Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-18T13:31:10Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Afonso Bezerra Ribeiro.pdf: 2755836 bytes, checksum: 9328d5ba556fe7eb6eb229cb1cd9ecdc (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-19T15:50:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Afonso Bezerra Ribeiro.pdf: 2755836 bytes, checksum: 9328d5ba556fe7eb6eb229cb1cd9ecdc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T15:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Afonso Bezerra Ribeiro.pdf: 2755836 bytes, checksum: 9328d5ba556fe7eb6eb229cb1cd9ecdc (MD5) Previous issue date: 2014-09-22 / A hanseníase é uma doença infecto contagiosa, endêmica, de evolução crônica, granulomatosa causada pelo M. leprae, que representa um grave problema de saúde pública no Brasil e em vários países do mundo. O objetivo deste estudo foi analisar as populações de neutrófilos, monócitos, células T CD4+, T CD8+ e T regulatórias no sangue periférico de pacientes com hanseníase nas formas clínicas multibacilar e paucibacilar bem como a expressão da proteína anti-inflamatória ANXA1 e os níveis de IL-10. A quantificação de leucócitos no sangue periférico dos pacientes com hanseníase e seus controles (indivíduos sadios sem histórico clínico de infecção – controle negativo; e paciente com tuberculose – controle positivo) foi realizada através da contagem em câmara hemocitométrica de Neubauer e diferencial em esfregaço sanguíneo. A determinação do fenótipo das células T CD4+, TCD8+ e Treg foi realizada através de imunofluorescência. A expressão da ANXA1 e os níveis de IL-10 nos leucócitos e plasma forma através das técnicas de imunofluorescência e ELISA. Os resultados foram analisados através da análise de variância (One-way ANOVA) com pós teste de Bonferroni. As associações entre dados não paramétricos foram analisadas por regressão linear e pelo coeficiente de correlação do teste de Spearman. Os resultados demonstraram queos leucócitos totais nos pacientes MB (22,93 x 106 ± 0,37 cel/mL) e PB (26,58 x 106 ± 1,12 cel/mL) apresentaram um aumento significativo do número de células quando comparado ao grupo CS (6,43 x 106 ± 0,74 cel/mL). Já grupo PB apresentou um aumento significativo também em relação ao grupo CP (21,45 x 106 ± 0,38 cel/mL). A população de monócitos nos pacientes MB estava aumentada (1,45 x 106 ± 0,28 cel/mL) quando comparados ao grupo CS (0,59 x 106 ± 0,70 cel/mL) e CP (0,70 x 106± 0,17 cel/mL). O grupo dos PB (0,23 x 106 ± 0,04 cel/mL) quando comparado ao grupo CS e CP não apresentou um aumento significativo entre os grupos. Já os neutrófilos dos pacientes MB (14,04 x 106 ± 0,53 cel/mL) quanto dos PB (14,28 x 106 ± 0,22 cel/mL) apresentaram aumento significativo em relação aos CS (3,42 x 106 ± 0,36 cel/mL) e CP (1,21 x 106 ± 0,06 cel/mL). Nas células T CD4+, foi observado um aumento nas formas clínicas MB (1,99 x 106 ± 0,29 cel/mL) e PB (1,89 x 106 ± 0,18 cel/mL) comparado aos controles sadio e positivo. Em relação as células T CD8+ , o número desse leucócito foi mais expressivo na forma MB (1,14 x 106 ± 0,10 cel/mL), do que o grupo CS (0,62 x 106 ± 0,05 cel/mL), enquanto que o grupo PB (0,28 x 106 ± 0,02 cel/mL) apresentou redução em relação ao grupo CS. Na população de células Treg, a forma clínica MB (1,85 x 106 ± 0,27) apresentou maior número quando comparado ao grupo CS (0,56 x 106 ± 0,07 cel/mL) e CP (0,30 x106 ± 0,02 cel/mL). O grupo PB (0,29 x 106± 0,03 cel/mL) não apresentou aumentou significativo quando comparado ao grupo CS e CP. A ANXA1 apresentou redução em leucócitos circulantes nos pacientes PB e MB, porém apresentou altos níveis liberada no plasma, sendo que os pacientes multibacilares apresentaram níveis superiores aos paucibacilares. Por se tratar de uma molécula reguladora da inflamação, sua ação parácrina poderia estar potencializando a ação