Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob der Neurotransmitter Neuropeptid Y (NPY) Einfluss auf das Schwellungsverhalten retinaler Gliazellen der Ratte in hypoosmolarem Medium hat. Des Weiteren war von besonderem Interesse, welche Rezeptortypen und welche intrazellulären Signalwege in die Wirkung von NPY involviert sein könnten. Verwendet wurden 50 adulte Long-Evants-Ratten. Zuerst wurde bei einem Teil der Ratten eine transiente retinale Ischämie in einem Auge der Ratten induziert. Das andere Auge blieb unbehandelt und diente zur Kontrolle. Drei Tage post op wurden die Ratten euthanasiert. Nach Enukleation der Bulbi wurde die Netzhaut auf einen Membranfilter aufgebracht und Schnitte (1 mm) angefertigt. Um die Müllerzellen der vitalen Retina mit Hilfe des Laser Scanning-Mikroskops darstellen zu können, wurde der Farbstoff Mitotracker Orange verwendet (UCKERMANN et al. 2004). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Müllerzellen der postischämischen Retina der Ratte in hypotonem Medium schwellen (PANNICKE et al. 2004). Dazu wurden die akut isolierten retinalen Schnitte einer hypotonen Lösung ausgesetzt (60 % der Kontrollosmolarität). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass NPY die Müllerzellschwellung in hypotonem Medium in der postischämischen Netzhaut verhindert. Die pharmakologische Untersuchung des durch NPY aktivierten Signalweges erfolgte an gesunden Netzhäuten. Hier führt ein hypotones Medium bei gleichzeitiger Blockade der Kaliumkanäle (K+-Kanäle) durch Ba2+ zu einer Gliazellschwellung, die mit derjenigen in der postischämischen Retina vergleichbar ist (PANNICKE et al. 2004). NPY hemmt konzentrationsabhängig das Schwellen der Gliazellen der gesunden Netzhaut in hypoosmolarem Medium in Anwesenheit von Ba2+. Die gleiche Wirkung konnte mit dem selektiven Y1-Rezeptoragonisten hervorgerufen werden, während die Y2- und Y5-Rezeptoragonisten keine Wirkung zeigten. Außerdem hatte NPY in der Anwesenheit des selektiven Y1-Rezeptoragonisten BIBP3226 keine Wirkung. Inkubation mit dem membranpermeablen Ca2+-Chelator BAPTA-AM kehrte die Wirkung des NPY um, ebenso wie die Inkubation mit den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren Staurosporin und Gö6976. Die Neurotransmitter Glutamat und Adenosin zeigten eine dem NPY vergleichbare hemmende Wirkung auf das Schwellen der Müllerzellsomata. Außerdem konnte eine Stimulierung von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGlu) und Adenosin A1-Rezeptoren (A1R) nachgewiesen werden. Jedoch hob der selektiven Na+-Kanalblocker Tetrodotoxin die hemmende Wirkung von NPY auf. Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass NPY einen neuronalen Y1-Rezeptor aktiviert, was zu einer Mobilisierung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern und zur Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) führt. Weiterhin erfolgt eine von neuronaler Aktivität und Ca2+ abhängige Freisetzung von Glutamat und die Aktivierung von (glialen) mGlu. Letztendlich kommt es vermutlich zur Aktivierung des A1R. Resümierend könnten diese Ergebnisse wichtig sein für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Vermeidung von postischämischen und posttraumatischen Gliazellschwellungen. / The aim of the present study was to determine wether neuropeptide Y (NPY) has an effect on hypotonic glia cell swelling from the retina of the rat. Furthermore, the special interest was to determine which receptor subtypes and which intracellular pathways are involved in the effect of NPY. 50 adult Long-Evants-rats were taken. Transient retinal ischemia was induced in one eye of the rats, while the other eye remained untreated and served as control. Three days after reperfusion, the animals were killed. After enucleation of the bulbi, the isolated retina was fixed on a membrane filter and 1 mm thick slices were produced. The acutely isolated slices were loaded with the vital dye Mitotracker Orange in order to selectively stain Müller glial cells (UCKERMANN et al. 2004). The slices were examined using a confocal laser scanning microscope. As shown recently (PANNICKE et al. 2004), the somata in postischemic retinas corresponded with swelling after changing the extracellular perfusate into a hypotonic solution which contained 60 % of the control ionic strength. NPY significantly decreased the hypotonic glia cell swelling in postischemic retinas. The following experiments for the pharmacological examination of the NPY pathway where made with untreated rats. Cell somata in control retinas showed an increase of their volume during hypotonic stress when the K+-channel blocker Ba2+ was present in the extracellular solution; this swelling is comparable with the swelling of glia cells in postischemic retina (PANNICKE et al. 2004). Cell somata in control retinas showed an increase of their volume during hypotonic stress when the K+-channel blocker Ba2+ was present in the extracellular solution (PANNICKE et al. 2004). NPY significantly decreased the hypotonic glia cell swelling in control retinas in the presence of Ba2+. NPY displayed a dose-dependent swelling effect. The Y1-receptor agonist inhibited dose-dependently the hypotonic glial cell swelling, while agonists for Y2- and Y5-receptors were largely ineffective. Incubation with the membrane permeable Ca2+-chelator BAPTA-AM reversed the swelling inhibiting effect of NPY, just as incubation with PKC-inhibitors staurosporine and Gö6976 did. A dependence of the NPY effect on release of Ca2+ from intracellular stores is also suggested by the effect of thimerosal. Glutamate and adenosine also decreased the hypotonic glia cell swelling in control retinas in the presence of Ba2+. In addition, glutamate stimulates metabotropic glutamte receptors (mGluR) and adenosin activates purinergic receptors. However, the selective Na+-canal blocker tetrodotoxin (TTX) reversed the inhibiting effect of NPY on swelling, but not of glutamate and adenosine. The data suggest that NPY inhibits hypotonic glia cell swelling by activation of neuronal Y1-receptors via Ca2+-dependent release of glutamate. This effect is mediated by subsequent stimulation of glial glutamergic and purinergic receptors in Müller cells. The results may have importance for the development of new therapeutic strategies for inhibition of postischemic and posttraumatic glial cell swelling.

