidade mecânica, sensibilidade, seletividade, especificidade e aplicabilidade como um sensor eletroquímico para a detecção de triclosan em amostras comerciais de hidratante corporal e de creme dental.

As Sulfonamidas (SAs) são antibióticos de uso muito comum na medicina veterinária, sendo também aplicadas na medicina humana. Os resíduos dessas substâncias, ou dos seus metabolitos na carne e outros alimentos, podem causar efeitos adversos para a saúde dos consumidores como, por exemplo, resistências a antibióticos e alergias. Este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos modernos de preparo de amostra para determinação de multiresíduo de sulfonamidas em alimentos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas e ultravioleta visível. Dentre os métodos de preparo de amostra, aplicou-se o método de extração QuEChERS (Quicky, Easy, Cheap. Effective, Rugged, Safe) modificado, em combinação com a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para a análise de dez sulfonamidas em amostras de músculo de frango e bovino. No segundo estudo, seguindo a tendência de miniaturização, sintetizou-se um polímero molecularmente impresso (Sulfadimetoxina-MIP) para uso como sorbente em dispositivos de Microextração com Sorbentes Empacotado (MEPS). O método, denominado SDM-MIP-MEPS, foi otimizado e aplicado em amostras de músculo de frango usando a cromatografia liquida com detecção por ultravioleta-visivel. Embora o uso do polímero molecularmente impresso (MIP) como sorbente seletivo para o MEPS já tenha sido reportada em dois trabalhos, pela primeira vez é descrito a aplicação de um MIP impresso com sulfdimetoxina (SDM), usando MEPS para extração de sulfonamidas em músculo de frango. Portanto, a novidade neste caso, é o uso da nova técnica extração miniaturizada (MEPS) com o polímero sintetizado sulfadimetoxina-MIP como sorbente de empacotamento. As metodologias foram validadas com sucesso de acordo com as diretrizes 657/2002/EU. / Sulfonamides are widely used in veterinary and human medicine. Residues of these compounds, or their metabolites in animal meats and other foods, are toxic and can cause side effects in human\'s health, such as resistance to antibiotics and allergic reactions. This study describes the development and application of a modern sample preparation approach for sulfonamides multiresidue determination in food by chromatographic methods coupled to mass spectrometry and ultraviolet-visible spectroscopy. Among those sample preparation methods, the modified QuEChERS extraction in combination with liquid chromatography in tandem with mass spectrometric detection was applied to the analysis of residues of 10 sulfonamides in chiken and cattle muscle. In the second study, following the miniaturization trends, it was synthesized a molecularly imprinted polymer (Sulfadimethoxine-MIP), for application as sorbent in Microextraction by Packed Sorbents (MEPS). The extraction method was optimized and successfully applied to chicken muscle samples in combination with highperformance liquid chromatography by ultraviolet-visible detection. Although the use of MIPs as selective packing materials for MEPS has already been reported in two papers, is first time that application of a MIP imprinted with Sulfadimethoxine is evaluated for the extraction of sulfonamides in chicken muscle. Therefore the novelty of the present work is the use of this new miniaturization extraction technique with synthesized sulfadimethoxine-MIP polymer as packing sorbent. The methods were successfully validated according to the 2002/657/EC guidelines.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Química. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Submitted by Rafael Rovatti Pupin null (rafaelpupin@hotmail.com) on 2017-08-29T13:22:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação vs Final_Rafael R Pupin.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A biotina (vitamina B7) pode ser acoplada a diferentes tipos de moléculas e, ainda assim, ser reconhecida seletivamente pelas proteínas avidina e estreptavidina devido à alta constante de afinidade que existe entre elas (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Assim, essa interação proporciona excelente aumento na sensibilidade de várias análises; o que leva ao desenvolvimento métodos analíticos para determinação de diferentes compostos que são biotinilados. O uso de materiais biológicos, como anticorpos ou proteínas, em análises de rotina se torna muitas vezes dispendioso e, devido à baixa estabilidade das biomoléculas em condições adversas às mesmas, iniciou-se a síntese de materiais que possam mimetizar as interações biológicas de reconhecimento; o que vem sendo feito com sucesso pelos polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses polímeros apresentam vantagens em relação às biomoléculas por possuirem baixo custo, fácil preparação e alta resistência mecânica e térmica. Assim, esta dissertação aborda a síntese, caracterização, otimização e aplicação de diferentes MIP que possuem biotina como molécula alvo. Os estudos iniciais focaram na síntese do MIP magnético (MMIP) com acesso restrito (RAMIP) para realizar exclusão proteica pela modificação do polímero com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG). Enquanto