L’enveloppe des bactéries à Gram négatif est composée de plusieurs polysaccharides dont certains, comme le peptidoglycane et les lipopolysaccharides, sont essentiels à leur survie et sont impliqués dans les interactions entre ces bactéries et leur environnement (e.g. résistance à des agents antimicrobiens et reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte). La biosynthèse de ces polymères nécessite la translocation de leurs sous-unités à travers la membrane interne, ce qui requiert un lipide "porteur", l’undécaprényl phosphate (C55-P). Ce lipide est formé par la déphosphorylation de son précurseur, l’undécaprényl pyrophosphate (C55-PP), qui est lui-même généré par synthèse de novo ou par un recyclage. Chez Escherichia coli, les protéines membranaires BacA, YbjG, PgpB et LpxT présentent une activité C55-PP phosphatase et participe donc de façon redondante au recyclage du C55-P. Pour mieux comprendre le rôle physiologique spécifique de ces protéines dans la biogénèse de l’enveloppe, notre travail a porté sur l’étude des mécanismes d’action, de la fonction et de la régulation de deux de ces enzymes, PgpB et LpxT.L’activité de la protéine PgpB a été caractérisée in vivo et in vitro afin de mieux comprendre son rôle et sa capacité à participer à deux voies métaboliques essentielles, le recyclage du C55-P et la biosynthèse du phosphatidylglycérol. Nous avons mis en évidence des résidus d’acides aminés qui étaient essentiels à la catalyse des deux substrats naturels et d’autres qui n’avaient pas le même rôle dans l’hydrolyse des deux substrats, nous permettant de proposer des mécanismes différenciés. En outre, des données calorimétriques ont montré que PgpB pouvait être grandement stabilisée par la liaison d’un substrat. Hypothétiquement, le changement structural sous-jacent serait susceptible de libérer de l’énergie mobilisée pour le flip du produit à travers la membrane. La protéine LpxT est responsable d’une modification constitutive des lipopolysaccharides en transférant le phosphate libéré du C55-PP sur la partie lipide A. Dans certaines conditions de stress, l’activité de LpxT est spécifiquement inhibée par un petit peptide (PmrR) pour permettre à d’autres modifications de s’opérer. Nous avons montré que la modification catalysée par LpxT était déterminante pour permettre à E. coli de résister aux acides biliaires et de coloniser efficacement le tractus intestinal de l’hôte. LpxT constitue ainsi un point de contrôle clé chez E. coli pour résister à différent agents antimicrobiens qui ciblent les lipopolysaccharides mais qui possèdent des propriétés physico-chimiques opposées. En outre, nous avons montré que LpxT et PmrR formaient un complexe stable mais que de façon inattendue, cette liaison n’inhibait pas l’activité phosphotransférase de l’enzyme in vitro. Nous proposons que PmrR inhibe l’activité de LpxT in vivo en modifiant sa capacité à interagir avec ses partenaires de la voie de biosynthèse des lipopolysaccharides. La biogénèse des polymères de l’enveloppe est absolument nécessaire à la survie des bactéries et les modifications structurales de ces éléments sont autant de stratégies plus ou moins spécifiques qui participent au fitness et à un mode de vie particulier des bactéries. Les C55-PP phosphatases qui participent activement à ces processus constituent ainsi autant de cibles potentielles intéressantes pour la conception de nouveaux antibiotiques. / The bacterial cell envelope is composed of many polysaccharides such as the peptidoglycan and the lipopolysaccharides (LPS) that are required for survival and are involved in the interactions that the bacteria establish with their surroundings, including antimicrobial resistance and host immune system recognition. The biosynthesis of these polymers requires the translocation of the sugar sub-units across the plasma membrane, which implies an essential lipid carrier, the undecaprenyl phosphate lipid (C55-P). This lipid is generated by the dephosphorylation of its precursor, C55-PP, itself arising from either de novo synthesis or recycling. The Escherichia coli bacterial species possesses four membrane proteins (BacA, YbjG, PgpB and LpxT) exhibiting a C55-PP phosphatase activity, which all contribute redundantly to C55-P recycling. To highlight the specific physiological role of these enzymes in the cell wall biogenesis, our work was focused on the characterization of the mechanism of action, the function and the regulation of two of these phosphatases, PgpG and LpxT.The PgpB activity was characterized both in vivo and in vitro to decipher its role and ability to participate in two essential metabolic pathways, the C55-P recycling and the phosphatidylglycerol biosynthesis. We identified essential residues of PgpB involved in the hydrolysis of both natural substrates, C55-PP and PGP, and some others that function differently in the hydrolysis of these two lipids, allowing us to propose different reaction mechanisms for this enzyme. In addition, calorimetric data showed that substrate binding greatly stabilized the PgpB protein. Hypothetically, the underlying structural change would release energy allowing translocation of the lipid across the membrane. LpxT is responsible for a constitutive modification of the LPS by transferring the phosphate released from C55-PP to lipid A. Under certain environmental stresses, the LpxT activity is specifically inhibited by a small peptide (PmrR), thereby allowing other modifications of the lipid A structure to take place. We showed that the LpxT-dependent modification accounts for bile acids resistance in E. coli and is critically important for E. coli colonization in the host’s gut. LpxT constitutes a key critical control point in E. coli to resist different antimicrobial agents with opposite physical-chemical properties but which all target the LPS. In addition, we demonstrated that PmrR forms a stable complex with LpxT, but unexpectedly, this binding did not inhibit the phosphotransferase activity of the enzyme in vitro. We propose that PmrR inhibits LpxT activity in vivo by modulating its ability to interact with its protein partners that are involved in LPS biosynthesis. The biogenesis of cell wall polymers is essential for bacterial survival and structural changes in these components participate more or less specifically to the fitness and particular lifestyles of bacteria. The C55-PP phosphatases which participate actively in these processes therefore constitute interesting potential targets for new antibiotics design.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion de lipides ainsi que des protéines. L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. / After the genome, the new challenge is the proteome. We have progressed toward electrophoretic separation of membrane proteins in a medium that they love, a supported lipid bilayer. The main parameter, measured by FRAPP, was the diffusion coefficient of different objects (lipids, proteins). Studying bilayer behaviour has showed that, on particular supports and in a given temperature range, ripple phase can exist, despite the proximity of the support. Adding salt decreases coulombic interactions which turns to increase the diffusion coefficient over several orders of magnitude, reaching the value for a free-standing bilayer in the fluid phase, meanwhile the main characteristic steps of the global gel/fluid transition are still observed. Estimation of the value of the interaction energy has been made and compared to results of a preliminary DSC study. α-Hémolysin self-inserts spontaneously as an heptameric pore in supported bilayers and diffuses freely. Incubating in a gel/fluid mixture leads to protein complex formation. Diffusion varies with size as 1/R2, R being the equivalent radius of the inserted part of the object. Applying an electric field results in an electrophoretic motion where direction and magnitude are modulated by the charge of the object. Electrophoretic mobility varies also as 1/R2. Size dependence, magnitude of mobilities and a simple building protocol allow to hope carrying out soon a real electrophoretic separation of a protein mixture.

