Orientador: Maria del Pilar Taboada Sotomayor / Resumo: A biotina (vitamina B7) pode ser acoplada a diferentes tipos de moléculas e, ainda assim, ser reconhecida seletivamente pelas proteínas avidina e estreptavidina devido à alta constante de afinidade que existe entre elas (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Assim, essa interação proporciona excelente aumento na sensibilidade de várias análises; o que leva ao desenvolvimento métodos analíticos para determinação de diferentes compostos que são biotinilados. O uso de materiais biológicos, como anticorpos ou proteínas, em análises de rotina se torna muitas vezes dispendioso e, devido à baixa estabilidade das biomoléculas em condições adversas às mesmas, iniciou-se a síntese de materiais que possam mimetizar as interações biológicas de reconhecimento; o que vem sendo feito com sucesso pelos polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses polímeros apresentam vantagens em relação às biomoléculas por possuirem baixo custo, fácil preparação e alta resistência mecânica e térmica. Assim, esta dissertação aborda a síntese, caracterização, otimização e aplicação de diferentes MIP que possuem biotina como molécula alvo. Os estudos iniciais focaram na síntese do MIP magnético (MMIP) com acesso restrito (RAMIP) para realizar exclusão proteica pela modificação do polímero com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG). Enquanto o RAMIP recoberto com BSA não apresentou bons resultados nos experimentos, o RAMIP recoberto com PEG, após otimização, apresentou resultados altamente satisfatórios ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Biotin (vitamin B7) can be attached with different types of molecules and still be selectively recognized by avidin/streptavidin proteins due to the high affinity constant between them (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Thus, this interaction provides an excellent increase in the sensitivity of analyzes; which leads to the development of analytical methods for the determination of different biotinylated compounds. The use of biological materials, such as antibodies or proteins, in analyzes is often expensive and has low stability of biomolecules under adverse conditions, which has led to the synthesis of materials that can mimic the biological interactions of recognition; which has been successfully made by molecularly printed polymers (MIP). These polymers have advantages over biomolecules because they have low cost, easy preparation and high mechanical and thermal resistance. Thus, this dissertation explores the synthesis, characterization, optimization and application of different MIP that has biotin as the target molecule. Initial studies focused on the synthesis of magnetic MIP (MMIP) with restricted-access (RAMIP) to evaluate protein exclusion by modifying the polymer with bovine serum albumin (BSA) and polyethylene glycol (PEG). While RAMIP coated with BSA didn't present good results in the experiments, the RAMIP coated with PEG, after optimization, presented highly satisfactory results in protein exclusion (with values ranging from 98 to 99.4% of protein exclusion) and good res... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

L'avidina i l'estreptavidina són proteïnes tetramèriques molt conegudes degut a la seva elevada constant d'associació (Ka ≈ 1015 M-1 i 2.5 x 1013 M-1 respectivament) al seu lligand natural, la biotina. Aquesta forta unió ha fet possible la utilització del sistema (estrep)avidina-biotina en moltes aplicacions biomèdiques. L'objectiu del present treball ha estat la síntesi de nous lligands d'avidina (Av) i estreptavidina (SAv) i l'estudi de la seva interacció. S'han sintetitzat lligands monovalents d'Av i SAv amb un sistema bicíclic de tipus [3.3.1], tant de tipus propandiurea (PDU), com dimetilpropandiurea (DMPDU) i s'ha demostrat que aquests lligands s'uneixen a les proteïnes Av i SAv. S'ha observat que aquests lligands presenten les següents característiques: - El canvi de sistema bicíclic de DMPDU a PDU es tradueix en un augment de la constant d'associació tant a Av com a SAv. - La introducció d'una cadena lateral de valerat sobre l'àtom de N per a generar l'enantiòmer (+) comporta un augment important de la constant d'associació (Ka) a SAv i Av, tant en el sistema de tipus PDU com en el de tipus DMPDU. En canvi, quan s'introdueix la cadena de valerat sobre el N per a generar l'enantiòmer (-), els canvis en la Ka són molt menors i de signe contrari, és a dir, hi ha un petit increment en el cas de la DMPDU, però una petita disminució en el cas de la PDU quan s'uneix a SAv. En canvi, amb Av es produeix sempre una disminució de Ka.- En els lligands de tipus DMPDU, passar de tenir la cadena de valerat unida del C cap de pont a tenir-la unida al N del grup ureido com a enantiòmer (+), comporta un augment de la Ka, més important en Av que en SAv.