La protéine E4orf4 de l’adénovirus humain est membre d’une famille de facteurs tumoricides, qui induisent la mort cellulaire des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales. Il a été montré que dans les cellules transformées, E4orf4 induit un programme de mort cellulaire non apoptotique dépendante des kinases Src et d’une dérégulation de la dynamique d’actomyosine. Cette activité toxique d’E4orf4 est déterminée notamment par sa localisation intracellulaire : E4orf4 est initialement nucléaire, puis elle s’accumule graduellement dans le cytoplasme où elle initie un remodelage atypique du cytosquelette d’actine associé à la mort cellulaire. L’inhibition de l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4 empêche également le remodelage de l’actine, et vice versa. Il existe donc un lien fonctionnel entre la dynamique subcellulaire d’E4orf4, le remodelage du réseau d’actine, et l’activité toxique d’E4orf4 ; toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués demeurent peu compris. Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour but d’identifier les effecteurs cellulaires contrôlant la localisation d’E4orf4 et d’étudier leur implication dans son activité tumoricide. Des analyses protéomiques ont identifié la protéine de polarité Par3 (PARD3) comme un partenaire d’E4orf4 requis pour l’induction de son activité toxique dépendante de l’actine. Les résultats suggèrent que Par3 et ses partenaires formant le complexe de polarité Par sont impliqués dans le remodelage d’un réseau périnucléaire d’actomyosine dans les cellules tumorales. Ce phénomène stimule la formation et la rupture de blebs de noyau, menant à des bris transitoires de l’enveloppe nucléaire et permettant l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4. D’autre part, nous avons mis en évidence qu’E4orf4 stimule le recrutement du cochaperon BAG3 et de la machinerie autophagique aux sites de formation des blebs nucléaires. Les résultats suggèrent qu’une voie autophagique dépendante de BAG3 est induite en réponse à E4orf4 afin de faire face au stress mécanique, laquelle pourrait contribuer à maintenir l’intégrité et/ou à réparer l’enveloppe nucléaire après sa rupture. En outre, Par3 et BAG3 contribuent également au remodelage de l’enveloppe nucléaire induit par une diminution de sa rigidité par déplétion des lamines en absence d’E4orf4. Ces résultats suggèrent qu’ils participent à la régulation normale de la mécanique nucléaire dans les cellules cancéreuses. iv Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse appuient un rôle inconnu jusqu’alors pour Par3 et BAG3 dans la plasticité de l’enveloppe nucléaire, qui émerge comme un processus important de la biologie des cellules cancéreuses, contribuant notamment à la migration et à l’invasion tumorale. Cette voie de remodelage du noyau impliquant Par3 et BAG3 pourrait offrir de nouvelles opportunités pour le développement de thérapies moléculaires ciblées. / The human adenovirus E4orf4 protein is considered as a tumoricidal factor, as it induces cell death in tumor cells while exhibiting low toxicity in non-transformed cells. It was demonstrated that E4orf4 engages a non-apoptotic cell death program, which depends on Src-family kinases and perturbations of actomyosin dynamics. This toxic activity relies on E4orf4 localization dynamics: while E4orf4 is initially nuclear, it gradually accumulates in the cytoplasm where it initiates an atypical remodeling of the actin cytoskeleton associated with cell death. Inhibition of E4orf4’s cytoplasmic accumulation also inhibits actin remodeling, and vice versa. Thus, current data support a functional connection between E4orf4’s subcellular dynamics, actin remodeling, and E4orf4-induced cell death in tumor cells; however, the molecular mechanisms involved are misunderstood. The work presented in this thesis was aimed at identifying key cellular effectors that control E4orf4’s localization dynamics and interrogating their role in the regulation of E4orf4’s tumoricidal action. We identified the polarity protein Par3 (PARD3) as a binding partner of E4orf4 that is required for the induction of its actin-dependent toxic activity, using proteomic, biochemical and cellular approaches. The results suggest that Par3 and the other Par complex proteins are involved in E4orf4-induced remodeling of the perinuclear actin network in tumor cells. The resulting increase in perinuclear contractility stimulates the formation and rupture of nuclear blebs, leading to transient breaks in the nuclear envelope, cytoplasmic accumulation of E4orf4, and loss of nuclear compartmentalization. Moreover, we found that E4orf4 triggers the recruitment of the co-chaperone BAG3 and the autophagic machinery at nuclear blebs formation sites. The results suggest that a BAG3-dependent autophagy pathway is induced in response to E4orf4 to cope with mechanical stress, which could participate in maintaining the integrity and/or repairing the nuclear envelope after its rupture. Furthermore, Par3 and BAG3 also regulate nuclear envelope remodeling and integrity in cells depleted of lamins, suggesting that these E4orf4 targets may be bona fide regulators of nuclear mechanics in cancer cells. Thus, the results presented in this thesis support a so-far unappreciated role for Par3 and BAG3 in nuclear envelope plasticity, which emerges as a crucial process regulating cancer vi cell biology, notably during tumor cell migration and invasion. This nuclear remodeling pathway involving Par3 and BAG3 could offer new opportunities for the development of targeted molecular therapies.

