Memoria para optar el título de Bioquímico / La presencia de asimetrías neuroanatómicas y funcionales en el cerebro de vertebrados es un rasgo ampliamente conservado que juega un papel importante en el comportamiento animal. El desarrollo diferencial de las mitades izquierda y derecha del cerebro se observa desde estados tempranos de la embriogénesis, lo que sugiere una regulación genética. Se ha descrito que la vía de señalización comandada por el factor de crecimiento TGFβ Nodal está involucrada en el establecimiento de asimetría de órganos internos en vertebrados. En pez cebra y medaka, los genes efectores de la vía Nodal, como el factor de transcripción pitx2c, se expresan en forma asimétrica a la izquierda del cerebro, precediendo el desarrollo de asimetrías neuroanatómicas. En pez cebra estas asimetrías incluyen al núcleo habenular y al complejo pineal. Al respecto, se sabe que el núcleo habenular izquierdo es más grande que el núcleo habenular derecho y que el órgano parapineal se localiza en la izquierda del diencéfalo. Estudios preliminares indican que el pez teleósteo medaka presenta un desarrollo de asimetrías neuroanatómicas similares a aquellas del pez cebra. De esta forma pez cebra y medaka son herramientas genéticas que nos permitirán comenzar a descifrar los mecanismos del desarrollo que participan en el establecimiento de las asimetrías neuroanatómicas en vertebrados. El objetivo de esta tesis fue determinar si las asimetrías neuroanatómicas de pez cebra y medaka se correlacionan con diferencias en la tasa de proliferación celular entre las habénulas izquierda y derecha, y si estas diferencias podrían estar controladas por el factor de transcripción pitx2c. Para el primer objetivo se realizaron experimentos de inmunoflurorescencia indirecta contra histona H3 fosforilada. Para el segundo objetivo, se midió la expresión de pitx2c mediante hibridaciones in situ sucesivas. Al respecto, en medaka, el ensayo contra histona H3 fosforilada muestra que existe una diferencia estadísticamente significativa en el número de células en proliferación entre ambas habénulas, a modo que el núcleo izquierdo presenta mayor número de éstas. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de una asimetría izquierda/derecha en la tasa de proliferación celular, que es mayor para la mitad izquierda de la habénula. En pez cebra no fue posible realizar este ensayo, debido a que no se logró encontrar un marcador habenular que delimitara esta región en el embrión completo. En esta búsqueda se logró identificar un gen denominado cxcr4b, como un marcador de la zona más anterior de la habénula, donde su expresión muestra una clara tendencia a la asimetría. Por otro lado, se observó que tanto en pez cebra y en medaka, pitx2c se expresa unilateralmente en el epitálamo, específicamente en el lado izquierdo, desde estadios muy tempranos del desarrollo hasta estadios tardíos. La expresión más tardía no había sido descrita y está a favor de un posible papel de pitx2c en la morfogénesis asimétrica cerebral. Finalmente, se pudo establecer una correlación espacial y temporal entre la expresión de pitx2c y las asimetrías en la proliferación celular en la habénula de medaka, ya que los precursores habenulares izquierdos expresan pitx2c en el momento donde se observan las asimetrías en proliferación celular. Estos hallazgos deben ser en el futuro corroborados con experimentos de ganancia y pérdida de función de pitx2c / Neuroanatomical and functional asymmetries of the brain are conserved among vertebrates and play important roles in animal behaviour. Differences between the right and left sides of the brain have been described at early developmental stages, suggesting a genetic regulation of asymmetry. The Nodal pathway is one of many signalling pathways involved in the establishment of organ asymmetry in vertebrates. In zebrafish and medaka, effectors of the Nodal signaling pathway, such as the transcription factor pitx2c, are asymmetrically expressed in the left side of the brain, preceding the development of neuroanatomical asymmetries. Genetic studies in zebrafish have reported asymmetries within the epitalamic habenular nuclei and pineal complex. It is known that the left habenular nucleus is larger than the right nucleus, and that the parapineal organ is located on the left side of the diencephalon. Preliminary data indicate that medaka, a teleost similar to zebrafish, shows a similar pattern of neuroanatomical asymmetries in the brain. Therefore, zebrafish and medaka have emerged as genetic tools that will facilitate our understanding of the developmental basis of brain asymmetry. The aim of this thesis was to investigate whether the development of neuroanatomical asymmetries is associated with a differential rate of cell proliferation between the left and right habenular nuclei in zebrafish and medaka. In this thesis we also investigated whether differences in cell proliferation correlate with asymmetric expression of the transcription factor pitx2c. The first aim was approached using indirect immunofluorescence against phosphorylated histone H3. For the second aim, the pattern of expression of pitx2 was determined through in situ hibridization. The antibody essay against phosphorylated histone H3 in medaka revealed a difference in the number of proliferating cells within the habenulae, the left nucleus showing a larger amount of proliferating cells. These results suggest an asymmetric pattern of cell proliferation, in favor of the left habenular nucleus. It was not possible to perform the same assay in zebrafish due to the lack of an habenular marker that would allow us to circumscribe this region in the whole embryo. In this research, we were able to identify cxcr4b as a marker of the anterior habenular region, where its expression was clearly asymmetric. pitx2c was expressed unilaterally in the left epitalamic region of zebrafish and medaka, from early to late developmental stages. The late expression of pitx2c, which was not described before, supports a possible role of pitx2c during asymmetric morphogenesis of the brain. Finally, a spatial and temporal correlation was established between pitx2c expression and asymmetries in cellular proliferation in the habenulae of medaka. Precursors of the left habenular nucleus express pitx2c at the same time when asymmetries in cell proliferation are observed. These findings must be investigated further using pitx2c gain and loss of function experiments