- En els lligands amb cadena de valerat unida al N, l'enantiòmer (+) té una major afinitat per Av i SAv que l'enantiòmer (-), tant en els lligands de tipus PDU, com en els de tipus DMPDU.- En el compost DMPDU-C-C4-COOH, la derivatització de la cadena lateral d'àcid carboxílic en forma d'amida afecta poc a la seva Ka a SAv, però fa disminuir bastant la Ka en el cas d'Av.- El compost (+)-PDU-N-C4-COOH és el que presenta major Ka, tant a Av com a SAv, essent inclòs superior a la del compost anàleg derivat del glicoluril (+)-Gril-N-C4-COOH.Per algunes aplicacions pot resultar interessant l'ús de lligands divalents, els quals tenen dues unitats d'un lligand monovalent unides covalentment a través d'un espaiador. La longitud òptima de l'espaiador hauria de ser coneguda per tal d'evitar processos d'oligomerització. En aquest sentit pot resultar útil la utilització de lligands monovalents amb una moderada constant d'associació a Av i SAv, per tal d'obtenir lligands divalents reversibles. Amb aquests lligands es poden mesurar fàcilment les constants d'associació a Av i SAv, donant una indicació de com d'apropiat és l'espaiador per a cada proteïna amb la finalitat de formar el complex intramolecular. Amb aquest objectiu, s'han sintetitzat una sèrie de lligands, i s'ha mesurat la constant d'associació a SAv. La unitat monovalent d'aquests lligands es basa en el sistema bicíclic dimetilpropandiurea, el qual presenta una moderada constant d'associació (Ka = 2.8 x 105 M-1) per SAv. Els braços espaiadors dels lligands divalents eren o bé cadenes alifàtiques o bé cadenes de polièters d'etilenglicol, amb la formació de lligands que presenten una major constant d'associació per SAv que el lligand monovalent de referència.La introducció de l'anell aromàtic a l'espaiador es tradueix en un augment significatiu de la constant d'associació a SAv, com a resultat de la preorganització del lligand divalent. Aquestes diferències han estat inferiors o pràcticament inapreciables per a Av.Finalment s'han explorat noves rutes de síntesis de nous lligands divalents amb una part rígida més extensa que en els lligands anteriors. / ENGLISH VERSION:TITLE OF THE THESIS: "Synthesis of monovalent and divalent semi-rigid ligands of avidin and streptavidin and study of their interaction"SUMMARY: Avidin and streptavidin are tetrameric proteins well-known for their high binding affinity (Ka ≈ 1015 M-1 and 2.5 x 1013 M-1 respectively ) towards biotin, its natural ligand. This strong binding has allowed to use the (strept)avidin-biotin system in many biochemical applications. The aim of the present work was the synthesis of new ligands of avidin and streptavidin and the study of their interaction. New monovalent ligands with a bicyclic framework [3.3.1], of the type propanediurea (PDU) or dimethylpropanediurea (DMPDU) has been synthesized and proved to bind the proteins avidin and streptavidin. For some applications it might be interesting to use divalent ligands, i.e. those having two units of a monovalent ligand covalently linked via a spacer arm. In order to design these divalent ligands, the optimal spacer length should be known, otherwise oligomerization could be placed. More informative could be the use of divalent ligands having two units of a monovalent ligand of moderate binding affinity for avidin and streptavidin. With these reversible ligands it should be possible to easily measure the binding constants of the complexes with avidin and streptavidin, giving an indication of how appropiate a given spacer is for each protein in order to form the intramolecular complex.For this purpose, a series of divalent ligands has been synthesized, and their binding affinity to streptavidin has been measured. The monovalent unit of these divalent ligands is based on the dimethylpropanediurea bicyclic framework, and shows a moderate binding affinity (Ka = 2.8 x 105 M-1) for streptavidin.The spacer arms of the divalent ligands were either aliphatic or polyethers chains derived from ethylene glycol, with the former ligands showing a higher binding affinity for streptavidin than the monovalent ligand of reference. Introduction of an aromatic ring into the spacer arm lead to a significant increase in the binding affinity for streptavidin, as a result of the preorganization of the divalent ligand. These semi-rigid divalent ligands have effective molarities of up to 2.7 M towards streptavidin, which means that they preferentially form of the divalent complex (intramolecular binding) with streptavidin in a broad range of concentrations up to their effective molarity.Several ways for the synthesis of new divalent ligands with a more extended rigid part were explored.

