Notre équipe s’intéresse à la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) vers la lignée des lymphocytes T. Contrairement aux autres lignées sanguines, qui se développent dans la MO, les progéniteurs des lymphocytes T doivent terminer leur différenciation dans le thymus. Ma thèse a un double objectif: 1) caractériser les progéniteurs candidats à la reconstitution T pour établir leur contribution à celle-ci et 2) identifier les stades initiaux de la reconstitution T. Nous avons mis en évidence que seul le progéniteur multipotent au stade 3 (MPP3 : Lin- Sca1+ c-Kit+ VCAM1- Flt3+) et le progéniteur commun lymphoïde (CLP : Lin- Sca1lo c-Kitlo IL7Ra+ Flt3-) circulent dans le sang. De plus, nos résultats montrent que les gènes impliqués dans l’engagement T et dans la migration thymique sont uniquement exprimées par la population MPP3 circulante. Cette population est la plus compétente pour générer des précurseurs T (pré-T). Au contraire, les CLPs sont plus efficaces pour la production de différents types de cellules B de la rate. Par la suite, mon projet a consisté à déterminer la proportion de progéniteurs contribuant à la reconstitution T. En effet, le thymus peut être colonisé par différents progéniteurs (LMPP, Lymphoid-primed Multipotent Progenitors, et CLP), mais leur contribution dans la différenciation T reste inconnue et est sujet à controverse. Nous avons utilisé une stratégie innovante pour suivre les progéniteurs avec une séquence d’ADN ou Code Barre (CB) intégrée dans le génome par un vecteur viral. Les résultats préliminaires indiquent qu'une forte fréquence de CBs en provenance de la population LMPP est retrouvée dans le compartiment T thymique. Dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à élucider le premier stade de différenciation T dans le thymus et l’identité cellulaire et moléculaire des premiers migrants thymiques pour comprendre le délai de génération de ce compartiment. La population thymique la plus immature (TN1 : Lin- CD44+ CD25+) présente différentes sous-population selon l’expression de c-Kit et de CD24 chacune de ces différentes populations TN1 pourrait participer à cette reconstitution T. Leur analyse moléculaire montre deux lignées cellulaire selon l’expression de Pu1, dans les TN1 c-Kit+, et de Cd3e, dans la sous-population TN1e (CD24- c-Kit-). En parallèle, pour éclaircir le processus d’engagement des cellules T, ces sous-populations de TN1 ont été étudiées dans différentes conditions de reconstitution : une reconstitution endogène suite à une irradiation sub-létale et une exogène après greffe de MO. Nos résultats permettent de préciser les caractéristiques, propres aux progéniteurs thymiques au stade TN1, qui leur confèrent des compétences à se différencier et à proliférer plus efficacement. Après irradiation ou greffe de MO, le compartiment TN1 est constitué de cellules à faible capacité proliférative. Le thymus en état de reconstitution génère tout d’abord des cellules présentatrice d’antigène (APC) puis les cellules T. Ces deux points suggèrent que les cellules à faible capacité proliférative seront plus aptes à générer des cellules APC plutôt que des cellules T. Il reste à déterminer quel environnement thymique permet le maintien des cellules à faible capacité proliférative, notamment, par rapport à l’expression de Delta-4, de l’IL7 et du ligand c-Kit. Cela va permettre l'identification de facteurs favorisant leur induction et leur expansion. Il nous semble aussi intéressant d’étudier la contribution de la population à faible capacité proliférative, TN1 CD24- c-Kit-, dans la différenciation T. / Within the hematopoietic system, hematopoietic stem cells (HSCs) are the only cells with the functional capacity to give rise to all blood lineages and to self-renew for life. These properties and the ability of HSCs to engraft conditioned recipients permitted to apply these cells in regenerative medicine. Like all blood lineages, T cells develop from bone marrow HSC. However, T lineage development requires many weeks, three separate anatomical sites (bone marrow, blood and thymus), many environments and the loss of multiple alternative lineage potentials. Many questions remain to be clarified during this process: do all progenitors have an intrinsic feature of T cell development ? How does this intrinsic potential express ? How the bloodstream contributes to the T cell development ? Which BM progenitor contributes to T cell reconstitution ? What are the characteristics of T cell reconstitution ? We have shown that only the multipotent progenitor in stage 3 (MPP3: Lin- Sca1+ c-Kit+ VCAM1- Flt3+) and a subset of the common lymphoid progenitor (CLP Flt3-: Lin- Sca1lo c-Kitlo IL7Ra+ Flt3-) circulate in the blood. Moreover, our results show that T cell engagement and thymic migration genes are modulated in the circulation, especially up-regulated in the MPP3 circulating subset. This population present a T cell intrinsic potential and is the most competent to generate precursors T (pre-T). On the contrary, CLPs subsets are more efficient for the production of different B cells. Lymphoid primed multipotent progenitor (LMPP, MPP Flt3+) and CLP subsets' respective contributions to the T cell pathway are still being hotly debated. Multiple progenitors in BM have been shown to possess T lineage potential when placed in the thymus. However, it is unlikely that all of them contribute physiologically to thymopoiesis. It was claimed that CLPs are the earliest lymphoid committed progenitor from which B and T lineage cells arise. However, the concept that the CLP is the progenitor population through which all T lymphocytes are derived has been challenged. More specifically, which BM progenitor contribute to the T cell reconstitution ? In order to answer this question, we used an innovative strategy to follow the progenitors with a DNA sequence or Barcode (BC) integrated into the genome by a viral vector. Preliminary results indicate that a high frequency of BCs from the LMPP population is found in the T cell lineage. Finally, we characterized the first stage of T cell differentiation in the thymus by a cellular and molecular asses. We show that the most immature thymic population (TN1: Lin- CD44+ CD25+), at the molecular level, contain two separate lineages, detected by Pu1 (TN1a and b) or CD3e (TN1e) gene expression. In order to clarify the process of T-cell involvement, these TN1 subsets have been studied under different reconstitution conditions: endogenous reconstruction following sub-lethal irradiation and exogenous after bone marrow (BM) graft. In these conditions, the TN1 compartment presents cells with low proliferative capacity and that antigen presenting cells (APC) are the first mature population and thus T cells are generated in second place. These two points suggest that cells with low proliferative capacity will be more apt to generate APC cells rather than T cells. It remains to be determined which thymic environment permits the maintenance of cells with a low proliferative capacity, in particular, with respect to the expression of Delta-4, IL7 and the c-Kit ligand. This will allow the identification of factors favoring their induction and their expansion. It also seems interesting to study the contribution of the population with low proliferative capacity, TN1 CD24- c-Kit-, in the T cell differentiation.

