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La polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (FAP-TTR) est une maladie rare héréditaire à transmission autosomique dominante liée à la production de formes mutantes de la transthyrétine (TTR). Ces mutations sont à l’origine d’un changement de conformation de la protéine qui, in vivo, se présente sous forme de tétramère. Celui-ci est alors déstabilisé et évolue vers la formation de fibrilles amyloïdes qui s'accumulent au niveau du système nerveux autonome, des nerfs périphériques et des organes. Ces dépôts sont responsables de la pathologie. Dans le but d’évaluer l’efficacité des thérapies pouvant être mises en œuvre, nous avons développé des stratégies analytiques visant à concevoir un système « point of care » à usage hospitalier permettant de quantifier les formes mutante et native circulantes de la TTR. La méthodologie développée consiste à réaliser la séparation électrocinétique de fragments ciblés de la TTR, obtenus par digestion enzymatique de la protéine. Cette approche analytique a été développée en se focalisant sur une mutation fréquente en France : la TTR Thr49Ala où une thréonine est remplacée par une alanine en position 49. Au cours de cette thèse, deux types de microréacteurs enzymatiques ont été étudiés, i.e. (i) un lit fluidisé contenant des particules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de trypsine et (ii) une puce monolithique à base de thiol-ène fonctionnalisée également par la trypsine. Le pouvoir catalytique de ces microsystèmes a été comparé en mesurant l’efficacité de digestion du BApNA (substrat modèle) et de la TTR à l’aide de méthodes analytiques telles que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection UV (EC-UV) et la chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de masse (UHPLC-SM). Les résultats obtenus ont montré que le microréacteur enzymatique monolithique à base de thiol-ène était le plus performant pour digérer la TTR. Par ailleurs, nous avons réalisé, au cours de cette étude, l’optimisation d’une méthode EC-UV, adaptée à l’analyse des digestats recueillis en sortie de microréacteur. Elle a permis de séparer et de quantifier les peptides d’intérêt pour déterminer le rapport de TTR mutante (Thr49Ala) sur TTR native. / Transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP) is a hereditary rare disease with an autosomal dominant transmission, related to the production of mutant forms of transthyretin (TTR). These mutations lead to a conformational change of the protein whose in vivo form is a tetramer. As a consequence, this tetramer is destabilized and evolves towards the formation of amyloid fibrils that aggregate on the autonomic nervous system, peripheral nerves, and organs. These deposits are responsible for the pathology. In order to evaluate the efficiency of possible therapies, we developed analytical strategies aiming at designing a “point of care” system for hospital use, which would enable the quantification of circulating mutant and native forms of TTR. The methodology that we developed consists in undertaking the electrokinetic separation of targeted TTR fragments obtained through the enzymatic digestion of the protein. This analytical approach has been developed while focusing on a frequent mutation in France: the TTR Thr49Ala mutation in which a threonine is substituted by an alanine in position 49. In this thesis, two types of enzymatic microreactors have been studied, i.e. (i) a fluidized bed containing magnetic particles functionalized by trypsin molecules and (ii) a thiol-ene-based monolithic chip also functionalized by trypsin. The catalytic power of these microsystems has been compared by measuring the digestion efficiency of BApNA (model substrate) and TTR through analytical methods such as UV-visible absorption spectrophotometry, capillary electrophoresis with UV detection (CE-UV), and liquid chromatography with mass spectrometry detection (UHPLC-MS). The results showed that the thiol-ene-based monolithic enzymatic microreactor was the most efficient system to digest TTR. Besides, during this study, we undertook the optimization of a CE-UV method which is adapted to the analysis of digested sample collected directly out of the microreactor. This allowed us to isolate and quantify the peptides of interest to measure the ratio of mutant TTR (Thr49Ala) versus the wild one.