Plusieurs réponses cellulaires aux stimuli extracellulaires sont transmises par des voies de signalisation qui agissent en aval de récepteurs membranaires tels les récepteurs tyrosine kinase (RTK). Les signaux provenant des RTK sont souvent relayés via des protéines adaptatrices comme NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) et NCK2 dont les fonctions sont considérées redondantes et indissociables. Toutefois, certaines études suggèrent que chacune de ces deux protéines pourraient avoir des cibles cellulaires spécifiques et des fonctions uniques. L’objectif de mon projet de doctorat était d’analyser la spécificité des protéines NCK1/2, c’est-à-dire d’identifier pour chacune des cibles uniques, pour ensuite caractériser ce qui génère cette spécificité tout en définissant la fonction de ces interactions. En premier lieu, j’ai utilisé deux techniques complémentaires de protéomique, soit (i) des purifications d’affinité (AP) et (ii) du marquage de proximité in vivo (BioID) suivies d’analyses en spectrométrie de masse (MS) afin de caractériser les interactomes respectifs de NCK1/2. La combinaison de ces deux approches m’a permis d’identifier plus d’une centaine d’interactions spécifiques pour chaque NCK. Des analyses bio-informatiques basées sur ces résultats m’ont permises de mettre en évidence que NCK2 semble plus spécifiquement impliquée que NCK1 dans la régulation de l’organisation du cytosquelette d’actine, structure essentielle lors de la division et de la cytokinèse. En comparant simultanément des cellules fibroblastiques murines (MEF) déplétées soit pour NCK1, soit pour NCK2, j’ai remarqué que les cellules Nck2-/-, à l’inverse des cellules Nck1-/- étaient plus multinucléées et présentent un midbody altéré en longueur. Également, j’ai remarqué une altération dans la composition du midbody des cellules Nck2-/- tel que suggéré par l’absence dans cette structure des protéines Polo-like kinase1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) ou encore Aurora B (AURKB), régulateurs clefs de la cytokinèse. Finalement, j’ai montré que la fonction de NCK2 durant la cytokinèse repose principalement sur son domaine SH2. Dans un deuxième temps, j’ai sélectionné 27 partenaires identifiés en MS et confirmé par une méthode orthogonale leurs interactions respectives avec NCK1 et/ou NCK2. Grâce à des tests de liaison in vitro, j’ai déterminé que plusieurs protéines dont la Plakophiline 4 (PKP4), un régulateur de la cytokinèse, lient directement et spécifiquement NCK2. Par différentes expériences in vitro, j’ai pu déterminer que NCK2 lie les portions N-terminale et centrale de PKP4 grâce à son domaine Src Homology (SH) 2 et que la spécificité de NCK2 envers PKP4 ne semble pas dépendre seulement des propriétés intrinsèques du SH2. L’association résulte plutôt de la combinaison d’une partie ou de l’ensemble des propriétés des domaines et régions interdomaines constituant les protéines NCK1/2. En conclusion, bien que les fonctions de NCK1/2 soient généralement considérées comme redondantes, mes résultats démontrent que ces protéines sont capables de lier des partenaires différentspour réguler des fonctions biologiques distinctes. Ainsi, mes travaux suggèrent que NCK2 semble spécifiquement requise lors du processus de cytokinèse. De plus, l’ensemble de mes expériences in vitro apporte une première idée du mécanisme de spécificité des protéines NCK1/2 en suggérant que leur spécificité ne semble pas entièrement provenir des propriétés intrinsèques de leurs domaines individuels, mais plutôt d’une combinaison des propriétés de leurs domaines et/ou régions interdomaines respectives. / Signals from cell surface receptors are often relayed via adaptor proteins that can serve as hubs to recruit appropriate target signaling molecules and guide signals along specific pathways. Among these, adaptor proteins NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) and NCK2 have functions that are often considered redundant and/or indistinguishable. The main goal of my work was to demonstrate that NCK1 and NCK2 are not fully redundant and may each display functional specificity. To achieve this, I delineated NCK1-and NCK2-specific signalling networks, identified for each unique target, then characterized what generates this specificity and obtained the function of these interactions. First, to identify the complement of interaction partners for NCK1 and NCK2, I used two unbiased mass spectrometry (MS)-based approaches: (i) epitope-tagged protein affinity purification (AP) followed by MS analysis and (ii) in vivo proximity labelling (BioID). The combination of these two approaches allowed me to identify more than one hundred specific