L’hématopoïèse est le processus physiologique qui permet le développement de l’ensemble des cellules sanguines matures, leur renouvellement et leur homéostasie tout au long de la vie. L’hématopoïèse est généralement décrite de façon hiérarchique avec, au sommet, les cellules souches hématopoïétiques qui s’autorenouvellent et se différencient en progéniteurs puis en cellules matures. La voie de signalisation NOTCH canonique, contrôle l’activité du facteur de transcription RBPJ. Elle joue un rôle dans le développement des lymphocytes T et la spécification de la différenciation des cellules souches hématopoïétiques normales vers la lignée mégacaryocytaire. Les protéines de la famille OTT1 (OTT1, OTT3 et SHARP) s’expriment de façon ubiquitaire et sont impliquées dans le contrôle de l’activité de RBPJ. Les modalités de régulation de ces activités et l’intégration de signaux provenant d’autres voies de signalisation sont mal caractérisées. L’utilisation d’un modèle de différenciation in vitro de cellules souches hématopoïétiques sur des cellules stromales (OP9) exprimant le ligand NOTCH Delta-like 1 (DL1) ainsi que l’utilisation de modèles murins, nous a permis de montrer un lien entre la voie NOTCH et la voie PI3K/AKT dans le développement mégacaryocytaire. Nos résultats indiquent que la différenciation mégacaryocytaire peut être engagée à partir de progéniteurs myéloïdes engagés dépendant principalement de la voie PI3K/AKT, mais également directement à partir de cellules souches hématopoïétiques pour lesquelles une activation de la voie PI3K/AKT conduit à une synergie avec la voie NOTCH, mais n’est pas essentielle à la spécification mégacaryocytaire. D’autre part, pour comprendre le mécanisme de régulation de la protéine OTT1, j’ai recherché ses partenaires protéiques par crible double hybride chez la levure, et identifié des interactions avec, entre autres, des protéines à activité tyrosine kinase de la famille SRC (dont LYN) et SHARP. La spécificité d’interaction entre OTT1 et LYN a été validée dans un modèle de surexpression ainsi que dans une lignée modélisant la leucémie aigüe mégacaryocytaire. Dans nos modèles, l’interaction avec LYN conduit à la phosphorylation d’OTT1. Les analyses fonctionnelles préliminaires n’ont pas permis à ce jour de mettre en évidence un rôle essentiel de cette interaction dans le développement mégacaryocytaire. / Hematopoiesis is generally described as a hierarchical system, with at the top hematopoietic stem cells which self-renew and differentiate in progenitors, then in mature cells. Canonical Notch signaling controls RBPJ transcriptional activity. It plays a role in T lymphocyte development and stem cell fate. OTT1 family proteins (OTT1, OTT3 and SHARP) are expressed ubiquitously and are implied in control of RBPJ activity. The regulation of these activities and signal integration are all not well characterised. The use of an in vitro model of differentiation for hematopoietic stem cells on OP9 stroma cells expressing the NOTCH Delta-like-1 (DL1) ligand and the use of murine models, allowed us to show a link between NOTCH and PI3K/AKT in megakaryocytic development. Our results indicate that megakaryocytic differentiation can be engaged from myeloid progenitors depending mostly on the PI3K pathway but also from hematopoietic stem cells for which, an activation of PI3K/AKT lead to a synergy with NOTCH, but is not essential for megakaryocytic specification. On the other hand, to understand OTT1’s mechanisms of regulation, I looked for proteic binding partners by the double hybrid screen technique. Among the candidates I identified SHARP and SRC family kinases as LYN. The specific interaction between OTT1 and LYN was validated in a overexpression model and in a cell line modeling acute megakaryoblastic leukemia. In our models, the interaction with LYN lead to the phosphorylation of OTT1. However, the first analysis did not point out an essential role of this interaction in megakaryocytic development.