Diabetiker entwickeln nach durchschnittlich 10 Jahren Folgeschäden. Die Polyneuropathie mit nachfolgender Osteoarthropathie des Fußes ist eine meist zu spät erkannte und suboptimal versorgte Komplikation. Nicht rechtzeitig erkannte Schäden führen zu Ulcera, sekundären Infektionen, Osteomyelitiden und Amputationen. Fragestellung: Ist eine Ganganalyse incl. Posturographie in der Lage, eine evtl. bestehende Polyneuropathie zu verifizieren, um eine frühzeitige orthopädische Schuhversorgung vornehmen zu können? Material und Methoden: Es wurden Diabetiker (n = 73) mit (mittels Messung der Nervenleitgeschwindigkeit NLG) nachgewiesener Neuropathie und eine gesunde Vergleichsgruppe (n = 38) ohne Neuropathie am Ganganalysesystem GANGAS untersucht. Ergebnisse: Die Allgemeinparameter relative Geschwindigkeit, Schrittlänge und Kadenz, sowie die Belastungsparameter Fersen-, Mittelfuß-, Vorfußbelastung und Belastung beim Auftritt und Abstoß zeigten keine wesentlich signifikanten Unterschiede im Gruppenvergleich. Dagegen zeigte die Posturographie (apparative Untersuchung der Schwankung des Druckschwerpunktes beim Romberg-Test, welche durch die Länge und Geschwindigkeit beschrieben wurde) signifikante Unterschiede zwischen beiden Patientengruppen. So lag z.B. der Median der Weglänge des Druckschwerpunktes beim Test mit geschlossenen Augen bei den Diabetikern bei 21,27 cm und in der Vergleichsgruppe bei 15,4 cm (p = 0,007). Die Bewegungsgeschwindigkeit des Druckschwerpunktes beim Test mit geschlossenen Augen betrug im Median 1,33 cm/sec bei den Diabetikern und 0,96 cm/sec in der gesunden Vergleichsgruppe (p = 0,006). Beim Test mit offenen Augen ergab sich kein signifikanter Unterschied im Gruppenvergleich. Klinische Relevanz: Eine Instabilität des Ganges der Patienten mit diabetischer Neuropathie und entsprechenden Folgeschäden des Fußes läßt sich durch die Ganganalyse mit Standardparametern nach vorliegendem Datenmaterial nicht nachweisen. Die Posturographie ist eine einfache, zeitlich mit geringem Aufwand verbundene Methode, die mit statistischer Signifikanz die subjektiven Kriterien der klinisch-orthopädischen Frühdiagnostik sinnvoll ergänzen und damit die Verdachtsdiagnose eine diabetischen Fußes objektiv nachweisen kann, bevor bleibende Schäden am Fuß entstanden sind. / Every diabetic patient after about ten years develops secondary changes in different tissues. Polyneuropathy with consecutive osteoarthropathy of the foot often is recognized too late and suboptimal treated. Diabetic disorders recognized too late may lead to ulcera, secondery infections and even amputations. Question: Is standard gait analysis including posturography able to verify diabetic neuropathy in order to supply the patient with adapted orthopadic shoeware in time? Materials and methods: A group of diabetics (n=73) with proved neuropathy by measuring nerve conduction velocity and a healthy control group (n=38) without neuropathy were examined by the gait-analysis-system GANGAS. Results: The general parameters: relative speed, length of step and cadence as well as the loading parameters of the heel, middle foot and forefoot during treading and repulsion show no significant differences between both groups. Posturography however (apparative examination of the elongation of focal point of pressure (FPP) according to the Romberg test, described by length and speed) shows significant differences between both groups. For diabetics making the test with closed eyes the mean value of walking length of the FPP was 21,27 cm, for the healthy control persons it was only 15,4 cm (p = 0,007). Asimulary results were found for the speed of movement of FPP during the test with closed eyes: mean value in diabetics 1,33 cm/s and for the healthy control persons 0,96 cm/s (p = 0,006). During this test with open eyes there was no significant difference between both groups. Clinical Relevance: Walking instability of patients with diabetic neuropathy and corresponding sequential damage of the foot could not be proved by the current data with standard parameters. Posturography however is able to give additional information with statistical significance to the subjective criteria of the clinical-orthopedic early diagnosis and verify the diagnosis of a beginning diabetic foot before severe disorders have occured.

La polyneuropathie sensitivomotrice héréditaire (PNSMH) est une maladie rare qui entraîne un ralentissement du développement moteur et mental, une déficience sensitivomotrice et des syndromes neuropsychiatriques, et qui s’accompagne souvent d’une agénésie du corps calleux. Par ailleurs, plusieurs évaluations rapportent une petite stature ou une masse corporelle anormalement basse chez les patients. La PNSMH est causée par des mutations perte de fonction du cotransporteur K⁺-Cl⁻ de type 3 (KCC3). Des évaluations cliniques détaillées et la caractérisation de souris inactivées pour Kcc3 (Kcc3ᴷᴼ) ont permis d’établir qu’un défaut d’export K⁺-Cl⁻ cause les atteintes neurologiques anatomiques et fonctionnelles dans la maladie. Chez les souris Kcc3ᴷᴼ, des manifestations extraneurologiques ont également été relevées : masse corporelle réduite, pression artérielle (PA) élevée, polydipsie et polyurie. Puisque la physiopathologie des désordres extraneurologiques découlant de la perte de fonction de KCC3 reste incomplètement décrite, mes travaux avaient pour objectif d’en comprendre les mécanismes sous-jacents en utilisant un modèle Kcc3ᴷᴼ. Une caractérisation