Submitted by Rafael Rovatti Pupin null (rafaelpupin@hotmail.com) on 2017-08-29T13:22:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação vs Final_Rafael R Pupin.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A biotina (vitamina B7) pode ser acoplada a diferentes tipos de moléculas e, ainda assim, ser reconhecida seletivamente pelas proteínas avidina e estreptavidina devido à alta constante de afinidade que existe entre elas (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Assim, essa interação proporciona excelente aumento na sensibilidade de várias análises; o que leva ao desenvolvimento métodos analíticos para determinação de diferentes compostos que são biotinilados. O uso de materiais biológicos, como anticorpos ou proteínas, em análises de rotina se torna muitas vezes dispendioso e, devido à baixa estabilidade das biomoléculas em condições adversas às mesmas, iniciou-se a síntese de materiais que possam mimetizar as interações biológicas de reconhecimento; o que vem sendo feito com sucesso pelos polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses polímeros apresentam vantagens em relação às biomoléculas por possuirem baixo custo, fácil preparação e alta resistência mecânica e térmica. Assim, esta dissertação aborda a síntese, caracterização, otimização e aplicação de diferentes MIP que possuem biotina como molécula alvo. Os estudos iniciais focaram na síntese do MIP magnético (MMIP) com acesso restrito (RAMIP) para realizar exclusão proteica pela modificação do polímero com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG). Enquanto o RAMIP recoberto com BSA não apresentou bons resultados nos experimentos, o RAMIP recoberto com PEG, após otimização, apresentou resultados altamente satisfatórios na exclusão proteica (com valores na faixa de 98 até 99,4 % de exclusão) e bons resultados na religação da biotina (2,0 mg de biotina por grama de polímero). A segunda parte do trabalho foi focada no estudo da influência do tipo de impressão molecular (não covalente e semicovalente) na capacidade do reconhecimento seletivo dos MMIP. Para isso, foi sintetizado previamente o complexo analito-monômero (por meio de uma ligação covalente entre a biotina e o álcool alílico como monômero funcional). Esse MMIP foi submetido aos ensaios de reconhecimento da biotina utilizando-se interações não covalente, sendo denominado de MMIP semicovalente; cujos resultados foram comparados com MMIP para biotina não covalente otimizado previamente. O MMIP semicovalente apresentou uma constante de afinidade pela biotina de 5,9×104 L mol-1, enquanto para o MMIP não covalente foi de 2,4×103 L mol-1. Finalmente, o MIP e o MMIP para biotina (sintetizados via não covalente) foram aplicados em ensaios biomiméticos utilizando as técnicas de ELISA e Fluxo Lateral. Nos ensaios ELISA avaliou-se a capacidade de reconhecimento do MMIP pela biotina-HRP e DNA biotinilado (das bactérias E. coli e Salmonella). Para biotina-HRP, o MMIP apresentou retenção (na faixa de 5,0 até 2500 ng mL-1), e uma alta intensidade de sinal. Para o DNA biotinilado, de ambas bactérias, o MMIP mostrou maior retenção do amplicon quando comparado ao NIP. A aplicação do MIP nos dispositivos de Fluxo Lateral é inédita. Assim, após a otimização de todos os parâmetros para desenhar a linha de teste contendo MIP (como solvente, massa, soluções, etc.), avaliou-se a resposta do sistema para diferentes moléculas biotiniladas: para BSA-biotina e o corante Atto 655-biotina os resultados não foram satisfatórios; para biotina-HRP, biotina 4-fluoresceína e os amplicons, MIP apresentou boa resposta no reconhecimento seletivo. Assim, os MIP mostraram-se promissores no desenvolvimento de ensaios biomiméticos. / Biotin (vitamin B7) can be attached with different types of molecules and still be selectively recognized by avidin/streptavidin proteins due to the high affinity constant between them (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Thus, this interaction provides an excellent increase in the sensitivity of analyzes; which leads to the development of analytical methods for the determination of different biotinylated compounds. The use of biological materials, such as antibodies or proteins, in analyzes is often expensive and has low stability of biomolecules under adverse conditions, which has led to the synthesis of materials that can mimic the biological interactions of recognition; which has been successfully made by molecularly printed polymers (MIP). These polymers have advantages over biomolecules because they have low cost, easy preparation and high mechanical and thermal resistance. Thus, this dissertation explores the synthesis, characterization, optimization and application of different MIP that has biotin as the target molecule. Initial studies focused on the synthesis of magnetic MIP (MMIP) with restricted-access (RAMIP) to evaluate protein exclusion by modifying the polymer with bovine serum albumin (BSA) and polyethylene glycol (PEG). While RAMIP coated