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte en mujeres en el mundo. Este cáncer es una enfermedad heterogénea compuesta por varios sub-tipos biológicamente distintos, en los cuales la participación del metabolismo en la proliferación celular permanecen pobremente entendido. Además, las células tumorales exhiben una alta capacidad de remodelar su metabolismo frente a cambios en la disponibilidad de sustratos o algún estrés metabólico, siendo una respuesta adaptativa que promueve la sobrevida celular. Sin embargo, la participación del metabolismo mitocondrial en la proliferación y la inducción de un remodelamiento metabólico mediante la inhibición farmacológica de la cadena transportadora de electrones (CTE) para obtener efectos anti-proliferativos permanecen escasamente explorados en células de cáncer de mama. Los resultados sugieren que las líneas celulares de cáncer de mama, comparadas con las células no-tumorales, presentan diferencias en el metabolismo mitocondrial, exhibiendo reducida capacidad de reserva y funcionando su CTE en su máxima velocidad. Además, las células de cáncer de mama exhiben diferentes dependencias sobre la disponibilidad de glucosa y glutamina para mantener la proliferación y frente a la privación de glucosa, pueden remodelar la organización bioenergética hacia el metabolismo mitocondrial. De forma interesante, estos datos sugieren que el funcionamiento de la CTE en células tumorales podría ser esencial para funciones celulares y que su bloqueo podría tener efectos anti-tumorales selectivos. A partir de una serie de compuestos con estructura química de tipo quinona/hidroquinona, se identificó un compuesto (Cpd.7) con efecto anti-proliferativo selectivo hacia células de cáncer de mama murinas y humanas. Cpd. 7 fue identificado como un inhibidor no-competitivo de la actividad del complejo I, con un sitio de unión putativo en el brazo hidrofóbico cercano al sitio de unión de ubiquinona. Este compuesto inhibió la respiración mitocondrial dependiente del complejo I, disminuyó la razón NAD+/NADH, produjo despolarización mitocondrial, afectando solo a tiempos tempranos los niveles de ATP. En células tumorales, Cpd. 7 produjo un selectivo remodelamiento metabólico hacia un fenotipo glicolítico dependiente de AMPK, siendo un mecanismo de sobrevida. De forma interesante, la disponibilidad de sustratos y la flexibilidad metabólica exhibida por células tumorales son factores que determinan el efecto de Cpd. 7, variando entre un efecto citotóxico o anti-proliferativo. Cpd. 7 afecta selectivamente la proliferación de células de cáncer de mama, induciendo detención del ciclo celular y senescencia. Este efecto es debido los cambios en la razón NAD+/NADH producida por la inhibición de la respiración mitocondrial, alterando la síntesis de amino ácidos (especialmente aspartato), los cuales son requeridos como precursores para la síntesis de nucleótidos durante la proliferación. En conclusión, en este trabajo se demuestra que la inhibición de la CTE a nivel del complejo I por pequeñas moléculas produce efectos anti-proliferativos, los cuales son mediados por la inducción de un selectivo remodelamiento metabólico en células de cáncer de mama / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of death from cancer in women worldwide. This cancer is a heterogeneous disease comprised of several biologically distinct sub-types, in which the participation of the metabolism in the proliferation remain poorly understood. In addition, cancer cells exhibit a high capacity to remodel the metabolism in response to changes in the substrate availability or some metabolic stress, being an adaptive response that promote the cell survival. However, the participation of mitochondrial metabolism in the proliferation and the induction of a metabolic remodeling though the pharmacologic inhibition of the electron transport chain (ETC) to obtain anti-proliferative effect remains scarcely explored in breast cancer cells. Results suggest that the cell lines of breast cancer, compared to the non-tumoral cells, show differences in the mitochondrial metabolism, exhibiting reduced spare capacity and a high ETC activity. Moreover, breast cancer cells exhibit different dependence on glucose and glutamine availabilities to maintain the proliferation and under glucose deprivation, they can remodel the bioenergetic organization toward the mitochondrial metabolism. Interestingly, these data suggest that the ETC function in breast cancer cells may be essential for cellular functions and blocking may have selective anti-cancer effects. From a series of new compounds with chemical structure with quinone/hydroquinone scaffold, it was identified a compound (Cpd.7) with selective anti-proliferative effect toward murine and human breast cancer cells. Cpd. 7 was identified as a non-competitive inhibitor of complex I activity with a putative binding site in the hydrophobic arm next the binding site of ubiquinone. This compound inhibited the Complex I-dependent mitochondrial respiration, decreased the NAD+/NADH ratio, induced mitochondrial deporalization, affecting the ATP levels only at short time of exposition. In cancer cells, Cpd. 7 induced a selective metabolic remodeling toward a AMPK-dependent glycolytic phenotype, being a survival mechanism. Interestingly, the substrate availability and metabolic flexibility exhibited by breast cancer cells are determinants of the anti-cancer effect of Cpd.7, ranging from cytotoxic and anti-proliferative effects. Cpd. 7 selectively affects the proliferation of breast cancer cells, inducing cell cycle arrest and senescence. This effect occurs due changes in the NAD+/NADH ratio produced by the inhibition of the mitochondrial respiration, altering the amino acid synthesis (especially aspartate), which are required as precursors in the nucleotide synthesis during the proliferation. In conclusion, this work shows that the inhibition of ETC function at complex I level by small molecules produces anti-proliferative effects, which are mediated by the induction of a selective metabolic remodeling in breast cancer cells / Fondecyt; Fondap