La voie de signalisation activée par la protéine Sonic Hedgehog (Shh) est connue pour son rôle majeur au cours de l’embryogenèse et en particulier dans la prolifération et la spécification cellulaire ou encore le guidage axonal au cours de l’établissement des structures du système nerveux. Depuis quelques années, ce morphogène a aussi été identifié comme un régulateur important de plusieurs processus physiologiques du cerveau adulte comme le maintien de la neurogenèse ou la régulation de l’activité électrique de certains neurones (Traiffort et al., 2010). La suractivation de la voie Shh dans un cerveau sain entraine une augmentation significative de la prolifération des cellules progénitrices des oligodendrocytes (OPCs), la source des oligodendrocytes matures, les cellules responsables de la formation des gaines de myéline (Loulier et al., 2006). Au cours de ma thèse, j’ai étudié le potentiel que représente l’activation de la voie Shh dans la régulation de ces progéniteurs dans un contexte de démyélinisation. Pour cela, j’ai utilisé une souris transgénique plp-GFP, chez laquelle la protéine fluorescente verte est exprimée par les cellules du lignage oligodendrocytaire. Après avoir caractérisé le profil d’expression de la GFP dans le cerveau mature de ces souris, j’ai mis au point un modèle de démyélinisation focale par injection stéréotaxique d’un détergent spécifique de la myéline, la lysolécithine (LPC). J’ai identifié les cellules du lignage oligodendrocytaire comme source directe de protéines Shh au sein de la lésion à un temps très précoce après l’injection de LPC. Les gènes cibles de la voie Shh sont aussi fortement induits dans cette population cellulaire à une période plus tardive, correspondant à la différenciation des OPCs en cellules matures. L’utilisation d’adénovirus codant soit pour Shh lui-même soit pour son antagoniste physiologique Hip, m’a permis de réaliser des expériences de gain et de perte de fonction et ainsi d’analyser comment la modulation de la voie Shh peut influencer sur le processus de régénération des oligodendrocytes suite à une lésion. La surexpression de Shh permet d’augmenter la prolifération des OPCs mais aussi d’accélérer leur différenciation, aboutissant à un nombre plus élevé d’oligodendrocytes matures plus précocement au cours du processus de remyélinisation. De plus, il est intéressant de constater que la densité des cellules astrocytaires et microgliales, notamment associées au processus inflammatoire, diminue dans la lésion chez les animaux ayant reçu l’adénovirus Shh comparés au animaux contrôles. A l’inverse, le blocage de la voie induit l’arrêt complet de la production de nouveaux oligodendrocytes. Au-delà de l’amélioration de notre compréhension de la physiologie et de la régulation du lignage oligodendrocytaire dans le cerveau adulte, l’ensemble de ce travail montre de quelle manière la voie Shh peut représenter une nouvelle piste dans la recherche de cibles thérapeutiques dans les affections de la myéline telles que la sclérose en plaques. / The Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway is known for its role during embryogenesis and in particular for controlling cell proliferation and specification, as well as axon guidance. In recent years, this morphogen has also been identified as an important regulator of several physiological processes in the adult brain such as the maintenance of neurogenesis or the regulation of the electrophysiological propreties of mature neurons (Traiffort et al., 2010). Overactivation of the Shh pathway in a healthy brain causes a significant increase in the proliferation of oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), the source of mature oligodendrocytes, the cells responsible for the formation of myelin sheaths (Loulier et al., 2006).In my thesis, I studied the effects of the Shh pathway activation on OPC regulation in the context of demyelination. To that purpose, I used a plp-GFP transgenic mouse, in which the green fluorescent protein (GFP) is expressed by cells belonging to the oligodendrocyte lineage. After characterization of the expression pattern of GFP in the mature brain of these mice, I developed a model of focal demyelination by stereotaxic injection of lysolecithin (LPC). I identified the oligodendrocyte lineage cells as a source of Shh protein within the lesion, soon after the LPC injection. Target genes of the Shh pathway are also strongly induced in this cell population, at a time corresponding to the differentiation of OPCs into mature cells. The use of adenoviral vectors encoding either Shh itself or its physiological antagonist Hip allowed me to conduct gain- and loss-of-function experiments. This way I could analyze how the modulation of Shh pathway may influence the regeneration ofoligodendrocytes after injury. Shh overexpression increases the survival and proliferation of OPCs but also accelerates their differentiation, resulting in a higher number of mature oligodendrocytes earlier during the remyelination process. In addition, the density of astrocytes and microglia, associated with the inflammatory process, is decreased in animalsreceiving the Shh adenoviral vector compared to control animals. Altogether these effects are associated with a reduction of the lesion. Conversely, blocking the pathway induced a complete arrest of new oligodendrocyte production. Besides the fundamental knowledge gained about the molecular mechanism involved in the oligodendroglial precursor cells survival, proliferation, differentiation and myelin repair in vivo, this project should also give valuable insights concerning the potential use of pharmacological modulators of Shh signaling as a novel therapeutic approach for the treatment of multiple sclerosis and other myelin diseases.