with BSA didn’t present good results in the experiments, the RAMIP coated with PEG, after optimization, presented highly satisfactory results in protein exclusion (with values ranging from 98 to 99.4% of protein exclusion) and good results in the rebiding of biotin (2.0 mg of biotin per gram of polymer). The second part of the work was focused on the study of influence of molecular imprinting (non-covalent and semi-covalent) on the capacity of the selective recognition of MMIP. For this, the analyte-monomer complex was previously synthesized (by a covalent bond between biotin and allyl alcohol as functional monomer). This MMIP was submitted to the biotin recognition assays using non-covalent interactions, being nominated as semi-covalent MMIP; whose results were compared with non-covalent biotin MMIP previously optimized. The semi-covalent MMIP had an affinity constant for biotin of 5,9×104 L mol-1, while for non-covalent MMIP it was 2,4×103 L mol-1. Finally, MIP and MMIP for biotin (synthesized via non-covalent) were applied in biomimetic assays using ELISA and Lateral Flow techniques. In the ELISA assays, it was evaluated MMIP recognition capacity by biotin-HRP and biotinylated DNA (of E. coli and Salmonella bacteria). For biotin-HRP, MMIP showed good retention results (in the range of 5.0 to 2500 ng mL-1), and good signal intensity. For biotinylated DNA of both bacteria, MMIP showed higher retention of the amplicon when compared to MNIP. The application of MIP in Lateral Flow devices it wasn’t reported before. Thus, after optimizing all the parameters to design the test line containing MIP (as solvent, mass, solutions, etc.), the system's response to different biotinylated molecules was evaluated: for BSA-biotin and Atto 655-biotin dye the results were not satisfactory; for biotin-HRP, biotin 4-fluorescein and the amplicons MIP showed good selective recognition response. Thus, the imprinted polymers are promising materials in the development of biomimetic assays. / FAPESP: 2015/04367-1 / FAPESP: 2016/07250-0

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T16:45:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DanieleMorgensternAimi.pdf: 5748053 bytes, checksum: d57b44570d4e19a760d7a8379dcc9315 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T16:45:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DanieleMorgensternAimi.pdf: 5748053 bytes, checksum: d57b44570d4e19a760d7a8379dcc9315 (MD5) Previous issue date: 2012-01-09 / The structural and electronic properties of biotin and cysteine molecules interacting with pure, carboxylated and vacancy-type defects carbon nanotubes was evaluated using ab initio simulations. Carbon nanotubes (NTC) have been used for a variety of applications. Among these, we highlight the use of NTC as sensors for biological molecules. Thus, the objective of this work is to use NTC pure carboxylated and defective molecules interacting with biotin and cysteine in the development of nanosensors for these molecules. Our results showed that the interaction between these molecules and the NTC occurs via a physical adsorption with binding energies ranging from 0.22 to 1.91 eV [0.12 to 1.14 eV] for NTC interacting with biotin [cysteine]. For the carboxylated nanostructure higher binding energies are observed. In this way, carboxylated NTC aren’t interesting for interaction with the molecules, because the eventual removal of these NTC had a high energy cost. The physical adsorption between the NTC and the molecules of biotin and cysteine is of great interest for a possible experimental application of NTC as a biological sensor for these molecules. / As propriedades eletrônicas e estruturais das moléculas de biotina e cisteína interagindo com nanotubos de carbono puros, carboxilados e com defeito do tipo vacância foram estudadas fazendo-se uso de simulações computacionais baseadas na Teoria do Funcional da Densidade (DFT). Os nanotubos de carbono (NTC) vem sendo utilizados para uma série de aplicações. Dentre estas, podemos destacar sua utilização como sensores para moléculas biológicas. O objetivo deste trabalho foi utilizar NTC puros, carboxilados e com defeito interagindo com as moléculas de biotina e cisteína no desenvolvimento de nanosensores para estas moléculas. Os resultados mostraram que a interação entre essas moléculas e os NTC ocorre via uma adsorção física, pois não altera as propriedades dos nanotubos, tendo energias de ligação que variam de 0,22 a 1,91 eV para NTC interagindo com a biotina e 0,12 a 1,14 eV para NTC interagindo com a cisteína, sendo que as energias mais altas, são aquelas às quais as moléculas interagem com os NTC carboxilados. Logo, NTC carboxilados não são os mais indicados para a interação com as moléculas, pois a remoção posterior destas do NTC teria um alto custo energético. A adsorção física entre os NTC e as moléculas de biotina e cisteína é de grande interesse para uma possível aplicação experimental destes NTC como sensores biológicos para estas moléculas.