anti-migratória e inibindo a ação pró-inflamatória nos leucócitos circulantes na infecção induzida por M. leprae, principalmente nos pacientes multibacilares. Nenhuma correlação foi observada entre a expressão da anexina-A1 e os níveis de IL-10 nos pacientes com hanseníase, indicando que essa proteína não está envolvida no mecanismo de indução de produção dessa citocina nos leucócitos circulantes. / Leprosy is endemic, infectious disease of chronic evolution, granulomatous caused by M. leprae, which represents a serious public health problem in Brazil and in countries around the world. The aim of this study was to analyze the populations of neutrophils, monocytes, TCD4+ cells, TCD8+ and T regulatory peripheral blood of patients with leprosy in multibacillary clinical and paucibacillary forms as well as the expression of anti-inflammatory ANXA1 protein and the levels of IL -10. Quantification of leukocytes in peripheral blood of leprosy patients and controls (healthy individuals without clinical history of infection - negative control, and patient with tuberculosis - positive control) was performed by hemocytometer Neubauer chamber counting and differential blood smear. The determination of the phenotype of TCD4+, TCD8+ and Treg cells was performed by immunofluorescence. The expression of ANXA1 and IL-10 levels in plasma and leukocytes by way of immunofluorescence and ELISA. The results were analyzed by analysis of variance (One-way ANOVA) with Bonferroni post test. The associations between non-parametric data were analyzed by linear regression and the correlation coefficient of Spearman. The results showed that the total leukocytes in patients MB (22.93 ± 0.37 x 106 cells / ml) and BP (26.58 ± 1.12 x 106 cells / ml) showed a significant increase in cell number when compared the CS group (6.43 ± 0.74 x 106 cells / mL). The CP group showed a significant increase also in relation to the CP group (21.45 ± 0.38 x 106 cells / ml). The population of monocytes in MB patients was increased (1.45 ± 0.28 x 106 cells / mL) compared to the CS group (0.59 ± 0.70 x 106 cells / mL) and CP (0.70 x 106 ± 0.17 cells / mL). The group of PB (0.23 x 0.04 ± 106 cells / mL) compared to CS and CP group did not show a significant increase between the groups. Neutrophils of MB patients (14.04 ± 0.53 x 106 cells / mL) and the PB (14.28 ± 0.22 x 106 cells / mL) showed a significant increase from the CS (3.42 x 106 ± 0.36 cell / ml) and CP (1.21 ± 0.06 x 106 cells / ml). TCD4+ cells, an increase was observed in clinical forms MB (1.99 ± 0.29 x 106 cells / ml) and BP (1.89 ± 0.18 x 106 cells / ml) compared to healthy, positive controls. Regarding the TCD8+ cells, the number of leukocytes was more significant in MB (1.14 x 0.10 ± 106 cells / mL) than the CS group (0.62 ± 0.05 x 106 cells / mL ), while the PB group (0.28 ± 0.02 x 106 cells / mL) decreased compared to the CS group. In the population of Treg cells, the clinical form MB (1.85 x 106 ± 0.27) had a higher number compared to the CS group (0.56 ± 0.07 x 106 cells / mL) and CP (0.30 x106 ± 0.02 cells / mL). The CP group (0.29 ± 0.03 x 106 cells / mL) had not increased significantly when compared to the CS group and CP. The ANXA1 decreased in circulating leukocytes in patients PB and MB, but showed high levels released into the plasma, and the multibacillary patients had levels above the paucibacillary. Being a regulatory molecule of inflammation, its paracrine action might be enhancing the anti-migratory action and inhibiting pro-inflammatory action in circulating leukocytes in infection induced by M. leprae, particularly in MB patients. No correlation was observed between the expression of annexin-A1 and IL-10 levels in patients with leprosy, indicating that this protein is not involved in the production of this cytokine induction mechanism in circulating leukocytes.