Memoria para optar al título de Químico / En este trabajo se informa la síntesis y caracterización de una serie de acilhidroquinonas lipofílicas, portadoras de un átomo de bromo o del catión trifenilfosfonio en el fragmento acílico, características que permiten una mayor incorporación a las mitocondrias. Para la síntesis de acilhidroquinonas se utilizó el reordenamiento de Fries, donde se usa un ácido de Lewis fuerte como el BF3.2H2O y como reaccionantes, diversos ácidos carboxílicos sustituidos con un átomo de bromo terminal e hidroquinona. En una segunda etapa se lleva a cabo la formación de las sales de fosfonio a partir de las nuevas acilhidroquinonas, mediante la sustitución del átomo de bromo con trifenilfosfina. Estos compuestos fueron caracterizados espectroscópicamente mediante resonancia magnética nuclear (1H y 13C). Interesantemente, una de las sales de fosfonio mostró una alta actividad de inhibición de la proliferación celular, frente a células de tumores mamarios humanos metastásicas (MDA MB231) y no metastásicas (MCF7) / The aim of this thesis is the synthesis of a series of lipophilic acylhidroquinones which exhibits in their structures a bromine atom or the cation triphenylphosphonium at the acylic fragment, to target them to mitochondria. Fries rearrangement, wherein a strong Lewis acid such as BF3.2H2O was used, starting from hydroquinone and carboxylic acids bearing a bromine atom in their structures was performed. In a second stage, the phosphonium salts derivatives were obtained by reaction of bromoacyl hidroquinones with triphenylphosphine. These compounds were characterized spectroscopically by NMR (1H and 13C), one of the phosphonium salts showed an interesting antitumor activity against metastatic cells from human breast tumors (MDA MB231) and non-metastatic (MCF7) / FONDECYT

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La calreticulina (CRT) es una proteína chaperona del retículo endoplásmico, que está ampliamente distribuida en las células eucariotas. Diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado que la CRT tiene un importante rol en la cicatrización de heridas cutáneas y diversos procesos asociados con la reparación cutánea, como la proliferación y migración celular. La CRT está constituida por tres dominios distintos, estructural y funcionalmente hablando, donde el dominio P y C contienen sitios de interacción con calcio y el dominio N contiene una secuencia de señal dirigida al retículo endoplásmico. Asimismo, se sabe que el dominio "N" es el responsable del efecto antiangiogénico y antitumoral descrito para ésta proteína, y el subdominio "S" de la inhibición de la vía clásica del sistema del complemento humano. Sin embargo, no han sido determinados aún los dominios específicos de CRT implicados en el proceso de cicatrización de heridas. El objetivo principal de esta memoria de título fue analizar los dominios responsables de la proliferación y migración celular, lo cual se realizó comparando el efecto de Calreticulina de Trypanosoma cruzi recombinante (rTcCRT) con dos de sus dominios (N y S), en cicatrizaciones de heridas in vitro, con fibroblastos dérmicos de ratas. rTcCRT completa indujo un mayor porcentaje de migración celular en comparación a los dominios N y S. Por otro lado, los dominios N y N+S indujeron mayor aumento en el número de células viables. Estos resultados sugieren que el dominio N-terminal de rTcCRT es el que estimula proliferación celular y el dominio C, es el posible responsable de la inducción de migración celular generada por rTcCRT. / Calreticulin (CRT) is a chaperone protein of the endoplasmic reticulum, which is widely distributed in eukaryotic cells. Various studies in vitro and in vivo have shown that CRT plays an important role in wound healing and various processes associated with skin repair, such as wound cell proliferation and migration. CRT is comprised of three distinct structural and functionally speaking domains, where P and C domain contain calcium interaction sites and N domain contains a signal sequence to the endoplasmic reticulum. It is also known that the "N" domain it is responsible for the anti-angiogenic and antitumor effect described for this protein, and "S" subdomain of the inhibition of classical pathway of human complement system. However, they have not yet been determined CRT specific domains involved in the wound healing process. The main aim of this research was to analyze the responsible domains for cell proliferation and migration, this was done comparing the effect of the recombinant Trypanosoma cruzi Calreticulin (rTcCRT) and their two domains, N and S, in scarring wounds in vitro, with rat dermal fibroblasts. Complete rTcCRT showed a higher percentage of cell migration compared to N and S domains. On the other hand, N and N+S domains induced grater increase in the number of viable cells. These results suggest that the N-terminal domain stimulates cell proliferation and C-domain, is possible responsible for the induction of cell migration by rTcCRT. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11130257.