L'arthrose (OA) est une maladie dégénérative avec un impact remarquable sur la qualité de vie. Pourtant, aucune intervention pharmacologique entièrement appropriée, aucune thérapie biologique ou procédure n'entraînent la dégradation progressive de l'articulation OA. Ici, nous explorons les cellules souches mésenchymateuses (MSC) - précurseurs multi-potentiels de cellules qui peuvent être isolées à partir de différents niveaux de dégradation du cartilage. Nous émettons l'hypothèse que les cellules progénitrices mésenchymateuses (CPM) pourraient servir comme une thérapie potentielle. Le cartilage ostéoarthritique humain a été obtenu de 25 patients subissant un remplacement total du genou et classé en différents niveaux de dégradation. Les niveaux d'expression de l'ARNm de CD105, CD166, Notch 1, Sox9, Acan, Col II A1 et Col I A1 ont été mesurés au jour 0, au jour 14 (2 semaines in vitro) et au jour 35 (après chondrogénèse). Les cellules de toutes les classes d'OA ont augmenté de façon significative les marqueurs MPC de l'ARNm avec expression in vitro. Les cellules proliférées ont exprimées des marqueurs spécifiques aux MPC: CD105, CD166, CD73, CD90, Notch – 1 and Nucleostemin. La chondrogénèse induit une diminution de l'ARNm de CD105, de Notch 1 et de Sox9 seulement dans l'OA légère et modérée. Cependant, seules les pastilles modérées dérivées d 'OA ont révélé des signes de cartilage hyaline élevé - collagène II et faible expression de fibrocartilage - collagène I à la fois au niveau de l’ARNm et de la protéine. Une nouvelle conclusion émerge de nos données et confirme les différences dans les marqueurs MPC entre les différents niveaux de dégradation. Seules les cellules dérivées d 'OA modérées ont été capables de former une matrice hyaline composée de protéoglycanes et de collagène II avec le niveau faible en collagène I fibrocartilagineux. Nos résultats montrent que les CPM provenant d’un cartilage d’un niveau de dégradation modéré ont un fort potentiel d'auto-réparation. / Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease with a remarkable impact on quality of life. Yet no fully appropriate pharmacological intervention, biologic therapy or procedure stops the progressive degradation of the OA joint. Herein, we explore mesenchymal stem cells (MSCs)—multipotent precursors of cells that can be isolated from different grades of OA cartilage. We hypothesize that mesenchymal progenitors cells (MPC), could emerge as a potential therapy. Human osteoarthritic cartilage were obtained and scored (according to the OARSI) from 25 patients undergoing total knee replacement. mRNA expression levels of CD105, CD166, Notch 1, Sox9, Acan, Col II A1 and Col I A1 were measured at day 0, day 14 (2 weeks in vitro) and day 35 (after chondrogenesis). Cells from all OA grades significantly increased MPC markers mRNA with in vitro expression. Proliferated cells expressed MPC specific antigens: CD105, CD166, CD73, CD90, Notch – 1 and Nucleostemin. The chondrogenesis induced decrease in CD105, Notch 1 and Sox9 mRNA only in mild and moderate OA. Yet, only moderate OA – derived pellets revealed high hyaline cartilage marker – collagen II and low fibrocartilage marker – Collagen I expression at both mRNA and protein level. A novel finding emerges from our data and confirms differences in MPC markers between OA grades. Only moderate – OA derived cells were able to form hyaline – like matrix composed of proteoglycans and collagen II with law level of fibrocartilaginous collagen I. Further studies that investigate the mechanistic effects of chondrogenic progenitor populations associated with aging and the progression of OA are crucial to our understanding of the clinical relevance of these cells for use in cartilage repair therapies.

Neuromesodermal progenitors (NMPs) are bipotent progenitors, located at the caudal end of the embryo and are essential for axis formation. These stem cell-like progenitors possess the ability to self-renew and differentiate to both mesodermal and neural lineages, such as skeletal muscle and spinal cord derivatives. These progenitors arise at E8.5 and are localised in the caudal lateral epiblast (CLE), a posterior region of the embryo near the primitive streak. Later in development, they reside in the tail bud until cessation of axial elongation at E13.5. Throughout these stages NMPs are characteristically marked by co-expression of T(Bra) (Brachyury) and Sox2. This characteristic is also present in in vitro NMPs, which can be derived from Epiblast Stem Cells (EpiSCs) through treatment with Wnt/β-catenin signalling agonists and Fgf2, which simulates their in vivo environment. Protein and mRNA profiling of NMPs and mutant phenotypes in vivo supports the hypothesis that a non-canonical Wnt pathway, the Wnt/Planar Cell Polarity pathway (PCP) could be involved in NMP fate decision and/or maintenance. This thesis focuses on understanding more about the role of PCP by aiming to identify the spatio-temporal profile of Wnt/PCP pathway components in NMP regions during axial elongation, as well as determining its role in NMP behaviour through manipulation of this pathway via in vivo and in vitro assays Employing in situ hybridisation and immunohistochemistry techniques, key Wnt/PCP components, including Pk1, Vangl2 and Ptk7, were confirmed to be present in in vivo and in vitro NMPs, thus, providing strong evidence that Wnt/PCP may be involved regulating NMP behaviour. Disruption of Wnt/PCP signalling through overexpression of Wnt/PCP components was tested in refined in vivo and in vitro assays. Overexpression of Vangl2 and Ptk7, but not Pk1 in NMPs regions in vivo resulted in loss of contribution to neural lineages, as well as lower contribution to NMP regions themselves. Similarly, Wnt/PCP components were disrupted in vitro through generation of dox-inducible overexpression cells lines for Wnt/PCP components. These lines were used to generate NMPs from an optimised novel alternative source Epiblast-Like Cells (EpiLCs), however no clear affect to lineage was observed. Overall this work has successfully advanced our knowledge of Wnt/PCP mediated control of NMP differentiation and maintenance, and provided a finer grained description of the relationships between them.