Suite à une ischémie, de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires concourent pour promouvoir la revascularisation post-ischémique afin de limiter les lésions tissulaires. Des cellules progénitrices et inflammatoires originaires de la moelle osseuse sont notamment recrutées au niveau du tissu ischémique où elles activent et participent à la régénération vasculaire et tissulaire. Leurs capacités pro-angiogéniques et pro-vasculogéniques suscitent d’ailleurs un grand intérêt pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif de ce travail de thèse aura été d’améliorer notre compréhension des mécanismes qui régissent la mobilisation et le recrutement des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse et de mettre en évidence l’efficacité d’un traitement basée sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. Dans un premier travail nous avons mis en évidence que les catécholamines (dopamine -DA- et norépinephrine –NE-) du système nerveux sympathique régulent la mobilisation des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse via une signalisation dépendante de la eNOS. Nous avons montré que la DA et la NE augmentent le nombre de cellules médullaires recrutées dans le tissu ischémique et stimulent leur différenciation en cellules à phénotype endothéliale ou inflammatoire favorisant ainsi la revascularisation post-ischémique. Le recrutement des cellules médullaires dépend également des chimiokines, et plus particulièrement de CXCL12 qui est connue pour attirer les cellules exprimant son récepteur CXCR4. Le deuxième travail de cette thèse a montré que le pouvoir chimioattractant de CXCL12 est également régulé par sa capacité à se lier aux héparan-sulfates (HS), et donc à adhérer à la matrice extracellulaire. En effet, de fortes interactions CXCL12/HS induisent une augmentation de la régénération vasculaire post-ischémique corrélée à un meilleur recrutement des cellules d’origine médullaires dans le tissu lésé.Une fois recrutées dans le tissu ischémique, les cellules souches, de part leurs capacités remarquables d’auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation et leur activité paracrine sont d’excellents activateurs de la revascularisation post-ischémique. La troisième étude de cette thèse met en évidence l’efficacité des cellules souches embryonnaires humaines multipotentes pour traiter l’ischémie critique du membre inférieur. Nous avons également révélé que ce potentiel thérapeutique dépend du miR-21.Ces travaux ont permis de démontrer que la régulation de la mobilisation et du recrutement des cellules souches contrôle la revascularisation post-ischémique et de souligner l’efficacité d’un traitement basé sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. / Following ischemia, many molecular and cellular mechanisms compete to promote post-ischemic revascularization to minimize tissue damage. Bone marrow-derived progenitor and inflammatory cells are especially recruited into the ischemic tissue where they activate and participate in vascular and tissue regeneration. Their pro-angiogenic and pro-vasculogenic capacity also generate great interest in the development of new therapeutic strategies. The objective of this thesis has been to improve our understanding of the mechanisms governing the mobilization and recruitment of bone marrow-derived progenitor cells and to highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic reperfusion. In a first work we have demonstrated that catecholamines (dopamine -DA- and norepinephrine -NE-) of the sympathetic nervous system regulate the mobilization of bone marrow-derived progenitor cells via eNOS-dependent signaling. We have shown that DA and NE increase the number of bone marrow-derived cells recruited into the ischemic tissue and stimulate their differentiation into endothelial or inflammatory phenotype cells, which promots post-ischemic revascularization.The recruitment of bone marrow cells also depends on chemokines, and particularly CXCL12 which is known to attract cells expressing CXCR4. The second work of this thesis has shown that the chemoattractant capacity of CXCL12 is also regulated by its ability to bind to heparan sulfate (HS), and thus, to adhere to the extracellular matrix. Indeed, strong interactions between CXCL12 and HS induce an increase in post-ischemic vascular regeneration correlated with better recruitment of bone marrow-derived cells in the injured tissue.Once recruited into the ischemic tissue, stem cells, because of their remarkable capacity of self-renewal, proliferation, differentiation and paracrine activity are excellent activators of post-ischemic revascularization. The third study of this thesis highlights the effectiveness of pluripotent human embryonic stem cells to treat critical limb ischaemia. We also found that their therapeutic potential depends on the miR-21.These studies have demonstrated that the regulation of the mobilization and recruitment of stem cells control the post-ischemic revascularization and highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic revascularization.