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / El endometrio es un tejido que requiere de la acción de los esteroides para su correcta función; de modo que patologías que alteren la concentración de esteroides inducen fallas en la fisiología endometrial, como es el caso del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS). Los endometrios de mujeres con PCOS (PCOSE) presentan un incremento de los procesos de proliferación celular, caracterizados por altos niveles de proteínas ciclina D1, Ki67 y disminución de p27. En este contexto, se sabe que los estrógenos generan efectos pro-proliferativos en el tejido endometrial. Los esteroides pueden ser originados por la metabolización intratisular (origen intracrino) desde precursores como la DHEAS que son convertidos en esteroides con actividad estrogénica y/o androgénica. Para esto se requiere que los precursores sulfatados ingresen a las células a través de transportadores de las familias OATPs y OATs. Además, se necesita la expresión y actividad de enzimas que metabolizan los esteroides. Previamente, hemos reportado que en PCOSE existe un incremento en la metabolización de DHEA a androstenediol, un metabolito con actividad estrogénica. En el presente trabajo se propuso como objetivo general evaluar si el ingreso a la célula de esteroides sulfatados a través de transportadores y su metabolización intracelular está alterado en endometrio de mujeres con PCOS. Además, establecer si esto genera altas concentraciones intracelulares de esteroides que permitan el incremento del proceso de proliferación celular. Para ello, se propuso dos modelos, uno ex vivo y un modelo in vitro con células de la línea T-HESC, St-T1b y células endometriales obtenidas desde cultivo primario. Para el primer objetivo específico se determinó que existe un incremento de los niveles de androstenediol en PCOSE al compararlo con controles (CE) (p=0,002). Además, se evaluó la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) en los tejidos en estudio, no detectándose diferencias significativas. En el segundo objetivo específico se analizó la expresión y actividad de los transportadores OATP-B, D y E, y OAT4 en el modelo ex vivo e in vitro, por western blot, RT-PCR convencional y ensayo de captación de DHEAS. En el modelo in vitro se utilizó estímulos con androstenediol, testosterona y estradiol. Se determinó que los niveles proteicos de los transportadores OATP-B y OATP-E están incrementados en PCOSE versus CE (p=0,049 y p=0,007, respectivamente). Los ensayos in vitro de la actividad de transportadores nos permitieron determinar que existe un menor ingreso de DHEAS en células estimuladas con testosterona (p=0,02). Los niveles proteicos de OATP-E se ven disminuidos con los estímulos de androstenediol y testosterona (p=0,04 y p=0,04, respectivamente). El tercer objetivo tenía la finalidad de determinar si altas concentraciones de esteroides (androstenediol, testosterona y estradiol) por 48 h modifican los procesos de proliferación celular en células de la línea T-HESC y St-T1b. Para esto se utilizó las técnicas de western blot, inmunocitoquímica y citometría de flujo. Se determinó que estímulos con estradiol y androstenediol incrementan los niveles de ciclina D1 (p<0,05) y disminuyen los niveles del represor de ciclo celular p27 (p<0,05); además, androstenediol aumenta el porcentaje de núcleos positivos a Ki67 en células St-T1b (p=0,05). Por otro lado, el estímulo con testosterona por 48 h disminuye los niveles de Ki67 y de ciclina D1, e incrementa los de p27 (p<0,05). Sin embargo, estos estímulos no modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular, evaluado por citometría de flujo. Finalmente, con el cuarto objetivo se evaluó los posibles mecanismos involucrados que generarían los cambios en las moléculas reguladoras del ciclo celular dadas en el modelo in vitro. Para eso, mediante la técnica de western blot, se evaluó las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K/Akt, además se utilizó inhibidores de estas vías, antagonistas de receptores de estrógenos y andrógenos, y un inhibidor de RNA polimerasa II. Se determinó que androstenediol es capaz de incrementar los niveles de fosforilación de ERK1/2 y de Akt con los estímulos de 48 h (p<0,05), pero no así con estímulos de 20 min. Por otro lado, testosterona por 48 h disminuye la activación de la vía PI3K-Akt (p<0,05). La utilización de antagonistas de receptores de estrógenos (ICI 182,780 y MPP dihidrocloruro), nos permitió determinar que el efecto sobre p27 y ciclina D1 sería a través del receptor de estrógenos (ER) α (p<0,05). Adicionalmente, los cambios en las fosforilaciones desaparecen cuando está presente un inhibidor de la RNA polimerasa II (α-amanitina) (p<0,05), por lo que probablemente requiere de la transcripción de alguna o algunas proteína/s que permitan los cambios observados en los reguladores del ciclo celular. Para determinar si se requiere las vías de PI3K/Akt ó MAPK (ERK1/2), se utilizó inhibidores de PI3K (LY-194,002) y MEK1/2 (U-0126). La presencia de LY-194,002 inhibe los cambios dados por androstenediol en ciclina D1 y p27 (p<0,05), mientras que U-0126 evita solo el incremento de ciclina D1 dado por androstenediol (p<0,05). Por