The governance of cell fate decisions during development is a fundamental biological problem. An important aspect of this is how cells exit a multipotent state and choose their fates in a correct manner and proportion. To tackle an aspect of this problem, I have focused on 2 multipotent models: one infinite self-renewal pluripotency in an artificial environment, and the other, bipotent progenitors in the context of the mouse embryo. The first model aimed to explore the effects of chromatin-associated factors on the ability of pluripotent mouse Embryonic Stem Cells (ESCs) to self-renew, via monitoring gene expression heterogeneity of key genes. The second model focused on Neural Mesodermal Progenitors (NMPs), a bipotent cell population found in the Caudal Lateral Epiblast (CLE) of mammalian embryos, which contributes to the spinal cord and paraxial mesoderm. The aim here was to derive NMPs in vitro which exhibit similar gene expression patterns and function like their mouse embryo counterpart and study their renewal and differentiation in detail. The first multipotent model explores the effects of chromatin remodelling on cell fate decisions, specifically investigating the consequences of inhibiting the histone acetyltransferase Kat2a on the ESCs fate. I found first, that the effect of Kat2a inhibition depends on the pluripotent state of the cells; cells in a ground state exhibit a resistance to Kat2a inhibition and maintain their pluripotency, whereas cells in a naïve state experience destabilization of their pluripotency gene regulatory network and shift towards differentiation. Second, that Kat2a inhibition in the naïve state results in a decline in the gene expression noise strength contributed by the promoter activation operation, which suggests that when ESCs become lineage-primed their transcriptional noise is constrained. In the bipotent model, the NMPs are identified as cells coexpressing Sox2 and T/Brachyury, a criterion used to derive NMP-like cells from ESCs in vitro. Comparison between the different NMPs protocols stresses that Epiblast Stem Cells (EpiSCs) are an effective source for deriving a multipotent population resembling the embryo Caudal Epiblast (CE), that generates NMPs. Furthermore, self-organization of this CE-like population, resulted in axially organized aggregates. Exploiting the mouse embryo CLE as a reference shows that EpiSCs derived NMPs, monolayers and aggregates, consist of a high proportion of cells with the embryo's NMP signature. Importantly, studying this system in vitro sheds light on the sequence of events which lead to NMP emergence in vivo. On this basis, I conclude that understanding the initial state of cells at a crossroads is important to reveal the limitations it imposes on the cells fate exploration, hence makes it possible to mimic more precisely the fate decision process in vitro.

Patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) emerged as a promising cell source for disease modeling and drug screening as well as a virtually unlimited source for restorative therapy. The thesis deals with three major topics to help realizing biomedical applications with neural stem cells. To enable the generation of transgene-free iPSCs, alternatives to retroviral reprogramming were developed. Hence, the adaptation and evaluation of reprogramming using excisable lentiviral constructs, Sendai virus (SeV) and synthetic mRNA-based methods was assessed in the first part of this thesis. hiPSCs exhibit the pluripotency markers OCT4, SSEA-4, TRA1-60 which were confirmed by immunofluorescence and flow cytometry. Besides, the potential to differentiate in cell types of all three germ layers was detected, confirming pluripotent identity of proliferating colonies resulting from various reprogramming strategies. However, major differences such as high efficiency with SeV in contrast to a relatively low efficiency with mRNA in regard to passage number and the phenotype of starting fibroblasts were observed. Furthermore, a prolonged clone- and passage-dependent residual presence of viral RNA genes was identified in SeV-iPSCs for up to 23 passages using RT-PCR underlining the importance of careful monitoring of clone selection. In contrast, viral-free reprogramming by synthetic mRNA represents a fully non-integrative approach but requires further refinement to be efficiently applicable to all fibroblasts. The second part of this thesis deals with the establishment of a rapid monolayer approach to differentiate neural progenitor cells from iPSCs. To achieve this, a two-step protocol was developed allowing first the formation of a stable, primitive NPC line within 7 days which was expanded for 2-3 passages. In a second step, a subsequent adaptation to conditions yielding neural rosette-like NPCs followed. Both neural lines were demonstrated to be expandable, cryopreservable and negative for the pluripotency marker OCT4. Furthermore, a neural precursor identity including SOX1, SOX2, PAX6, Nestin was confirmed by immunofluorescence and quantitative RT-PCR. Moreover, the differentiation resulted in TUJ1-positive neurons and GFAP-positive astrocytes. Nonetheless, the outcome of glial differentiation from primitive NSCs remained low, whereas FGF/EGF-NPCs were efficiently differentiated into GFAP-positive astrocytes which were implicated in a cellular model of the blood brain barrier. The third and major objective of this study was to generate human early neural progenitor cells from fetal brain tissue with a wide neural differentiation capacity. Therefore, a defined medium composition including small molecules and growth factors capable of modulation of crucial signaling pathways orchestrating early human development