o RAMIP recoberto com BSA não apresentou bons resultados nos experimentos, o RAMIP recoberto com PEG, após otimização, apresentou resultados altamente satisfatórios na exclusão proteica (com valores na faixa de 98 até 99,4 % de exclusão) e bons resultados na religação da biotina (2,0 mg de biotina por grama de polímero). A segunda parte do trabalho foi focada no estudo da influência do tipo de impressão molecular (não covalente e semicovalente) na capacidade do reconhecimento seletivo dos MMIP. Para isso, foi sintetizado previamente o complexo analito-monômero (por meio de uma ligação covalente entre a biotina e o álcool alílico como monômero funcional). Esse MMIP foi submetido aos ensaios de reconhecimento da biotina utilizando-se interações não covalente, sendo denominado de MMIP semicovalente; cujos resultados foram comparados com MMIP para biotina não covalente otimizado previamente. O MMIP semicovalente apresentou uma constante de afinidade pela biotina de 5,9×104 L mol-1, enquanto para o MMIP não covalente foi de 2,4×103 L mol-1. Finalmente, o MIP e o MMIP para biotina (sintetizados via não covalente) foram aplicados em ensaios biomiméticos utilizando as técnicas de ELISA e Fluxo Lateral. Nos ensaios ELISA avaliou-se a capacidade de reconhecimento do MMIP pela biotina-HRP e DNA biotinilado (das bactérias E. coli e Salmonella). Para biotina-HRP, o MMIP apresentou retenção (na faixa de 5,0 até 2500 ng mL-1), e uma alta intensidade de sinal. Para o DNA biotinilado, de ambas bactérias, o MMIP mostrou maior retenção do amplicon quando comparado ao NIP. A aplicação do MIP nos dispositivos de Fluxo Lateral é inédita. Assim, após a otimização de todos os parâmetros para desenhar a linha de teste contendo MIP (como solvente, massa, soluções, etc.), avaliou-se a resposta do sistema para diferentes moléculas biotiniladas: para BSA-biotina e o corante Atto 655-biotina os resultados não foram satisfatórios; para biotina-HRP, biotina 4-fluoresceína e os amplicons, MIP apresentou boa resposta no reconhecimento seletivo. Assim, os MIP mostraram-se promissores no desenvolvimento de ensaios biomiméticos. / Biotin (vitamin B7) can be attached with different types of molecules and still be selectively recognized by avidin/streptavidin proteins due to the high affinity constant between them (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Thus, this interaction provides an excellent increase in the sensitivity of analyzes; which leads to the development of analytical methods for the determination of different biotinylated compounds. The use of biological materials, such as antibodies or proteins, in analyzes is often expensive and has low stability of biomolecules under adverse conditions, which has led to the synthesis of materials that can mimic the biological interactions of recognition; which has been successfully made by molecularly printed polymers (MIP). These polymers have advantages over biomolecules because they have low cost, easy preparation and high mechanical and thermal resistance. Thus, this dissertation explores the synthesis, characterization, optimization and application of different MIP that has biotin as the target molecule. Initial studies focused on the synthesis of magnetic MIP (MMIP) with restricted-access (RAMIP) to evaluate protein exclusion by modifying the polymer with bovine serum albumin (BSA) and polyethylene glycol (PEG). While RAMIP coated with BSA didn’t present good results in the experiments, the RAMIP coated with PEG, after optimization, presented highly satisfactory results in protein exclusion (with values ranging from 98 to 99.4% of protein exclusion) and good results in the rebiding of biotin (2.0 mg of biotin per gram of polymer). The second part of the work was focused on the study of influence of molecular imprinting (non-covalent and semi-covalent) on the capacity of the selective recognition of MMIP. For this, the analyte-monomer complex was previously synthesized (by a covalent bond between biotin and allyl alcohol as functional monomer). This MMIP was submitted to the biotin recognition assays using non-covalent interactions, being nominated as semi-covalent MMIP; whose results were compared with non-covalent biotin MMIP previously optimized. The semi-covalent MMIP had an affinity constant for biotin of 5,9×104 L mol-1, while for non-covalent MMIP it was 2,4×103 L mol-1. Finally, MIP and MMIP for biotin (synthesized via non-covalent) were applied in biomimetic assays using ELISA and Lateral Flow techniques. In the ELISA assays, it was evaluated MMIP recognition capacity by biotin-HRP and biotinylated DNA (of E. coli and Salmonella bacteria). For biotin-HRP, MMIP showed good retention results (in the range of 5.0 to 2500 ng mL-1), and good signal intensity. For biotinylated DNA of both bacteria, MMIP showed higher retention of the amplicon when compared to MNIP. The application of MIP in Lateral Flow devices it wasn’t reported before. Thus, after optimizing all the parameters to design the test line containing MIP (as solvent, mass, solutions, etc.), the system's response to different biotinylated molecules was evaluated: for BSA-biotin and Atto 655-biotin dye the results were not satisfactory; for biotin-HRP, biotin 4-fluorescein and the amplicons MIP showed good selective recognition response. Thus, the imprinted polymers are promising materials in the development of biomimetic assays. / FAPESP: 2015/04367-1 / FAPESP: 2016/07250-0