interactions for each NCK. Bioinformatics analyzes based on the specific partners identified in MS enabled me to highlight that NCK2 was more specifically involved in the regulation of the actin cytoskeleton organization, structure essential for cell division and cytokinesis. By simultaneously comparing mouse embryo fibroblasts (MEF) depleted either for NCK1 or NCK2, I noticed that Nck2-/-, but not Nck1-/-cells are multi-nucleated and display extended protrusions reminiscent of intercellular bridges, which correlate with an extended time spent in cytokinesis as well as a failure of a significant proportion of cells to complete abscission. Further analysis of this phenotype revealed that the midbody of NCK2-deficient cells is not only increased in length, but also altered in composition, as judged by the mislocalization of the Polo-like kinase 1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) and Aurora B (AURKB) proteins. Moreover, I showed that NCK2 function during cytokinesis requires its SH2 domain. Second, to underline the molecular mechanism of specific protein complex formation, I selected based on my MS results 27 partners to confirm by an orthogonal method their respective interactions with NCK1 and/or NCK2. By using in vitro binding assays, I was able to determine that several proteins including Plakophilin 4(PKP4), a key regulator of the cytokinesis process, were able to bind directly and specifically to NCK2. Through various in vitro experiments, I was able to determine that NCK2 binds the N-terminal and central portions of PKP4 through its SH2 domain and that the specificity of PKP4 toward NCK2 does not appear to result from the intrinsic properties of its SH2 alone. This association seems to result from the combination of some or all of the properties of the individual domains and inter-regions constituting the NCK1/2 proteins. In conclusion, despite what is generally accepted, I showed that both NCK1 and NCK2 may form specific protein complexes, thus reflecting the functional specificity of these two adaptor proteins. I further demonstrated that NCK1 and NCK2 are not completely redundant. I also shed light on a previously uncharacterized function for the NCK2 adaptor protein in cell division. Finally, my in vitro experiments provide an explanation for the specificity mechanism of NCK1/2 adaptor proteins by suggesting that their specificity come from the combination of the properties of their respective domains and/or interdomain regions.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / L’obésité et ses complications telles le diabète et la stéatose hépatique non alcoolique sont des enjeux de santé qui prennent de plus en plus d’ampleur partout sur la planète et la compréhension approfondie des mécanismes physiopathologiques impliqués est essentielle pour mieux contrer ces maladies. La protéine peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) est reconnue pour ses propriétés antiinflammatoires, insulino-sensibilisantes et pro-adipogéniques. Des résultats antérieurs ont démontré qu’en l’absence de la protéine tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase- 1 (Shp1), l’activité de PPARγ est augmentée. L’activation de PPARγ par ses agonistes, les thiazolidinediones (TZD), est favorable au contrôle du diabète, mais entraîne certains effets indésirables. Nos recherches ont porté sur l’investigation d’une nouvelle voie de régulation de PPARγ. Nous avons montré que Shp1 et PPARγ interagissent et que PPARγ est phosphorylé sur ses résidus tyrosine. Les résultats suggèrent que la déphosphorylation de PPARγ par Shp1 diminue son activité. Des analyses de modélisation moléculaire suggèrent que cette interaction entre Shp1 et PPARγ dépend de la présence de phosphorylation sur un acide aminé particulier, la tyrosine 355. Ce même résidu est aussi important dans la liaison avec la rosiglitazone, médicament de la classe des TZD. Des expériences de mutagénèse ont montré que l’absence de phosphorylation sur la tyrosine 355 diminue grandement l’activité de la protéine et, qu’à l’inverse, la présence de phosphorylation tend à augmenter son activité. Bien que plusieurs modifications post-traductionnelles aient été décrites dans la littérature, la phosphorylation sur tyrosine de PPARγ demeure très peu étudiée. Nos résultats suggèrent une nouvelle voie de régulation de PPARγ qui pourrait mener à l’élaboration de nouveaux ligands qui exploitent ce mécanisme afin de favoriser les propriétés bénéfiques de ce facteur transcriptionnel pour mieux traiter le diabète de type 2 et diminuer les risques d’effets secondaires. / Obesity and its complications such as type 2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease are becoming worldwide health concerns and more insights into the underlying physiopathological mechanisms are necessary to improve the treatment of these conditions. Peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ) protein is well known for its anti-inflammatory, insulin sensitizing and pro-adipogenic roles. Previous results showed that in absence of the protein tyrosine phosphatase Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1 (Shp1), PPARγ activity is increased. PPARγ activation by thiazolidinediones (TZD) is used in the control of diabetes but is also linked to unwanted side effects. We investigated a new mechanism of regulation of PPARγ activity. We show that Shp1 and PPARγ interact and that PPARγ is tyrosine phosphorylated. Our results suggest that Shp1-mediated dephosphorylation of PPARγ reduces its activity. Molecular modeling analyses further suggest that the interaction between Shp1 and PPARγ depends upon the phosphorylation of one specific residue, tyrosine 355. This residue is also important for the binding with rosiglitazone, a member of the TZD drug class. Mutagenesis experiments showed that the absence of phosphorylation on tyrosine residue 355 decreases PPARγ activity, while its phosphorylation tends to increase it. Despite the fact that many post-translational modifications have been reported in the literature, tyrosine phosphorylation of PPARγ remains mostly unexplored. These results suggest a new PPARγ regulating mechanism that could be exploited to elaborate new PPARγ ligands to improve the treatment of type 2 diabetes and to limit side effects.

L’Anémie de Fanconi est une pathologie génétique rare qui se caractérise par une anémie aplasique, des malformations congénitales de sévérité variable et un risque accrue au développement de cancers. En particulier, les patients atteints d’Anémie de Fanconi développent des carcinomes squameux de la tête et du coup. La protéine FANCC est l’une des 21 protéines Fanconi connues à ce jour. Il a déjà été montré que FANCC possède de nombreux rôles en dehors de celui de la réparation de l’ADN. Ici, nous nous sommes intéressés au rôle de FANCC dans la régulation de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation est souvent dérégulée dans les cancers. Nous avons pu montrer que des formes mutantes de FANCC régulent la quantité de β-caténine libre via son interaction avec le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. En effet, en interagissant avec l’une des protéines du complexe, la protéine APC, les formes mutantes de FANCC permettent d’augmenter la quantité de cette protéine, ainsi que de la protéine d’assemblage du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, Axin-1. On observe ainsi une diminution importante de la quantité de β-caténine libre, ainsi que de β-caténine au noyau, entrainant une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de la β-caténine. Parmi ces cibles, l’oncogène c-Myc, codant pour un facteur de transcription connu pour réprimer la transcription de DKK1. Or, il a été montré que le niveau d’expression de DKK1 est plus élevé dans les cellules mutantes pur FANCC. Nous avons, effectivement, pu confirmer que l’expression de DKK1 est inverse de celle de la protéine c-Myc dans les fibroblastes de peau dérivés de patients Fanconi. De manière intéressante, si l’expression de la protéine c-Myc est diminué dans les fibroblastes mutants pour FANCC, en comparaison aux fibroblastes exprimant un FANCC sauvage, nous n’avons pas observé de variation dans l’expression de c-Myc dans des cellules de carcinomes squameux dérivées de patient mutant pour FANCC et complémentées en FANCC. Ainsi, la surexpression des protéines Axin-1 et APC dans les cellules mutantes pour FANCC induit un défaut d’accumulation de la β-caténine dans ces cellules, conduisant à une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de cette protéine. De plus, la réexpression de la protéine c-Myc dans les cellules de carcinomes squameux dérivées de patient, mutées pour FANCC, permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques, comme la protéine CT120. Cette dernière est une protéine membranaire, régulée par c-Myc qui est impliquée dans 2 voies de signalisation fréquemment dérégulées dans des cancers, et en particulier dans les carcinomes squameux de la tête et du coup. Ce type de cancers est particulièrement problématique à la fois chez les patients Fanconi, mais également dans la population générale. En effet, les carcinomes squameux de la tête et du coup représentent la 5ième cause de mortalité causée par le cancer dans le monde. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disorder characterized by bone marrow failure, physicals abnormalities and a high risk of cancers. Specifically, the FA patients develop head and neck squamous cell carcinoma. The FANCC protein is one of the 21 FA proteins. It was already shown that FANCC have numerous functions in addition of the DNA repair. We investigate about the role of FANCC in the Wnt/β-catenin regulation. The signaling pathway is known for its involvement in carcinogenesis. We show that mutants of FANCC regulate the free β-catenin level, interacting with APC, a protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. Indeed, this interaction leads to an increasing of the levels of APC and Axin-1, the scaffold protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. The decreasing of free β-catenin leads to the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets, including c-Myc. The protein coded by c-Myc is a transcriptional factor known for repressing DKK1 expression. It was previously shown that there is an increase expression of DKK1 in FA mutant cells. And we show that the expression of DKK1 is opposite of the expression of c-Myc in FA patient derived fibroblasts. Interestingly, the expression of c-Myc is decreased in FANCC mutant patient derived fibroblasts, compare to the complemented cells, but there is no difference in the c-Myc level between patient derived squamous cell carcinoma cells mutant for FANCC and complemented cells. We hypothesize that the increased levels of APC and Axin-1, leading the decreased level of activated β-catenin and the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets in FANCC mutant cells is a protecting mechanism against the cells transformation. Furthermore, this expression of c-Myc in patient derived squamous cell carcinoma cells, open to new therapeutic targets, as CT120. This protein is a membranous protein, regulate by c-Myc, involved in 2 signalization pathways deregulated in cancers, including head and neck squamous cell carcinoma. This kind of cancer is a health care issue; indeed, this cancer is the 5th death cause related to cancer in the general population.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les cellules tumorales malignes accumulent des altérations génétiques qui favorisent une plasticité nucléaire accrue et l'invasion tumorale. La réorganisation des réseaux d'actomyosine cause une augmentation des forces mécaniques qui sont transmises à l'enveloppe nucléaire par des connexions physiques. Ces connexions physiques permettent aux cellules d'ajuster la réponse nucléaire aux stress du microenvironnement tumoral, incluant les carences d'espace et de nutriments, et d'induire une réponse cellulaire adaptative pour échapper à ces contraintes. En outre, ces forces mécaniques causent souvent des ruptures de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorales. Ces ruptures nucléaires pourraient favoriser les déformations nucléaires requises durant la migration cellulaire à travers les espaces serrés de la matrice extracellulaire. Remarquablement, les cellules tumorales survivent à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire grâce à des mécanismes de réparation efficaces. Cependant, les ruptures nucléaires répétées causent une accumulation de dommages à l'ADN et pourraient contribuer à l'acquisition d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, élucider les mécanismes moléculaires régulant les processus de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire pourrait identifier des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrecarrer l'invasion tumorale. La protéine adénovirale E4orf4 induit une activité toxique sélective chez les cellules tumorales. Cependant, les bases moléculaires de l'action sélective d'E4orf4 demeurent méconnues. Il a été démontré qu'E4orf4 réorganise le réseau d'actomyosine à proximité du noyau et provoque des déformations nucléaires dramatiques. Nous avons émis l'hypothèse que la protéine adénovirale E4orf4 exerce une activité toxique sélective dans les cellules tumorigéniques en perturbant la forme et la dynamique nucléaire, notamment via sa capacité à déréguler l'organisation du cytosquelette d'actine. L'objectif général de ces travaux de thèse est d'étudier la contribution des changements de forme et de dynamique nucléaire dans l'activité toxique d'E4orf4 et les mécanismes impliqués. La prémisse est que les cibles cellulaires d'E4orf4 réguleraient le remodelage de l'enveloppe nucléaire par les forces mécaniques et la plasticité nucléaire. Afin d'adresser cette hypothèse, les effets d'E4orf4 sur le réseau périnucléaire d'actine et sur l'organisation de l'enveloppe nucléaire, de même que les effecteurs cellulaires impliqués, ont été étudiés dans une variété de lignées