such as SHH and FGF was assessed. Indeed, specific culture conditions containing TGFβ inhibitor SB431542, SHH agonist Purmorphamine, GSK3β inhibitor CHIR99021 and basic FGF, but no EGF enabled robust formation of early neuroepithelial progenitor (eNEP) colonies displaying a homogeneous morphology and a high proliferation rate. Moreover, primary eNEPs exhibit a relatively high clonogenicity of more than 23 % and can be monoclonally expanded for more than 45 passages carrying a normal karyotype. Characterization by immunofluorescence, flow cytometry and quantitative RT-PCR revealed a distinct NPC profile including SOX1, PAX6, Nestin and SOX2 and Prominin. Furthermore, primary eNEPs show NOTCH and HES5 activation in combination with non-polarized morphology, indicative of an early neuroepithelial identity. Microarray analysis unraveled SOX11, BRN2 and other HES-genes as characteristic upregulated genes. Interestingly, eNEPs were detected to display ventral midbrain/hindbrain regional identity. The validation of yielded cell types upon differentiation indicates a strong neurogenic potential with more than 90 % of TUJ1-positive neurons. Moreover, astrocytes marked by GFAP and putative myelin structures indicating oligodendrocytes were identified. Electrophysiological recordings revealed functionally active neurons and immunofluorescence indicate GABAergic, glutamatergic, dopaminergic and serotonergic subtypes. Additionally, putative physiological synapse formation was observed by the presence of Synapsin and PSD-95 as well as by ultrastructural examination. Notably, rare neurons stained positive for the peripheral neuronal marker Peripherin suggesting the potential of eNEPS to give rise to cells of neural tube and neural crest origin. By the application of specific differentiation protocols an increase of TH-positive neurons or neural crest-derivatives such as putative A- and C-sensory neurons and mesenchymal cells was identified. Taken together, primary eNEPs might help to elucidate mechanisms of early human neurodevelopment and will serve as a novel source for cell replacement and further biomedical applications. / Patientenspezifische induziert pluripotente Zellen (iPSZ) haben sich als eine vielversprechende Möglichkeit erwiesen Zellen zu gewinnen, die für Krankheitsmodellierung, Arzneimitteltests und Zellersatztherapie in Frage kommen. In dieser Arbeit wurden drei wichtige Fragestellungen adressiert, die für potenzielle biomedizinische Anwendungen von neuralen Stammzellen von großem Interesse sind. Um die Generierung von transgenfreien iPSZ zu ermöglichen, wurden Alternativen zur retroviralen Reprogrammierung entwickelt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Reprogrammierungsmethoden, die auf deletierbaren, lentiviralen Konstrukten oder nichtintegrativen Verfahren wie Sendaivirus (SeV)-Transduktion und Transfektion synthetischer mRNA basieren, adaptiert und evaluiert. Die daraus resultierenden iPSZ exprimieren die Pluripotenzmarker OCT4, SSEA-4 und TRA1-60. Weiterhin wurde das Potenzial in Zelltypen aller drei Keimblätter zu differenzieren nachgewiesen. Dadurch konnte die pluripotente Identität der proliferativen Kolonien bestätigt werden. Beim Vergleich der angewandten Methoden fielen, bezüglich der generierten iPSZ-Linien, sowohl qualitative als auch quantitative Unterschiede auf. Bei der Verwendung von SeV-Partikeln wurde eine hohe Reprogrammierungseffizienz festgestellt. Bei der Transfektion von mRNAs hingegen war die Reprogrammierungseffizienz deutlich niedriger. Diese war darüber hinaus abhängig von der Passage und dem Genotyp der Ausgangsfibroblasten. Des Weiteren konnte eine klon- und passagenabhängige Präsenz viraler Gene in SeV-iPSZ bis zu 23 Passagen lang beobachtet werden, während bei der mRNA-Transfektion keine Spuren der genetischen Manipulation zurückblieben. Dies verdeutlicht die Bedeutung einer sorgfältigen Qualitätskontrolle bei der Klonselektion im Falle der SeV-iPSZ. Im Gegensatz dazu stellt die Reprogrammierung durch Transfektion synthetischer mRNAs eine völlig nicht-integrative Strategie dar, erfordert allerdings weitere Verfeinerung um das Verfahren effizient und vor allem für alle Fibroblastenpräparationen anwendbar zu machen. Der zweite Teil der Arbeit behandelt die Etablierung eines schnellen, adhärenten Protokolls, um neurale Vorläuferpopulation aus iPSZ zu differenzieren. Um dies zu erreichen, wurde ein zweiphasiges Protokoll entwickelt, welches zunächst die Generierung einer primitiven neuralen Vorläuferzellpopulation innerhalb von 7 Tagen erlaubt. In einem zweiten Schritt erfolgte die Adaptierung an Kulturbedingungen, die eine neurale, rosettenähnliche Zellpopulation induzieren. Beide neuralen Zellpopulationen konnten weiter expandiert und eingefroren werden und waren negativ für den Pluripotenz-assoziierten Transkriptionsfaktor OCT4. Darüber hinaus konnte die neurale Vorläuferidentität mittels positiver Expression von SOX1, SOX2, PAX6 und Nestin bestätigt werden. Eine weitere Differenzierung dieser Zellen resultierte in TUJ1-positiven Neuronen und GFAP-positiven Astrozyten, die die Verwendung der Zellpopulation beispielsweise in einem zellulären Modell der Blut-Hirn-Schranke erlaubten. Das Hauptprojekt dieser Dissertation war es, frühe humane neurale Vorläuferzellen aus fetalem Hirngewebe zu isolieren und in Kultur zu stabilisieren. Diese Population sollte eine breite Differenzierungskapazität aufweisen. Zu diesem Zweck wurde eine chemisch definierte Medienzusammensetzung gewählt, die zusätzlich pharmakologisch wirksame Verbindungen und Wachstumsfaktoren beinhaltet. Hierdurch konnten Signaltransduktionswege wie zum Beispiel der Sonic-Hedgehog- (SHH) oder FGF-Signalweg, die bei der frühen neuralen