Este trabalho descreve o desenvolvimento de novos métodos cromatográficos em conjunto com técnicas de microextração para determinação de parabenos em produtos cosméticos e leite humano e rifampicina em amostras de plasma. Destaca-se também o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para extração em fase sólida (SPE) de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo I descreve a avaliação da extração sortiva em barra de agitação (SBSE) em conjunto com a cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de parabenos em produtos cosméticos para fins de controle de qualidade. As variáveis do processo de extração SBSE, tais como tempo e temperatura de extração, pH e força iônica da amostra e condições de dessorção foram otimizadas para aumentar a sensibilidade analítica do método e diminuir o tempo de análise. O método SBSE/LC-UV desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (LQ) a 2,50 µg. mg-1 e coeficientes de determinação maiores que 0,993. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 5,0% para todos os parabenos analisados e a exatidão variou de 90 a 100%. O método desenvolvido foi aplicado para análises de amostras de produtos cosméticos comerciais (cremes hidratantes, antitranspirantes em creme e filtros solares). O método SBSE/LC-UV padronizado e validado resultou nas seguintes vantagens em relação aos métodos convencionais: simplicidade no preparo de amostra, redução do volume de solvente orgânico e da quantidade de amostra utilizada. O capítulo II descreve o desenvolvimento da fase extratora molecularmente impressa para SPE de parabenos em amostras de leite humano e análises por cromatografia em fase líquida com detecção espectrofotométrica (SPE/LC-UV). Os polímeros de impressão molecular, materiais sintéticos baseados em sistemas biomiméticos, foram sintetizados através do processo sol-gel tendo como molde, o benzilparabeno. Após a remoção do molde, cavidades seletivas (sítios de reconhecimento molecular) ao benzilparabeno e análogos estruturais foram reveladas. O método SPE/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação a 150 ng. mL-1 e coeficientes de determinação 0,992. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 13% e a exatidão variou de 86 a 117%. A aplicabilidade do método SPE/LC foi demonstrada através das análises de amostras de leite humano de lactantes. Segundo os parâmetros de validação analítica avaliados, o método padronizado SPE/LC-UV é adequado para análises de parabenos em amostras de leite humano. O capítulo III descreve a avaliação da microextraçao em fase sólida no capilar (in-tube SPME) acoplada à cromatografia líquida (LC) com detecção espectrofotométrica (LC-UV) para análises de rifampicina em amostras de plasma para fins de monitorização terapêutica. As variáveis in-tube SPME, tais como fase estacionária da coluna capilar, volume de amostra, ciclos aspirar/dispensar e vazão foram otimizadas visando obter maior eficiência do processo. O método in-tube SPME/LC desenvolvido apresentou faixa linear correspondente ao limite de quantificação (0,1 µg. mL-1) a 100 µg. mL-1 e coeficientes de determinação igual a 0,998. Os valores de coeficiente de variação resultantes das análises de precisão interensaios foram 2% e a exatidão variou de 83 a 92%. A aplicabilidade do método in-tube SPME/LC, padronizado e validado foi comprovada através das análises de amostras de plasma de pacientes em tratamento com rifampicina. O método in-tube SPME/LC resultou na automação do processo de análise, maior precisão analítica, menor tempo de análise, menor volume de solvente orgânico e de fluido biológico. / This work describes the development of chromatographic methods in combination with microextraction techniques for the determination of parabens in cosmetic and human milk samples and of rifampicin in plasma samples. The design of a molecularly imprinted extraction phase for the solid-phase extraction (SPE) analysis of parabens in human milk samples is also reported. Chapter I describes the evaluation of the stir bar sorptive extraction (SBSE) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of parabens in cosmetics aiming at quality control. The SBSE variables such as extraction time, temperature, pH of the matrix, ionic strength, and desorption conditions have been optimized, in order to establish the parabens partition equilibrium in a short analysis time. The linear range of the SBSE/LC method lay from LOQ to 2.5 µg. mg-1, with a coefficient of determination higher than 0.993. The interday precision of the SBSE/LC method presented a coefficient of variation lower than 5%, and the accuracy ranged from 90 to 99%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of commercial cosmetic products such as body creams, antiperspirant creams, and sunscreens has been proven. Therefore, the combination of SBSE with liquid desorption, followed by LC analysis, provides a simple, and selective tool for the analysis of parabens in cosmetic products using minimized volume of organic solvent as