Les organismes vivants sont soumis à diverses pressions de sélection qui n'agissent pas seulement au niveau du phénotype global mais à chaque niveau de l'organisation de la cellule.<br />Nous avons analysé la composition globale en acides aminés de l'ensemble les protéines de chaque protéomes étudiés à l'aide, entres autres, de l'Analyse Factorielle des Correspondances et d'un outil de partitionnement, les nuées dynamiques.<br />Ont été étudiés<br />(i) les modèles microbiens les mieux connus E. coli, B. subtilis et M. jannaschii,<br />(ii) un échantillon représentatif du monde procaryote de 28 organismes aux caractéristiques les plus diverses,<br />(iii) la pathogénicité de P. luminescens,<br />(iv) la qualité psychrophile de la bactérie P. haloplanktis, dont la vie à basse température est caractérisée par des<br />protéines fortement biaisées en asparagine et<br />(v) une perspective d'application aux eucaryotes simples est évoquée au regard des travaux préliminaires sur l'usage<br />des codons de P. marneffei, un chamipgnon dimorphique et pathogène.

Le gène copH est l'un des 19 gènes constituant le cluster cop, impliqué dans la détoxication du cuivre dans le cytoplasme et le périplasme, chez Cupriavidus metallidurans CH34, souche modèle pour l'étude de la résistance aux métaux lourds chez les bactéries. La protéine CopH, localisée dans le périplasme, possède une structure et une fonction inconnues mais son expression est stimulée par la présence de cuivre. Nous avons analysé les propriétés de liaison CopH-Cu : les données montrent la présence d'un centre Cu(II) de type 2 dans un champ de ligands azotés. Les 2 seuls résidus histidine, a priori ligands du cuivre, n'interagiraient pas directement avec les ions Cu(II). Le site cuivre serait constitué d'atomes d'azote appartenant à la chaîne principale de la protéine.<br />L'étude des transporteurs CusA et CzcA a nécessité une purification optimisée en détergents et l'analyse de leur comportement en solution.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples. / The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection.

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X. / The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments.

Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu’ils transmettent à l’intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d’informations sont disponibles sur les modalités d’interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d’interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, l’importance d’un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l’interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d’identifier des petites molécules capables de perturber l’interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l’absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d’études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d’obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l’implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l’interaction avec les RCPG. / GPCRs represent one of the most diversified protein families in humans. They translate extracellular stimuli into intracellular signals to modulate a large panel of physiological processes making them unrivalled targets for development of new therapeutic agents. Recently, we identified the GASP family of proteins that interact with GPCRs and modulate the postendocyticfate of agonist activated receptors. GASP-1 is the well-characterized protein of this family and has been shown to be involved in the sorting of receptors that are quickly degraded following agonistpromoted internalization. Although GASP-1 was found to interact with numerous GPCR both in vitro and in vivo and that helix 8 of GPCRs is critically involved in this interaction, little is known about which region within GASP-1 is required for its interaction with GPCRs. In this work, we first present a detailed analysis of the molecular interaction between GASPs and GPCRs. By using biochemical and biophysical experiments we shown that the central domain of GASP-1 is critical for the interaction with GPCRs and that a conserved and repeated sequence of 15 amino acids plays a critical role in this interaction. In a second step, we developed an HTC assay allowing us to identify small molecules able to disrupt the interaction between GASP-1 and the beta-2 adrenergic receptor. Finally, preliminary NMR experiments have confirmed the importance of amino acid tryptophan for the interaction with GPCRs and a first crystallization trials were performed with a fragment of GASP -1.