Entwicklung eine bedeutende Rolle spielen, moduliert werden. In der Tat ermöglichten spezifische Kultivierungsbedingungen, die den TGFβ-Inhibitor SB431542, den SHH-Agonisten Purmorphamin, den GSK3β-Inhibitor CHIR99021 und basisches FGF, jedoch kein EGF enthielten, die robuste Bildung einer früheren neuroepithelialen Vorläuferpopulation (eNEP). Die so stabilisierten Kolonien wiesen eine homogene Morphologie und eine hohe Proliferationsrate auf. Außerdem zeigten sie eine hohe Klonogenitätsrate von 23%, die es ermöglichte monoklonale Zelllinien zu isolieren und für mehr als 45 Passagen zu expandieren. Dabei blieb ein normaler Karyotyp erhalten. Die Zellen zeigten ein eindeutiges neurales Profil, gekennzeichnet durch SOX1, PAX6, Nestin, SOX2 und Prominin-Expression. Weiterhin wiesen eNEPs NOTCH und HES5-Aktivierung in Kombination mit nicht-polarisierter Morphologie auf, was auf eine frühe neuropitheliale Identität hinweist. Eine Microarray-Analyse demonstrierte weiterhin SOX11, BRN2 und einige HES-Gene als charakteristisch hochregulierte Gene. Interessanterweise zeigen eNEPs eine regionale Identität, die auf eine Mittelhirn/Hinterhirn-Regionalisierung hinweist. Die Validierung ungerichtet ausdifferenzierter Zelltypen offenbarte mit einem Kulturanteil von 90% TUJ1-positiven Neuronen ein stark neurogenes Potenzial. Zusätzlich konnten GFAPpositive Astrozyten sowie mögliche Myelinstrukturen, die auf Oligodendrozyten hinweisen, nachgewiesen werden. Elektrophysiologische Aufzeichnungen deuten auf funktionell aktive Neurone hin und Immunofluoreszenzfärbungen zeigten GABAerge, glutamaterge, dopaminerge und serotonerge neuronale Subtypen. Außerdem wurden mittels Immunfluoreszenzanalyse Synapsin- und PSD-95- positive synaptische Strukturen nachgewiesen. Ultrastrukturelle Analysen mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigten das Ergebnis. Hervorzuheben ist, dass einige Neurone positiv für den peripheren Neuronenmarker Peripherin gefärbt wurden, was darauf hinweist, dass eNEPs das Potenzial besitzen, in Zellen der Neuralleiste zu differenzieren. Durch die Verwendung von spezifischen Differenzierungsprotokollen konnte das Vorkommen TH-positiver und auch möglicher A- und C-sensorischer Fasern, sowie mesenchymaler Zellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass primäre eNEPs dazu beitragen könnten, die frühe humane Gehirnentwicklung zu verstehen. Darüber hinaus stellen eNEPs eine potentielle zelluläre Quelle für Zellersatztherapien und weitere biomedizinische Anwendungen dar.

Die Stamm- und Vorläuferzellen, im Weiteren als Progenitoren bezeichnet, des humanen Darms treten seit einigen Jahrzehnten immer stärker in den Fokus der Forschung. Mit der Entdeckung von Progenitorzellen im zentralen Nervensystem in den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts kamen auch Bestrebungen auf, im peripheren Nervensystem nach Progenitoren zu suchen. Bald darauf, zu Beginn des 21. Jahrhunderts, wurden Sie entdeckt. Diese Population von Zellen bietet eine vielversprechende Möglichkeit, aus adultem Darmgewebe Progenitorzellen zu isolieren und diese therapeutisch, bei einer Vielzahl gastroenterologischer Erkrankungen, autolog einzusetzen. Derzeit werden auch andere mögliche Stamm- und Vorläuferzellen evaluiert. Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung humaner, enterischer, neuraler Progenitorzellen. Dies ist essentiell für eine mögliche, klinische Translation. Es gelang, die in vitro Kulturbedingungen der isolierten, humanen Zellen durch Wachstumsfaktorenzugabe und Supplemente zu verbessern und ermöglicht so auch ein besseres Verständnis der in vivo-Situation. Weiterhin wurde das sich verändernde enterische Nervensystem des humanen Darms, in verschiedenen Altersstufen, spezifisch isoliert und analysiert. Es konnten neuartige Befunde zum Verlust von neuronalen Zellen im Allgemeinen und der charakteristische Verlust von NOS-Neuronen im Speziellen erhoben werden. Erstmals beobachtet wurde die Erhöhung der Genexpression für Gliazellen im gealterten ENS. Die gewonnen Erkenntnisse wurden weiterhin in einer in vivo-Transplantationsstudie angewendet. In ein Mausmodell mit einem chemisch geschädigten Darmnerensystem wurden postnatale, humane Progenitoren eingebracht und es gelang der Beweis einer verbesserten Funktionalität durch Integration von neugebildeten Neuronen, Glia und Muskelzellen.

Stammzellen nehmen in der regenerativen Therapie von Herzkreislauferkrankungen einen hohen Stellenwert ein. Aufgrund der ethischen Kontroverse besitzen adulte Stammzellen mit einem Differenzierungspotential von embryonalen Stammzellen einen Vorteil gegenüber den humanen embryonalen Stammzellen. In dieser Arbeit konnten spermatogoniale Stammzellen aus einem transgenen Mausmodell (MHC-NEO/MHC-eGFP) isoliert und mittels lentiviraler Überexpression von OCT4 allein in den pluripotenten Zustand überführt werden. Die Pluripotenz dieser induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) wurde durch verschiedene charakteristische Analysen nachgewiesen. Für therapeutische Einsätze zur Myokardinfarktregeneration stellen kardiovaskuläre Vorläuferzellen, die die Fähigkeit aufweisen sowohl zu proliferieren als auch in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und endotheliale Zellen zu differenzieren, eine geeignete Zellart dar. Diese Vorläuferzellen sind durch die Expression des Oberflächenrezeptors fetal liver kinase 1 (FLK1) gekennzeichnet. In dieser Arbeit wurden iPSCs generiert und in FLK1 positive Zellen durch Cokultivierung differenziert und mit Hilfe der fluorescence activated cell sorting (FACS)-Technik separiert. Es wurden 30% FLK1 positive Zellen gewonnen. Auch hESCs konnten durch Cokultivierung auf OP9 Zellen (30%) und über das