Orientador: Juliano Vilaverde Schmitt / Resumo: Fundamentos: As unhas são anexos cutâneos queratinizados tendo um ritmo de crescimento de até 3 mm/mês nos quirodáctilos. Biotina é vitamina hidrossolúvel de fonte exógena, que provou aumentar a espessura da lâmina ungueal, sob regime de 2,5mg oral por 6-15 meses. O minoxidil tópico 5% 2x/dia, que tem ação comprovada no folículo piloso, foi pouco estudado na velocidade do crescimento ungueal. Não há estudos comparativos com biotina oral, ou de sua associação ao minoxidil tópico. Este estudo objetiva avaliar a eficácia do minoxidil tópico e biotina oral no aumento da velocidade de crescimento das unhas das mãos. Casuística e métodos: Ensaio clínico quasi-experimental com desenho fatorial, aberto e paralelo, envolvendo 37 voluntários adultos saudáveis, alocados em 4 grupos: controle, minoxidil 5% tópico 2x ao dia exclusivo, biotina 2,5mg oral exclusiva e uso combinado, que foram comparados quanto à velocidade do crescimento ungueal do 2o e 4o quirodáctilos, quanto ao status basal, após 14 e 28 dias de tratamento. Todos os indivíduos foram observados, sem intervenções, 14 dias após a inclusão, iniciando o tratamento após esse período, com duração de 28 dias, e reavaliações em 28 e 42 dias após a inclusão no estudo. A idade, sexo, dominância da mão, onicofagia dos pacientes foram levados em conta para comparação da velocidade de crescimento ungueal nos períodos de tratamento e no período sem intervenção, durante todo o estudo. Pré-tratamento, evidenciou-se crescimento basal mais ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background: The nails are keratinized cutaneous attachments, their growth rate reaches up to 3 mm / month in the chirodactyls. Biotin is a water-soluble vitamin from an exogenous source that has been shown to increase the thickness of the nail plate under oral 2.5mg regimen for 6-15 months. Similarly to topical minoxidil 5% 2x / day, with proven action on the hair follicle, which has been poorly studied at the rate of nail growth. There are no comparative studies with oral biotin, or its association with other treatments. This study aims to evaluate the efficacy of topical minoxidil and oral biotin in increasing the growth velocity of fingernails. Methods: Quasi-experimental, factorial, open and parallel clinical trial involving 37 healthy adult volunteers, allocated into 4 groups: control, minoxidil 5% topical 2x daily exclusive, oral 2.5mg exclusive oral and combined use, which were compared for nail growth velocity of the 2nd and 4th chirodactyls, as to basal status, after 14 and 28 days of treatment. All subjects were observed without intervention for 14 days after inclusion, starting treatment after this period, lasting 28 days, and reassessments at 28 and 42 days after inclusion in the study. Patients' age, gender, hand dominance, onychophagy were taken into account when comparing nail growth velocity in the treatment and non-intervention periods throughout the study. Results: Pretreatment showed more pronounced basal growth in the dominant hands and among the onychopha... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_flavia_vasconcellos.pdf: 444073 bytes, checksum: 28496ede24da5ffceb810c4c3dfa434f (MD5) Previous issue date: 2007-04-27 / Leptospirosis is an infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that can affect vital organs such as lungs, liver and kidneys. The illness is characterized by an acute bacteremic phase of approximately one week, followed by an immune phase in which specific antibodies are found in blood and leptospires are eliminated in urine. Clinical signs in the initial phase of leptospirosis can be confused with other feverish diseases, making laboratory diagnosis of extreme importance to start antibiotic treatment. The existing laboratory tests for early diagnosis of leptospirosis are based on IgM detection and are of low sensitivity. Thus, there is an urgent need for development of new diagnostic strategies for use in the acute phase of leptospirosis. In the present work monoclonal antibodies (MAbs) and polyclonal IgY were used in the standardization of three different antigen capture ELISA formats for direct detection of leptospires in blood during the acute phase of the disease. Detection limit of leptospires in human sera experimentally contaminated ranged from 10 5 to 10 7 cells per millilitre in the different formats. The ELISA format with the best performance was able to detect 10 5 