cellulaires tumorigéniques et non-tumorigéniques. Les travaux présentés au Chapitre 1 indiquent qu'E4orf4 perturbe l'organisation de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorigéniques seulement, d'une manière qui dépend du recrutement de fibres contractiles à l'enveloppe nucléaire. Ce processus requiert son association avec la protéine de polarité Par3 et la transmission des forces mécaniques à l'enveloppe nucléaire par le complexe LINC. Remarquablement, cette activité toxique sélective d'E4orf4 est associée à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire provoquant une perte de l'intégrité nucléaire chez une proportion significative de cellules. De plus, les travaux présentés au Chapitre 2 identifient le régulateur épigénétique Ash2L comme substrat de la tyrosine kinase oncogénique Src dont la signalisation est perturbée par E4orf4 qui modifie la réponse nucléaire au stress mécanique. Des analyses moléculaires, biochimiques et fonctionnelles ont révélé que la phosphorylation d'Ash2L par Src est dérégulée par E4orf4 et qu'elle augmente la résistance du noyau aux ruptures de l'enveloppe nucléaire induites soit par E4orf4 ou par un affaiblissement de la lamina nucléaire. De plus, Ash2L régule également les ruptures nucléaires causées par les contraintes physiques appliquées lors de la migration cellulaire sous confinement. Ensemble, ces travaux ont permis d'identifier deux nouvelles cibles cellulaires d'E4orf4, Par3 et Ash2L, qui régulent son action toxique sélective, laquelle est caractérisée par l'induction de ruptures nucléaires répétées. En outre, nos travaux suggèrent que les cibles d'E4orf4 sont des régulateurs authentiques des ruptures nucléaires par le stress mécanique. Ces travaux établissent E4orf4 comme un nouveau paradigme pour étudier les mécanismes qui contrôlent les évènements de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire et la plasticité nucléaire qui ont un effet sur les propriétés métastatiques des cellules tumorales. / Malignant tumor cells accumulate genetic alterations that increase nuclear plasticity and tumor invasion. Reorganization of actomyosin networks increases cellular contractility and mechanical forces that are transmit to the nuclear envelope through physical connections. These physical connections enable the cells to adjust their nuclear response to microenvironmental stress, including space and nutrient deficiencies, and to induce an adaptive cellular response to escape these stresses. In addition, these mechanical forces often cause ruptures of the nuclear envelope in tumor cells. Notably, nuclear ruptures are thought to facilitate the nuclear deformations required during cell migration through the tight spaces of the extracellular matrix. Remarkably, tumor cells can survive repeated nuclear ruptures using efficient nuclear envelope repair mechanisms. However, repeated nuclear ruptures cause DNA damage accumulation and could contribute to a more invasive tumor cell phenotype. Thus, understanding the biology of nuclear envelope rupture and repair processes is therapeutically relevant. The adenoviral protein E4orf4 exerts tumor cell selective killing. However, the molecular basis for the selective action of E4orf4 remains poorly understood. E4orf4 has been shown to reorganize the actomyosin network near the nucleus and to cause dramatic nuclear deformations. We hypothesized that E4orf4 exerts a selective toxicity by disrupting the nucleus' shape and dynamics, notably through its capacity to deregulate the actin cytoskeleton organization. The general objective of this thesis work is to study the contribution of the modifications of the nucleus' shape and dynamics in the cytotoxic activity of E4orf4, and identify the mechanisms involved. The premise is that the cellular targets of E4orf4 would regulate the remodeling of the nuclear envelope by mechanical forces and nuclear plasticity. In order to address this hypothesis, we analyzed the effects of E4orf4 on the perinuclear actin network and on the organization of the nuclear envelope in a variety of tumorigenic and non-tumorigenic cell lines and identified the cellular effectors involved. The work presented in Chapter 1 indicates that E4orf4 disrupts the organization of the nuclear envelope in tumorigenic cells only, in a manner that depends on the recruitment of contractile actin fibers at the nuclear envelope surface. This process requires its association with the polarity protein Par3 and the transmission of mechanical forces to the nuclear envelope by the LINC complex. Remarkably, this selective toxic activity of E4orf4 is associated with repetitive ruptures of the nuclear envelope causing a loss of nuclear integrity