well as very small amount of the target sample. Chapter II presents the development of a molecularly imprinted extraction phase for the SPE analysis of parabens in human milk samples. The molecularly imprinted polymers, which are synthetic materials based on biomimetic systems, were synthesized by the sol-gel technology in the presence of the template (benzilparaben). After template removal, selective cavities (benzilparaben) were revealed for parabens selective extraction. The linear range of the SPE/LC method lay from LOQ to 150 ng. mL-1, with a coefficient of determination higher than 0.992. The interday precision of the SPE/LC method presented a coefficient of variation lower than 13%, and the accuracy ranged from 86 to 117%. The effectiveness of the proposed method for the analysis of human milk samples has been demonstrated. According to the evaluated analytical validation parameters, the SPE/LC-UV method is suitable for the analysis of parabens in human milk samples. Chapter III depicts the evaluation of solid-phase microextraction in the capillary (in-tube SPME) in combination with liquid chromatography (LC) with UV detection (LC-UV) for the analysis of rifampicin in plasma samples for therapeutic drug monitoring. The in-tube SPME/LC method was linear over the LOQ (0.1) to 100 g. mL-1 range, with a linear coefficient value (r2) of 0.998. The inter-assay precision presented coefficient of variation 2%, and the accuracy ranged from 83 to 92%. The effectiveness and practicability of the proposed method have been by analysis of plasma samples from ageing patients undergoing therapy with rifampicin. The in-tube SPME/LC method allowed for automated continuous sample preparation (extraction, concentration, desorption, and injection of analytes) and minimized the analysis time as well as the volumes of organic solvent and biological fluid.

As Sulfonamidas (SAs) são antibióticos de uso muito comum na medicina veterinária, sendo também aplicadas na medicina humana. Os resíduos dessas substâncias, ou dos seus metabolitos na carne e outros alimentos, podem causar efeitos adversos para a saúde dos consumidores como, por exemplo, resistências a antibióticos e alergias. Este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos modernos de preparo de amostra para determinação de multiresíduo de sulfonamidas em alimentos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas e ultravioleta visível. Dentre os métodos de preparo de amostra, aplicou-se o método de extração QuEChERS (Quicky, Easy, Cheap. Effective, Rugged, Safe) modificado, em combinação com a cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para a análise de dez sulfonamidas em amostras de músculo de frango e bovino. No segundo estudo, seguindo a tendência de miniaturização, sintetizou-se um polímero molecularmente impresso (Sulfadimetoxina-MIP) para uso como sorbente em dispositivos de Microextração com Sorbentes Empacotado (MEPS). O método, denominado SDM-MIP-MEPS, foi otimizado e aplicado em amostras de músculo de frango usando a cromatografia liquida com detecção por ultravioleta-visivel. Embora o uso do polímero molecularmente impresso (MIP) como sorbente seletivo para o MEPS já tenha sido reportada em dois trabalhos, pela primeira vez é descrito a aplicação de um MIP impresso com sulfdimetoxina (SDM), usando MEPS para extração de sulfonamidas em músculo de frango. Portanto, a novidade neste caso, é o uso da nova técnica extração miniaturizada (MEPS) com o polímero sintetizado sulfadimetoxina-MIP como sorbente de empacotamento. As metodologias foram validadas com sucesso de acordo com as diretrizes 657/2002/EU. / Sulfonamides are widely used in veterinary and human medicine. Residues of these compounds, or their metabolites in animal meats and other foods, are toxic and can cause side effects in human\'s health, such as resistance to antibiotics and allergic reactions. This study describes the development and application of a modern sample preparation approach for sulfonamides multiresidue determination in food by chromatographic methods coupled to mass spectrometry and ultraviolet-visible spectroscopy. Among those sample preparation methods, the modified QuEChERS extraction in combination with liquid chromatography in tandem with mass spectrometric detection was applied to the analysis of residues of 10 sulfonamides in chiken and cattle muscle. In the second study, following the miniaturization trends, it was synthesized a molecularly imprinted polymer (Sulfadimethoxine-MIP), for application as sorbent in Microextraction by Packed Sorbents (MEPS). The extraction method was optimized and successfully applied to chicken muscle samples in combination with highperformance liquid chromatography by ultraviolet-visible detection. Although the use of MIPs as selective packing materials for MEPS has already been reported in two papers, is first time that application of a MIP imprinted with Sulfadimethoxine is evaluated for the extraction of sulfonamides in chicken muscle. Therefore the novelty of the present work is the use of this new miniaturization extraction technique with synthesized sulfadimethoxine-MIP polymer as packing sorbent. The methods were successfully validated according to the 2002/657/EC guidelines.