Abstract Interruption of cerebral blood flow during hypothermic circulatory arrest (HCA) predisposes neurons to glutamate excitotoxicity. Reperfusion is followed by leukocyte infiltration, which results in an inflammatory reaction in the brain tissue. In the first study, the presynaptic glutamate release inhibitor lamotrigine (L) and the leukocyte-depleting filter (LF) were studied to determine if their combination could mitigate brain injury after HCA (I). The aim of the second study was to evaluate the possible neuroprotective effect of a 14-hour period of mild (32°C) hypothermia after HCA (II). Recent experimental research has demonstrated the neuroprotective properties of erythropoietin (EPO) and fructose-1,6-bisphosphate (FDP), whose effects during and after HCA were evaluated in the third and the fourth studies (III, IV). A chronic porcine model was used. The animals were randomly assigned to the study groups as follows: 8 animals in the L+LF group, 8 in the L group, and 8 in the control group (I); 10 animals in the hypothermia group and 10 in the normothermia group (II); 10 animals in the EPO group and 10 in the control group (III), and 12 animals in the FDP group and 12 in the control group (IV). Monitoring of hemodynamics, metabolism, temperature, electroencephalogram (EEG), brain microdialysis, intracranial pressure (II-IV), and brain tissue oxygen (II-IV) was carried out. A daily behavioral assessment was performed until death or until elective sacrifice on the seventh postoperative day, after which the brain was prepared for a histopathologic examination. The results of these studies indicate that lamotrigine has a neuroprotective effect during HCA. This is observed in terms of EEG burst recovery, behavioral and histopathologic outcome, and brain microdialytic findings. The combined use of lamotrigine and leukocyte filtration may further improve survival. A 14-hour period of mild hypothermia after HCA is associated with a poor outcome. However, it may preserve its efficacy when used for no longer than 4 hours. Administration of EPO before HCA proved ineffective in reducing mortality or brain histopathologic injury. Findings from brain microdialysis, brain tissue oxygen tension, and neuronal apoptosis, however, suggest that the drug has neuroprotective properties. Administration of FDP before and after HCA is associated with better survival, behavioral outcome, and brain histopathologic scores. The metabolic and brain microdialytic findings also suggest that this drug has supportive effects on myocardial and brain metabolism.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob der Neurotransmitter Neuropeptid Y (NPY) Einfluss auf das Schwellungsverhalten retinaler Gliazellen der Ratte in hypoosmolarem Medium hat. Des Weiteren war von besonderem Interesse, welche Rezeptortypen und welche intrazellulären Signalwege in die Wirkung von NPY involviert sein könnten. Verwendet wurden 50 adulte Long-Evants-Ratten. Zuerst wurde bei einem Teil der Ratten eine transiente retinale Ischämie in einem Auge der Ratten induziert. Das andere Auge blieb unbehandelt und diente zur Kontrolle. Drei Tage post op wurden die Ratten euthanasiert. Nach Enukleation der Bulbi wurde die Netzhaut auf einen Membranfilter aufgebracht und Schnitte (1 mm) angefertigt. Um die Müllerzellen der vitalen Retina mit Hilfe des Laser Scanning-Mikroskops darstellen zu können, wurde der Farbstoff Mitotracker Orange verwendet (UCKERMANN et al. 2004). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Müllerzellen der postischämischen Retina der Ratte in hypotonem Medium schwellen (PANNICKE et al. 2004). Dazu wurden die akut isolierten retinalen Schnitte einer hypotonen Lösung ausgesetzt (60 % der Kontrollosmolarität). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass NPY die Müllerzellschwellung in hypotonem Medium in der postischämischen Netzhaut verhindert. Die pharmakologische Untersuchung des durch NPY aktivierten Signalweges erfolgte an gesunden Netzhäuten. Hier führt ein hypotones Medium bei gleichzeitiger Blockade der Kaliumkanäle (K+-Kanäle) durch Ba2+ zu einer Gliazellschwellung, die mit derjenigen in der postischämischen Retina vergleichbar ist (PANNICKE et al. 2004). NPY hemmt konzentrationsabhängig das Schwellen der Gliazellen der gesunden Netzhaut in hypoosmolarem Medium in Anwesenheit von Ba2+. Die gleiche Wirkung konnte mit dem selektiven Y1-Rezeptoragonisten hervorgerufen werden, während die Y2- und