lo tanto, la fosforilación de Akt sería relevante para la modulación de ambas vías reguladoras del ciclo, mientras que la fosforilación de ERK1/2 sería necesaria solo para ciclina D1. El presente trabajo propone diversas metodologías para caracterizar a través de qué mecanismo se genera el incremento en la proliferación celular presente en PCOSE y el rol que tiene la intracrinología en estas alteraciones, donde androstenediol tendría un rol relevante. Los resultados obtenidos en los estudios in vitro nos permiten concluir que androstenediol potenciaría la proliferación celular, actuando como un estrógeno en nuestro modelo, a través del ER α, y que río abajo se activen las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K-Akt. Esto explicaría, en parte, la desregulación del proceso proliferativo ocurrido en PCOSE y la fisiopatología de la hiperplasia y adenocarcinoma endometrial de alta prevalencia en las mujeres con este síndrome / The endometrium is a tissue that requires the action of steroids for its adequate function; therefore, pathologies altering the concentration of steroids induced endometrial physiology failures, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS). Previous reports have indicated that the endometrium of women with PCOS (PCOSE) show increased cell proliferation processes, characterized by high levels of cyclin D1 protein, Ki67 and p27 decreased. In this context, it is known that estrogens enhance proliferation of endometrial tissue. The intratisular steroid metabolism (intracrine) from precursors such as DHEAS could convert into steroids with oestrogenic and/or androgenic activity. This requires sulfated precursors entering the cells through transporters OATs and OATPs families. Furthermore, expression and activity of steroid metabolizing enzymes is needed. We have previously reported in PCOSE an increased DHEA metabolism to androstenediol, a metabolite with estrogenic activity. In this work, it was proposed as a general objective to evaluate whether DHEAS entry the cell via sulfated steroid transporters and if intracellular metabolism is altered in the endometrium of women with PCOS. Furthermore, to establish whether this generates high intracellular concentrations of steroids that could allow the increased in the cell proliferation process. To achieve this, we proposed two models, an ex vivo and an in vitro cell line model of T-HESC and St-T1b and also, endometrial cells obtained from primary cultures. The results of the first specific objective show a significative increase in PCOSE androstenediol levels compared to controls (EC) (p=0.002). Moreover, no significant differences were detected in the activity of the enzyme 3β-HSD in the tissues under study. In the second objective, the expression and activity of transporters OATP-B, D and E, and OAT4 was tested in the model ex vivo and in vitro, western blot, RT-PCR and conventional DHEAS uptake assay. In the in vitro model, stimuli with androstenediol, testosterone and estradiol were used. It was determined that the protein levels of the transporters OATP-B and OATP-E are increased in CE versus PCOSE (p=0.049 and p=0.007, respectively). In vitro activity of transporters assays allowed us to determine that there is less uptake of DHEAS in testosterone stimulated cells (p=0.02). Protein levels of OATP-E are diminished with androstenediol and stimuli of testosterone (p=0.04 and p=0.04, respectively). The third objective aimed to determine whether high levels of steroid (androstenediol, testosterone and estradiol) for 48 h modified the cell proliferation process in T-HESC and St-T1b cell lines. To achieve this purpose, western blot, immunocytochemistry and flow cytometry techniques were used. It was determined that estradiol and androstenediol stimuli increase levels of cyclin D1 (p<0.05) and lower levels of the cell cycle repressor p27 (p<0.05); additionally, androstenediol increases the percentage of positive nuclei for Ki67 in St-T1b cells (p=0.05). On the other hand, stimulation with testosterone for 48 h affected negatively the levels of Ki67 and Cyclin D1 and positively p27 levels (p<0.05). However, these stimuli do not modify the percentage of cells in the different phases of the cell cycle assessed by flow cytometry. Finally, the fourth objective evaluated some possible mechanisms involved in changes in cell cycle regulatory molecules given in the in vitro model. For this, MAPK (ERK1/2) and PI3K/Akt levels and activity were evaluated by Western blotting. We used inhibitors of these pathways, estrogens and androgens receptors antagonists, and an inhibitor of RNA polymerase II. Androstenediol was able to increase the levels of ERK1/2 and Akt phosphorylation with the stimulus of 48 h (p<0.05), but not with stimuli of 20 min. Moreover, 48 h-testosterone stimulation decreased the activation of the PI3K-Akt (p<0.05) pathway. The use of estrogen receptor antagonists (ICI 182,780 and MPP dihidrocloruro), allowed us to determine that the effect on p27 and cyclin D1 would be through the estrogen receptor α (p<0.05). Additionally, those changes in phosphorylation disappeared when an inhibitor of RNA polymerase II (α-amanitin) was used (p<0.05). These data indicate