β2-glicoproteína I (β2GPI) é encontrada (200µg/mL) no plasma, 60% livre e 40% em lipoproteínas. Esta proteína de fase aguda, com afinidade por superfícies negativas pode ser clivada pela plasmina. Fragmentos são purificados como dímeros ou multímeros de β2GPI. Formas monomérica e dimérica de β2GPI foram purificadas de soro humano e identificadas por SDS-PAGE, imunoblot e ELISA Somente a forma monomérica foi detectada no teste ELISA Os efeitos de ambas as formas sobre o burst respiratório de polimorfonucleares humanos (PMN), estimulados in vitro com zymosan opsonizado, foram estudados por quimioluminescência amplificada por luminol ou lucigenina e citometria de fluxo, pela oxidação do OCFH. A forma monomérica inibiu a quimioluminescência amplificada por luminol (-43.6 x -7.33 AEU/s), mas não por lucigenina, e aumentou a oxidação de DCFH e a produção de Óxido Nítrico (•NO). É provável que o •No, via peroxinitrito, medeie os efeitos de β2GPI sobre o burst respiratório de PMN. / Circulating blood contains approximately 200µg/mL of β 2-glycoprotein I (β2GPI), either free (60%) or lipoprotein bound (40%). This acute phase protein, with affinity for negative surfaces, can be cleaved by plasmin. Fragments purify as dimeric or multimeric (β2GPI. Both (β2GPI forms were purified from human sera and identified by SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA. ELISA reactivity was dependent on the monomeric status of (β2GPI. The effects of dimeric and monomeric (β2GPI upon respiratory burst of human polimorphonuclear neutrophils (PMN) stimulated in vitro with opsonized zymosan were studied. Respiratory burst was evaluated by luminol- or lucigenin-amplified chemiluminescence, or by DCFH oxidation (flow-cytometry assay). The monomeric, but not the dimeric form, inhibited the luminol chemiluminescence of zymosan-stimulated PMNs (-43.6 x -7.33 AEU/s). Lucigenin chemiluminescence was insensitive to (β2-GPI. Monomeric (β2GPI increases both DCFH oxidation and nitric oxide production. Nitric oxide, probably through peroxynitrite reactions, mediates (β2GPI effects upon PMNs respiratory burst.

β2-glicoproteína I (β2GPI) é encontrada (200µg/mL) no plasma, 60% livre e 40% em lipoproteínas. Esta proteína de fase aguda, com afinidade por superfícies negativas pode ser clivada pela plasmina. Fragmentos são purificados como dímeros ou multímeros de β2GPI. Formas monomérica e dimérica de β2GPI foram purificadas de soro humano e identificadas por SDS-PAGE, imunoblot e ELISA Somente a forma monomérica foi detectada no teste ELISA Os efeitos de ambas as formas sobre o burst respiratório de polimorfonucleares humanos (PMN), estimulados in vitro com zymosan opsonizado, foram estudados por quimioluminescência amplificada por luminol ou lucigenina e citometria de fluxo, pela oxidação do OCFH. A forma monomérica inibiu a quimioluminescência amplificada por luminol (-43.6 x -7.33 AEU/s), mas não por lucigenina, e aumentou a oxidação de DCFH e a produção de Óxido Nítrico (•NO). É provável que o •No, via peroxinitrito, medeie os efeitos de β2GPI sobre o burst respiratório de PMN. / Circulating blood contains approximately 200µg/mL of β 2-glycoprotein I (β2GPI), either free (60%) or lipoprotein bound (40%). This acute phase protein, with affinity for negative surfaces, can be cleaved by plasmin. Fragments purify as dimeric or multimeric (β2GPI. Both (β2GPI forms were purified from human sera and identified by SDS-PAGE, immunoblotting and ELISA. ELISA reactivity was dependent on the monomeric status of (β2GPI. The effects of dimeric and monomeric (β2GPI upon respiratory burst of human polimorphonuclear neutrophils (PMN) stimulated in vitro with opsonized zymosan were studied. Respiratory burst was evaluated by luminol- or lucigenin-amplified chemiluminescence, or by DCFH oxidation (flow-cytometry assay). The monomeric, but not the dimeric form, inhibited the luminol chemiluminescence of zymosan-stimulated PMNs (-43.6 x -7.33 AEU/s). Lucigenin chemiluminescence was insensitive to (β2-GPI. Monomeric (β2GPI increases both DCFH oxidation and nitric oxide production. Nitric oxide, probably through peroxynitrite reactions, mediates (β2GPI effects upon PMNs respiratory burst.