Y5-Rezeptoragonisten keine Wirkung zeigten. Außerdem hatte NPY in der Anwesenheit des selektiven Y1-Rezeptoragonisten BIBP3226 keine Wirkung. Inkubation mit dem membranpermeablen Ca2+-Chelator BAPTA-AM kehrte die Wirkung des NPY um, ebenso wie die Inkubation mit den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren Staurosporin und Gö6976. Die Neurotransmitter Glutamat und Adenosin zeigten eine dem NPY vergleichbare hemmende Wirkung auf das Schwellen der Müllerzellsomata. Außerdem konnte eine Stimulierung von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGlu) und Adenosin A1-Rezeptoren (A1R) nachgewiesen werden. Jedoch hob der selektiven Na+-Kanalblocker Tetrodotoxin die hemmende Wirkung von NPY auf. Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass NPY einen neuronalen Y1-Rezeptor aktiviert, was zu einer Mobilisierung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern und zur Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) führt. Weiterhin erfolgt eine von neuronaler Aktivität und Ca2+ abhängige Freisetzung von Glutamat und die Aktivierung von (glialen) mGlu. Letztendlich kommt es vermutlich zur Aktivierung des A1R. Resümierend könnten diese Ergebnisse wichtig sein für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Vermeidung von postischämischen und posttraumatischen Gliazellschwellungen. / The aim of the present study was to determine wether neuropeptide Y (NPY) has an effect on hypotonic glia cell swelling from the retina of the rat. Furthermore, the special interest was to determine which receptor subtypes and which intracellular pathways are involved in the effect of NPY. 50 adult Long-Evants-rats were taken. Transient retinal ischemia was induced in one eye of the rats, while the other eye remained untreated and served as control. Three days after reperfusion, the animals were killed. After enucleation of the bulbi, the isolated retina was fixed on a membrane filter and 1 mm thick slices were produced. The acutely isolated slices were loaded with the vital dye Mitotracker Orange in order to selectively stain Müller glial cells (UCKERMANN et al. 2004). The slices were examined using a confocal laser scanning microscope. As shown recently (PANNICKE et al. 2004), the somata in postischemic retinas corresponded with swelling after changing the extracellular perfusate into a hypotonic solution which contained 60 % of the control ionic strength. NPY significantly decreased the hypotonic glia cell swelling in postischemic retinas. The following experiments for the pharmacological examination of the NPY pathway where made with untreated rats. Cell somata in control retinas showed an increase of their volume during hypotonic stress when the K+-channel blocker Ba2+ was present in the extracellular solution; this swelling is comparable with the swelling of glia cells in postischemic retina (PANNICKE et al. 2004). Cell somata in control retinas showed an increase of their volume during hypotonic stress when the K+-channel blocker Ba2+ was present in the extracellular solution (PANNICKE et al. 2004). NPY significantly decreased the hypotonic glia cell swelling in control retinas in the presence of Ba2+. NPY displayed a dose-dependent swelling effect. The Y1-receptor agonist inhibited dose-dependently the hypotonic glial cell swelling, while agonists for Y2- and Y5-receptors were largely ineffective. Incubation with the membrane permeable Ca2+-chelator BAPTA-AM reversed the swelling inhibiting effect of NPY, just as incubation with PKC-inhibitors staurosporine and Gö6976 did. A dependence of the NPY effect on release of Ca2+ from intracellular stores is also suggested by the effect of thimerosal. Glutamate and adenosine also decreased the hypotonic glia cell swelling in control retinas in the presence of Ba2+. In addition, glutamate stimulates metabotropic glutamte receptors (mGluR) and adenosin activates purinergic receptors. However, the selective Na+-canal blocker tetrodotoxin (TTX) reversed the inhibiting effect of NPY on swelling, but not of glutamate and adenosine. The data suggest that NPY inhibits hypotonic glia cell swelling by activation of neuronal Y1-receptors via Ca2+-dependent release of glutamate. This effect is mediated by subsequent stimulation of glial glutamergic and purinergic receptors in Müller cells. The results may have importance for the development of new therapeutic strategies for inhibition of postischemic and posttraumatic glial cell swelling.