mass culture Verfahren (50%) in kinase domain region (KDR) positive Zellen differenziert werden. Die Vitalität und Differenzierungsfähigkeit der FLK1 positiven Zellen nach der FACS-Separierung wurden bestätigt. Zur Analyse des therapeutischen Effekts dieser FLK1 positiven Zellen wurde ein Myokardinfarkt-Mausmodell etabliert. Die FLK1 positiven Zellen wurden allogen in Wildtypmäuse injiziert, die mit dem Immunsuppresivum Ciclosporin A (CsA) behandelt wurden. Nach Injektion dieser Vorläuferzellen wurde eine signifikante Steigerung der Ejektionsfraktion an Tag 56 nach Injektion nachgewiesen. Dieser funktionssteigernde Trend an Tag 56 durch die Zellinjektion wurde auch bei der Verkürzungsfraktion beobachtet. Die injizierten Zellen konnten zu den frühen Untersuchungszeitpunkten im Myokard durch Zellkernansammlungen nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten war dies nicht mehr der Fall. Während der in vivo Studie wurde zu keinem Zeitpunkt eine Teratombildung beobachtet. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die FLK1 positiven Zellen eine Tumorigenität in immundefizienten Mäusen aufwiesen und somit in dieser Form nicht direkt für die regenerative Therapie eingesetzt werden können. Ebenfalls wurde gezeigt, dass das Immunsystem der Versuchstiere und die Behandlung mit dem Immunsuppressivum CsA Auswirkungen auf die Teratombildung in der in vivo Studie besitzen. Die injizierten Zellen führten zu einer Aktivierung der natürlichen Killer (NK)-Zellen der Versuchstiere, die hingegen zu einer Lyse der injizierten Zellen führen konnten. CsA inhibierte die Teratombildung, besaß jedoch keinen Einfluss auf die NK-Zellaktivität. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die injizierten Zellen vom Immunsystem der Mäuse abgestoßen worden sind und somit zu späteren Versuchszeiten nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Trotz der eventuellen Abstoßung im späteren Versuchsverlauf führte die Injektion der FLK1 positiven Zellen zu einer signifikanten Steigerung der Herzleistung. Die Tumorigenität von Zellen spielt eine entscheidende Rolle in der stammzellbasierenden Therapie. Die virale Methode der Reprogrammierung in iPSCs hatte keinen Einfluss auf die Tumorigenität dieser Zellen. Bei Injektion von autologen viral iPSCs in entsprechende Akzeptormäuse wurden Teratombildungen beobachtet. Die NK-Zellaktivität wurde durch die Injektion jedoch nicht aktiviert. Es wurde somit gezeigt, dass die viral iPSCs vom Immunsystem der autologen Versuchstiere nicht abgestoßen wurden. Die Tumorigenität schien somit von zelllinienspezifischen Immunogenen beeinflusst. Für klinische Anwendungen könnten die hier untersuchten kardiovaskulären Vorläuferzellen, die ein regeneratives Potential aufwiesen, aufgrund ihrer Tumorigenität jedoch nicht eingesetzt werden. Zukünftig müssten die zu transplantierenden Zellen erneut selektiert werden, um eventuelle Unreinheit von undifferenzierten Zellen zu umgehen. Dies könnte durch Kultivierung der Population mit NK-Zellen erfolgen, da diese Arbeit gezeigt hat, dass eine NK-Zellaktivität gegen tumorigene Zellen vorliegt. Eine andere Möglichkeit wäre diese kardiovaskulären Vorläuferzellpopulation im Folgenden auch zur Herstellung von künstlichem Herzgewebe einzusetzen, um größere Bereiche von geschädigtem Myokard zu regenerieren.

T lymphocytes play a critical role in adaptive immunity by eliciting and regulating specific immune responses against viral and bacterial pathogens. The development of T cells occurs within the highly specialized thymus and follows a defined set of stage-specific differentiation steps. However, the molecular and cellular events occurring at early stages of human T-cell development remain to be fully elucidated. This was in part due to the inability to obtain substantial numbers of T-lineage cells from hybrid/human fetal thymic organ culture (FTOC) and the inability to recapitulate human T-lymphopoiesis using other systems. To address the molecular and cellular events occurring during early human T-lymphopoiesis, human umbilical cord-blood (UCB) hematopoietic stem cells (HSCs) were induced to differentiate to the T-lineage utilizing OP9-DL1 stromal cells. A developmental program involving a sequential and temporally discrete expression of key differentiation markers was revealed. In addition, this Thesis demonstrates that in vitro-generated CD34+CD7++ progenitors effectively engrafted the thymus of immunodeficient mice. In addition, two distinct progenitor subsets, CD34+CD45RA+CD7++CD5-CD1a- (proT1) and CD34+CD45RA+CD7++CD5+CD1a- (proT2), were identified with proT2 cells showing a 3-fold enhanced engrafting capacity than the proT1 subset. As proT2 cells exhibit superior engrafting capacity, these cells were tested for their ability to enhance T cell generation following hematopoietic stem cell transplant (HSCT). We observe that when HSCs are coinjected with proT2 cells, a dramatic improvement in HSC-derived T-lymphopoiesis is observed. This Thesis demonstrates that in vitro-derived proT2 cells reorganize the thymus stromal compartment of the host NOD/SCID/γcnull mouse compared to the highly disorganized cortical and medullary compartments in mice not receiving proT cells. This alteration in thymic architecture likely favours the recruitment of BM derived progenitors. Lastly, we address whether functional CD8 T cells can be generated in vitro using hematopoietic stem cells (HSCs) in coculture with OP9-DL1 cells and indeed these cells were capable of proliferating, and secreting effector molecules typical of cytotoxic T cells. Taken together, the ability to generate proT cells and mature T cells from Notch-ligand cultures offers a new tool to study human T cell development.