initiale de notre lignée de souris Kcc3ᴷᴼ constitutive et systémique a montré des anomalies vasculaires et cardiaques accompagnant une élévation de PA diastolique. Cette lignée affichait également une polydipsie et une polyurie isoosmotique, de même qu’une réduction de masse corporelle et d’adiposité sans réduction d’apport alimentaire. Une caractérisation métabolique détaillée de notre modèle a ensuite permis de révéler des réductions de masse grasse et de masse maigre. Cette minceur résulte sûrement en partie des augmentations d’activité locomotrice et de dépense énergétique mesurées. Une nette amélioration de la tolérance au glucose a aussi été trouvée, ainsi que des concentrations réduites de triacylglycérols plasmatiques. Enfin, nous avons noté que notre modèle est résistant à l’obésité induite par une diète hyperlipidique et affiche une élévation concomitante de l’expression d’enzymes lipogéniques et lipolytiques dans le gras viscéral, engendrant potentiellement une dissipation calorique. En revisitant la fonction cardiovasculaire dans notre modèle par des méthodes de pointe, nous n’avons pas observé de changement de PA ni de différence de réactivité artériolaire en conditions basales, mais nous avons noté une élévation de distensibilité artériolaire passive. Chez notre modèle, nous n’avons pas non plus remarqué de sensibilité particulière de la PA au sel alimentaire, mais une excrétion urinaire fortement accrue de solutés sous diète hypersodée ainsi qu’une préférence marquée pour le sel. Ces observations sont compatibles avec un défaut de réabsorption hydrosodée par le rein pouvant d’ailleurs prévenir les élévations de PA. En somme, nos travaux ont permis de mieux comprendre les atteintes cardiométaboliques qui accompagnent le tableau neurologique d’un modèle murin de PNSMH. Nous avons notamment relevé des bénéfices inattendus dans le métabolisme glucidique et lipidique suivant l’inactivation de Kcc3. Nous soupçonnons également que l’absence de KCC3 dans le rein engendre une fuite ionique urinaire s’accentuant sous diète hypersodée et pouvant influencer la PA en limitant l’expansion volémique. Nos observations d’anomalies pléiotropiques liées à l’inactivation de Kcc3 font de ce gène une nouvelle cible pharmacologique potentielle et justifient la nécessité d’étudier l’anatomophysiologie cardiométabolique des patients atteints de PNSMH de façon plus approfondie. / Hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) is a rare disease that leads to delayed motor and mental development, loss of sensory and motor function and neuropsychiatric syndromes, and that is often accompanied by partial or complete agenesis of the corpus callosum. Additionally, several cases of short stature or low body weight have been reported in patients. HMSN is caused by loss-of-function mutations in K⁺-Cl⁻ cotransporter type 3 (KCC3). Detailed clinical reports and characterizations of mice inactivated for Kcc3 (Kcc3ᴷᴼ) have allowed to establish that defective K⁺-Cl⁻ export causes the anatomical and functional neurologic impairments in the disease. In Kcc3ᴷᴼ mice, extra-neurological abnormalities have also been noted: lower body weight, high blood pressure (BP), polydipsia and polyuria. Because the pathophysiology of extra-neurological traits arising from KCC3 loss of function remains incompletely described, my work aimed at understanding the mechanisms at play using a Kcc3ᴷᴼ model. An initial characterization of a constitutive and systemic Kcc3ᴷᴼ mouse line showed vascular and cardiac abnormalities along with a rise in diastolic BP. This model also showed polydipsia and iso-osmolar polyuria along with reduced body weight and adiposity but no decrease in food intake. A detailed metabolic characterization of our model further revealed reductions in fat and lean body masses. This leanness results certainly in part from increased locomotor activity and energy expenditure as measured. A marked improvement in glucose tolerance was also found in addition to lower plasmatic triglyceride concentrations. Lastly, we also demonstrated that our model is resistant to high-fat-diet-induced obesity and shows concomitant increase in expression of both lipogenic and lipolytic enzymes in visceral fat, thereby potentially generating caloric dissipation. When revisiting the cardiovascular function of our model with cutting-edge methods, we measured normal BP and arteriolar reactivity in baseline conditions. However, we noted an increase in passive arteriolar distensibility. In our model, we did not notice sensitivity of BP to dietary salt but found a marked increase in urinary solute excretion under high-salt diet and a strong preference for salt. These observations are consistent with a defect in hydromineral reabsorption by the nephron that may prevent BP from rising. In short, our work allowed to better understand the cardiometabolic characteristics that accompany the neurologic portrait of an HMSN mouse model. In particular, we noted unexpected benefits in carbohydrate and lipid metabolism upon Kcc3 inactivation. We also suspect that KCC3 ablation in the kidney leads to urinary hydromineral wasting that can be more salient under dietary salt loading and can influence BP by blunting extracellular volume expansion. The pleiotropic abnormalities arising from Kcc3 inactivation identify this gene as a new potential pharmacological target and argue for improving efforts at describing the cardiometabolic features of patients with HMSN.