requirement of transcription or some protein/s that allow the observed changes in cell cycle regulators. To determine whether PI3K/Akt or MAPK (ERK1/2) is required, PI3K (LY-194.002) and MEK1/2 (U-0126) inhibitors were used. The presence of LY-194.002 inhibits changes given by androstenediol in cyclin D1 and p27 (p<0.05), while U-0126 only prevents the increase of cyclin D1 given androstenediol (p<0.05). Therefore, the phosphorylation of Akt could be relevant for both modulation cycle regulatory pathways, while phosphorylation of ERK1/2 would be required only for cyclin D1. This paper proposes several methods to characterize the mechanism involved in the increased cell proliferation observed in PCOSE, where intracrinology has a role in these alterations, particularly androstenediol could have a significant role. The results obtained in the in vitro studies allow us to conclude that androstenediol could enhance cell proliferation, acting as an estrogen in our model, through estrogen receptor α, where MAPK (ERK1/2) and PI3K-Akt pathways are activated. This could explain, in part, the deregulation occurred in PCOSE proliferative process and the pathophysiology of high prevalence of endometrial hyperplasia and adenocarcinoma in women with this pathology / Conicyt Fondecyt

En el presente trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de dos isoprenoides de 10 carbonos, linalool (monoterpeno alcohol lineal) y 1,8-cineole (monoterpeno cíclico con grupo éter), sobre células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático. Se analizaron los mecanismos de acción involucrados y los efectos del tratamiento combinado de ambos monoterpenos entre sí o de cada monoterpeno con simvastatina (una estatina modelo) evaluando los posibles efectos sinérgicos de cada interacción. La actividad de los isoprenoides naturales sobre la colesterogénesis y proliferación celular se concentra en la vía del mevalonato (VM), una vía metabólica muy compleja indispensable para la homeostasis celular. Esto se debe a que la VM no solo es la vía de síntesis del colesterol, sino que además provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas de la superfamilia Ras, proteínas reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Durante el desarrollo de este trabajo se determinó la viabilidad y proliferación celular por los métodos de MTT, rojo neutro y recuento celular. En todos los casos, tanto los monoterpenos como la simvastatina inhibieron la proliferación celular, mientras que las combinaciones de a pares entre monoterpenos y cada uno de ellos con simvastatina mostraron un efecto sinérgico en dicha inhibición. Se estudió la distribución de las poblaciones en el ciclo celular, apoptosis por diferentes metodologías y la localización subcelular de Ras, a diferentes concentraciones. Tanto linalool como 1,8-cineole arrestaron el ciclo celular, principalmente en G0/G1 mientras que linalool también indujo apoptosis en células HepG2. Al combinar los compuestos se observó en gran parte de los casos una interacción sinérgica sobre la inducción de apoptosis. Linalool disminuyó los niveles de Ras en membrana plasmática y los aumentó en citosol, mientras que al combinase con simvastatina, la inhibición de la traslocación a membrana fue levemente potenciada. A través de experimentos de incorporación de 14C-acetato en lípidos en condiciones donde la proliferación no se encuentra afectada, se demostró que linalool y 1,8-cineole inhibieron la VM, probablemente a diferentes niveles. Esto resultó en una reducción de la colesterogénesis y una acumulación de intermediarios y/u otros productos finales de la vía. Las concentraciones efectivas en la inhibición de la síntesis de colesterol fueron considerablemente inferiores a las necesarias para ejercer efecto antiproliferativo, sobre todo para 1,8-cineole. En ciertos casos, los tratamientos aumentaron la incorporación de colesterol exógeno. Ambos monoterpenos afectaron la incorporación de acetato en lípidos neutros, fosfolípidos y ácidos grasos, cada uno de manera diferente. La combinación de ambos isoprenoides entre sí, o de cada uno con simvastatina, inhibió sinérgicamente la síntesis de colesterol. A bajas concentraciones linalool y 1,8-cineole bloquearon etapas específicas de la colesterogénesis mientras que a concentraciones elevadas provocaron una inhibición de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzima limitante de la velocidad de la VM. El agregado de mevalonato exógeno fue incapaz de revertir la inhibición de la proliferación promovida por ambos compuestos, lo que demuestra que la inhibición de HMGCR por sí sola no es responsable de tal efecto y refuerza la hipótesis de la inhibición a nivel de la prenilación de proteínas como principal mecanismo antiproliferativo. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de la acción de linalool y 1,8-cineole sobre la VM aportando conocimiento sobre los posibles mecanismos involucrados en su actividad anticolesterogénica y antiproliferativa. También sugieren el potencial uso de estos compuestos como una alternativa natural para ser utilizados en terapias contra cáncer y/o enfermedades cardiovasculares, ya sea solos, combinados entre sí o con estatinas.