leptospires per millilitre of human sera, using as capture antibody a MAb against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic leptospires, and as detection antibody biotinilated policlonal IgY against a pathogenic serovar of Leptospira interrogans. Although this format did not present the adequate sensitivity for detection of circulating leptospires at the levels existing in blood in the initial phase of the disease, it can be improved in order to do so. / A leptospirose é uma doença infecciosa causada por espiroquetas do gênero Leptospira que pode afetar diversos órgãos vitais como pulmões, fígado e rins. A doença caracteriza-se por uma fase inicial bacterêmica de aproximadamente uma semana, seguida de uma fase imune na qual anticorpos específicos são detectados no sangue e leptospiras são eliminadas na urina. Os sinais clínicos da fase inicial da leptospirose podem ser confundidos com diversas doenças febris, o que torna o diagnóstico laboratorial extremamente importante para decidir sobre o início do tratamento com antibióticos. Os testes laboratoriais existentes para o diagnóstico na fase inicial da doença são todos baseados na detecção de IgM e apresentam baixa sensibilidade. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico precoce da leptospirose. Neste trabalho foram utilizados anticorpos monoclonais (MAbs) e anticorpo policlonal (IgY) para padronizar três formatos de ELISA de captura de antígeno para uso na detecção direta de leptospiras no sangue durante a fase aguda da doença. O limite de detecção de leptospiras em soro humano experimentalmente contaminado variou entre 10 5 e 10 7 células por mililitro nos diferentes formatos. O formato que apresentou melhor desempenho detectou 10 5 leptospiras por mililitro de soro, e utilizou como anticorpo de captura um MAb contra LipL32, a principal proteína de membrana externa de leptospiras patogênicas, e como anticorpo de detecção IgY biotinilada, produzida contra um sorovar patogênico de Leptospira interrogans. Embora este formato não apresente ainda a sensibilidade adequada para detectar o nível de leptospiras circulantes no sangue na fase inicial da doença, ele possui potencial para ser aperfeiçoado de forma a atingir aquele nível.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1210492 bytes, checksum: 9b50652b8d6d51ccdb4063535bd8ec12 (MD5) Previous issue date: 2006-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptavidin has been exploited as affinity tag to isolate protein in biotinilated columns. Recombinant Pichia pastoris KM71/Stp strains containing the streptavidin core gene were cultured in fed-batch generating 150 g L-1 biomass. This biomass was achieved with a simpler and shorter process that has never been reported. The yeast was pre-cultured into 50 mL minimum medium with glycerol as only carbon source at 25ºC and 250 rpm. After 12 hours incubation, the culture was transferred to a bioreactor with 200 mL of the same initial A600 0,2. After 24 hours incubation the culture was fed-batch with glycerol and basal salts medium to reach 400 mL. The glycerol concentration of 2.0 moles. L-1 combined with a flow of 0.11 mL. min-1 and aeration by air injection dispersed with a porous stone and magnetic stirring of 500 rpm were the set of conditions to yield maximum biomass. The streptavidin concentration at the supernatant of the free cell culture at 96 hours, the maximum induction period, has achieved 4.0 g. L-1, reducing to 3.2 and 0.87 g. L-1 with two reutilizations. At the same time period the immobilized culture yield 75 %, 50 % and 80% less at the first, second and third culture utilization, respectively. The immobilization and recycling of recombinant P. pastoris biomass can prove to be a potential strategy to improve volumetric productivity. / Com o intuito de utilizar estreptavidina como alvo para isolar proteínas de interesse numa coluna biotinilada, P. pastoris KM71 recombinante contendo o gene do core da estreptavidina, foi cultivada em regime de batelada alimentada na fase de produção de biomassa, alcançando uma concentração de 150 g L-1. Essa biomassa foi alcançada com um novo protocolo, que além de reduzir os passos, introduziu um aparato simples, mas eficiente de dispersão de ar. Um reator com capacidade para 1 L, com 200 mL de meio mínimo com glicerol, foi inoculado com uma pré-cultura para uma A600 inicial de 0,2. Após 24 horas de incubação, a 25 ºC, 500 rpm e injeção e dispersão de ar através de pedra porosa, a