in a significant proportion of the cells. In addition, the work presented in Chapter 2 identifies the epigenetic regulator Ash2L as a novel substrate of the oncogenic tyrosine kinase Src, that is targeted by E4orf4 and that modifies the nuclear response to mechanical stress. Molecular, biochemical and functional analyzes revealed that Src-mediated Ash2L Tyr phosphorylation is deregulated by E4orf4 and increases the nuclear mechanical resistance to the mechanical stress induced by E4orf4 or lamin A/C deficiency. In addition, Ash2L also regulates nuclear ruptures caused by physical constraints during confined cell migration. Together, this work has identified two novel cellular targets of E4orf4, Par3 and Ash2L, regulating its tumor cell-selective action that is characterized by the induction of repetitive nuclear ruptures. Importantly, these studies suggest that E4orf4's targets are bona fide regulators of nuclear ruptures induced by mechanical stress in tumorigenic cells. This thesis work establishes E4orf4 as a new paradigm for studying the mechanisms controlling nuclear envelope rupture and repair events and nuclear plasticity, which are relevant for the metastatic properties of tumor cells.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La protéine multifonctionnelle p54nrb , enrichie dans un nouveau domaine nucléaire nommé paraspeckles, fait partie de complexes de transcription/épissage comprenant l'ARN polymérase II et son partenaire PSF. Des travaux récents effectués dans notre laboratoire montrent que p54nrb est phosphorylée en mitose (Proteau A., Blier S., Albert A.L., Lavoie S.B., Traish A. M. and Vincent M. (2005) J. Mol. Biol. 346, 1163-1172). La phosphorylation est une modification post-traductionnelle pouvant affecter la localisation cellulaire d'une protéine, ses interactions, sa dégradation et son activité. Pour étudier l'impact de la phosphorylation mitotique de p54nrb , sa localisation cellulaire a été comparée en interphase et en mitose par immunofluorescence indirecte. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter sa localisation aux paraspeckles en mitose. Ensuite, ses interactions dans le complexe transcription/épissage ont été vérifiées en mitose par immunoprécipitation et pulldown. Les résultats ont montré que la phosphorylation ne semble pas affecter le complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II en mitose in vitro. Des analyses biochimiques ont finalement montré que la phosphorylation de p54nrb ne semble pas non plus empêcher son association à la matrice nucléaire. L'étude antérieure, citée précédemment, a également montré que p54nrb est reconnue par la peptidyl-prolyl isomérase Pinl en mitose. La juglone, un inhibiteur enzymatique de Pinl, a été utilisée pour évaluer l'effet de l'interaction de Pinl sur le niveau de phosphorylation de p54nrb . Les résultats ont montré que l'inhibition de Pinl empêche la déphosphorylation de p54nrb à la fin de la mitose ainsi que celle de PSF, nouveau substrat de Pinl. La protéine Pinl pourrait réguler chaque membre du complexe p54nrb-PSF-ARN polymérase II à la reprise du cycle cellulaire.

Haxl joue un rôle important dans les syndromes d'immunodéficience et l'apoptose. Une étude récente suggère que Haxl, une protéine membre de la famille Bcl-2, inhibe l'apoptose dans les neurones et les lymphocytes, via un mécanisme impliquant sa liaison avec PARL, la protease rhomboïde de la membrane mitochondriale, ce qui active par protéolyse la serine protease Omi/HtrA2 et élimine Haxl actif. Ce modèle indique que la sensibilité des cellules aux stimuli pro-apoptotiques est contrôlée par le complexe PARL/Haxl de l'espace intermembranaire de la mitochondrie. D'une manière plus globale, les protéines membres de la famille Bcl-2 pourraient contrôler la perméabilité de la membrane mitochondriale externe à partir de l'intérieur de la mitochondrie. De plus, ce modèle définit une nouvelle voie anti-apoptotique de PARL, indépendante de Opal. Dans la présente étude, nous montrons que, in vivo, l'activité de Haxl ne peut pas être couplée à PARL, car les deux protéines sont dans des compartiments cellulaires différents, et leur interaction in vitro est un artefact. Par une analyse de séquence et de prédiction de structure secondaire, nous montrons aussi que Haxl n'est pas membre de la famille Bcl-2, en raison de l'absence des modules d'homologie de Bcl-2. Ces résultats indiquent la présence de fonctions et de mécanismes différents de Haxl dans l'apoptose, et ouvrent de nouvelles questions sur la capacité de PARL de réguler, en plus de l'apoptose, le stress mitochondrial via une voie Omi/HtrA2 dépendante.

Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.