La hormona paratiroidea (PTH) es un importante mediador de la remodelación ósea y actúa junto al calcitriol (1α,25(OH)2vitamina D3), como regulador esencial de la homeostasis del calcio y fósforo. El péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) es una poli hormona que tiene un papel importante en el desarrollo del feto y en la homeostasis de tejidos adultos actuando principalmente en forma parácrina. Puede ser expresada y secretada por varios tumores y es responsable de la hipercalcemia humoral maligna, siendo éste un signo de mal pronóstico en las neoplasias malignas. Al momento de comenzar este Trabajo de Tesis había poca información acerca del rol de PTHrP actuando como factor parácrino sobre células derivadas del cáncer colorrectal (CCR). En el presente Trabajo se evidencia que PTHrP es capaz de inducir un aumento en la proliferación celular de dos líneas celulares derivadas de CCR, las células Caco-2 y las células HCT116. Además, este efecto inducido por la hormona está modulado por las cascadas de señalización PKC, Src, Akt, ERK MAPK y β-catenina. Se observó que en las células tumorales intestinales la hormona mediante ERK MAPK desencadena el aumento de la expresión y/o activación por fosforilación de CREB/ATF-1, c-myc y ciclina D1, que son moléculas relevantes en la proliferación celular. Acorde con lo observado in vitro, los experimentos desarrollados en el modelo murino revelan que la administración continua de la hormona en forma intra-tumoral modula la expresión de los marcadores claves en la progresión del CCR ERK, ciclina D1 y CREB/ATF-1. Tanto las células tumorales intestinales normales como aquellas que sobre-expresan PTHrP responden a la acción de las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol, al menos a nivel transcripcional, disminuyendo la expresión de PTHrP. PTHrP no sólo favorece la activación de vías mitogénicas y la proliferación de las células Caco-2 y HCT116, sino que también es capaz de disminuir la sensibilidad de estas células al Irinotecán (que es una droga comúnmente utilizada para la quimioterapia del CCR) mediante las vías de ERK MAPK y β-catenina. Este trabajo aporta información original respecto al rol del análogo tumoral de PTH en células tumorales intestinales y los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta hormonal de estas células tanto in vitro como in vivo. Además, profundiza el conocimiento respecto de los mecanismos moleculares modulados por las hormonas calciotrópicas PTH y calcitriol en células tumorales intestinales. Un aporte de este Trabajo de Tesis es que al elucidar las vías de señalización que regulan los procesos inducidos por PTHrP y que favorecen la proliferación y/o quimiorresistencia, se podrían generar estrategias terapéuticas alternativas en el tratamiento del CCR cuya finalidad es inhibir la expresión de PTHrP o su mecanismo de acción en estas células tumorales. / Parathyroid hormone (PTH) is an important mediator of bone remodeling and acts together with calcitriol (1α, 25 (OH)2vitamin D3), as an essential regulator of calcium and phosphorus homeostasis. The parathyroid hormone related peptide (PTHrP) is a poly hormone that has an important role in the development of the fetus and in the homeostasis of adult tissues acting mainly through paracrine pathways. It can be expressed and secreted by several tumors and is responsible for malignant humoral hypercalcemia, which is a sign of poor prognosis in malignant neoplasms. When this Thesis Work started, there was little information about the role of PTHrP acting as a paracrine factor on cells derived from colorectal cancer (CRC). In the present work it is demonstrated that PTHrP is able to induce an increase in the cellular proliferation of two cell lines derived from CRC, Caco-2 cells and HCT116 cells. In addition, this effect is modulated by PKC, Src, Akt, ERK MAPK and β-catenin. It was observed that in the intestinal tumor cells, the hormone triggers the increase of the expression and/or activation by phosphorylation of CREB/ATF-1, c-myc and cyclin D1, which are relevant molecules in the cell proliferation, through ERK MAPK. In agreement with the observed in vitro, the experiments developed in the murine model revealed that the continuous administration of the hormone in an intra-tumoral manner modulates the expression of ERK, cyclin D1 and CREB / ATF-1, which are key markers in the progression of CRC. Both, normal intestinal tumor cells and those that over-express PTHrP respond to the action of the calcitropic hormones PTH and calcitriol, at least at the transcriptional level, by decreasing the expression of PTHrP. PTHrP not only activates mitogenic pathways and induces the proliferation of Caco-2 and HCT116 cells, but it is also capable of decreasing the sensitivity of these cells to Irinotecan (which is a drug commonly used for CRC chemotherapy) through ERK MAPK and β-catenin pathways. This work provides original information about the role of the tumor analog of PTH in intestinal tumor cells and the molecular mechanisms involved in the hormonal response of these cells, both in vitro and in vivo. In addition, this work expands the knowledge regarding the molecular mechanisms modulated by the calcitropic hormones PTH and calcitriol in intestinal tumor cells. The contribution of this Thesis work is that by elucidating the signaling pathways that regulate the processes induced by PTHrP and that contribute to the proliferation and/or chemoresistance, alternative therapeutic strategies could be generated in the treatment of CRC whose purpose is to inhibit the expression of PTHrP or its mechanism of action in these tumor cells.