alimentação foi iniciada com meio de sais basais e glicerol até atingir um volume de 400 mL. A concentração de 2,0 moles L-1 de glicerol e fluxo de 0,11 mL min-1 utilizados na alimentação, permitiram obter máxima biomassa. Na fase de indução de estreptavidina, foi estudada a reutilização da biomassa na produção de estreptavidina em duas condições: livres em suspensão e imobilizadas em partículas de alginato de cálcio. Em ambos os casos a proteína produzida apresentou-se biologicamente funcional, exibindo ligação esperada à biotina. A concentração de estreptavidina no sobrenadante da cultura de células livres no período de máxima indução (96 horas) atingiu 4,0 g L-1, reduzindo para 3,2 e 0,87 g L-1 respectivamente em duas reutilizações. Quando comparada às concentrações de estreptavidina obtidas pelas células livres em cada utilização, a imobilização resultou na produção de 75% na primeira utilização, 50% na segunda, mas alcançando quase 80% na terceira utilização. A imobilização e a reutilização da biomassa de P. pastoris recombinante ainda não haviam sido reportadas e a produção de estreptavidina nessas condições demonstrou ser uma técnica em potencial.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Contaminação bacteriana que normalmente infecta o endométrio bovino no pós-parto prejudica a defesa imunológica quando há estresse metabólico, levando a endometrite e infertilidade. A resposta do endométrio contra bactérias depende da imunidade inata, com o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos, estimulando a inflamação, caracterizadas por secreção de interleucinas (IL)-1p, IL-6 e IL-8. Entretanto, animais frequentemente falham em eliminar a infecção microbiana quando apresentam reduzidas concentrações de glicose e glutamina, que são fontes de energia para o endométrio no conhecido balanço energético negativo. A contínua inflamação e resposta imune inata contra infecção bacteriana no útero após o parto compromete o bem-estar animal. Neste estudo testou-se a hipótese de que as vias homeostáticas conferidas pela glicose, glutamina e biotina integram o metabolismo energético e a imunidade inata no tecido endometrial bovino. A ausência de glicose reduziu a secreção de IL-1P, IL-6 e IL-8 em culturas de órgãos endometriais desafiadas com a endotoxina lipopolissacarídeo (LPS). Depleção de glutamina também reduziu a atividade inflamatória do endométrio contra LPS. Entretanto, as atividades de glicose e glutamina dependem da presença de glicólise. A vitamina biotina demonstrou ter caráter anti- inflamatório, reduzindo a produção de citocinas pró-inflamatórias no endométrio. Em conclusão, o estresse energético metabólico afetou as respostas inflamatórias à infecções bacterianas no endométrio. Providenciamos dados que demonstram como o balanço energético negativo pode estar ligado a doença uterina no pós-parto. / Bacteria that usually infect the bovine endometrium at postpartum impairs immune defense when exist metabolic stress, leading to endometritis and infertility. The response of the endometrium to bacteria depends on innate immunity, with the recognition of pathogen-associated molecular patterns by stimulating inflammation, characterized by secretion of interleukins (IL) -1p, IL-6 and IL-8. However, animals often fail to eliminate the microbial infection when they have reduced levels of glucose and glutamine, which are sources of energy to the endometrium in the negative energy balance. Continuous inflammation and innate immune response to bacterial infection in the uterus after calving compromise animal welfare. In this study we tested the hypothesis that homeostatic pathways conferred by glucose , glutamine and biotin, link the energy metabolism and innate immunity in the bovine endometrial tissue. The deprivation of glucose reduced the secretion of IL-1P, IL-6 and IL-8 in cultures of endometrial organs challenged with the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Glutamine depletion also reduces the inflammatory activity of the endometrium to LPS. However, glucose and glutamine activities depend on the presence of glycolysis. The vitamin biotin demonstrates anti-inflammatory nature, reducing the production of proinflammatory cytokines in the endometrium. In conclusion, the energy metabolic stress disrupts inflammatory responses to bacterial infections in the endometrium. We provide data on how negative energy balance may be linked to postpartum uterine disease. / Tese (Doutorado)