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Recent advances in high throughput technology have opened the door to systematic studies of epigenetic mechanisms. One of the key components in the regulation of the cell cycle and differentiation is the retinoblastoma protein (pRB), a component of the RB/E2F tumor suppressor pathway that is frequently deregulated in cancer. The RBP2/KDM5A histone demethylase was shown to interact with pRB and regulate pRB function during differentiation. However, how precisely differentiation is coupled with halted cell cycle progression and whether an epigenetic mechanism is involved remain unknown. In the present study, I analyzed gene expression levels of human histone methyltransferases (HMT) and demethylases (HDM), as well as their targets in human cancers; and focused on RB/KDM5A connection in control of cell cycle and differentiation. In particular, I used Drosophila as a model to describe a novel mechanism where the RB/E2F pathway interacts with the Hippo tumor suppressor pathway to synergistically control cell cycle exit upon differentiation. Studying the role of miR-11, I found that the inhibition of dE2F1-induced cell death is its highly specialized function. Furthermore, I studied the induction of differentiation and apoptosis as the consequences of KDM5A deletion in cells derived from Rb knockout mice. I concluded that during differentiation, KDM5A plays a critical role at the enhancers of cell type-specific genes and at the promoters of E2F targets; in cooperation with other repressor complexes, it silences cell cycle genes. I found that KDM5A binds to transcription start sites of the majority of genes with H3K4 methylation. These are highly expressed genes, involved in certain biological processes, and occupied by KDM5A in an isoform-specific manner. KDM5A plays a unique and non-redundant role in histone demethylation and its promoter binding pattern highly overlaps with the opposing enzyme, MLL1. Finally, I found that HMT and HDM enzymes exhibit a distinct co-expression pattern in different cancer types, and this determines the level of expression of their target genes. / Los avances recientes en las tecnologías de alto flujo han abierto el camino a los estudios sistemáticos de los mecanismos epigenéticos. La proteína retinoblastoma (pRB), uno de los elementos de la ruta de supresión de tumores RB/E2F que se encuentra desregulado con frecuencia en el cáncer, es uno de los componentes esenciales de la regulación del ciclo celular y la diferenciación. Sin embargo, aún no se conoce de qué manera precisa la diferenciación se acopla a la detención del avance del ciclo celular y si hay algún mecanismo epigenético vinculado a este proceso. En este estudio, he analizado los niveles de expresión de histona metiltransferasas (HMT) y desmetilasas humanas (HDM), así como sus dianas en cánceres humanos, y me he centrado en la conexión de RB/KDM5A en el control del ciclo celular y la diferenciación. Específicamente, utilicé Drosophila como modelo para describir un mecanismo nuevo mediante el cual RB/E2F interactúa con la ruta Hippo de supresión de tumores para controlar de manera sinérgica la detención del ciclo celular relacionada con la diferenciación. Mediante la investigación del papel de miR-11, determiné que su función altamente especializada es la inhibición de la muerte celular inducida por dE2F1. Además, estudié la inducción de la diferenciación y la apoptosis como consecuencia de la pérdida de KDMA5 en células obtenidas a partir de ratones sin Rb. Extraje como conclusión que, durante la diferenciación, KDMA5 desempeña un papel esencial sobre los estimuladores de los genes específicos de los tipos celulares, así como en los promotores de las dianas de E2F; en cooperación con otros complejos represores silencia a los genes del ciclo celular. Investigué el mecanismo de reclutamiento de KDM5A y encontré que se une al sitio de inicio de la transcripción de la mayoría de los genes que poseen metilación en H3K4. Estos genes tienen elevados niveles de expresión, están involucrados en determinados procesos biológicos y están ocupados por diferentes isoformas de KDM5A. KDM5A desempeña un papel único y no redundante en la desmetilación de las histonas y que en gran medida se solapa con la enzima con la función opuesta, MLL1. Para terminar, encontré que las enzimas HMT y HDM muestran patrones de co-expresión distintos en diferentes tipos de cáncer, y que este hecho determina los niveles de expresión de sus genes diana.