Les domaines protéiques sont des segments indépendants qui sont présents de façon récurrente dans plusieurs protéines. L'arrangement combinatoire de ces domaines est à l'origine de la diversité structurale et fonctionnelle des protéines. Plusieurs méthodes ont été développées pour permettre d'inférer la décomposition des protéines en domaines ainsi que la classification de ces domaines en familles. L'une de ces méthodes, MkDom2, permet l'inférence des familles de domaines de façon gloutonne. les familles sont inférées l'une après l'autre de façon a créer un découpage des protéines en arrangement de domaines et un classement de ces domaines en familles. MkDom2 est a l'origine de la base de données ProDom et est essentiel pour sa mise à jour. L'augmentation exponentielle du nombre de séquences analyser a rendue obsolète cette méthode qui nécessite désormais plusieurs années de calcul pour calculer ProDom. nous proposons un nouvel algorithme, MPI_MkDom2, permettant l'exploration simultanée de plusieurs familles de domaines sur une plate-forme de calcul distribué. MPI_MkDom2 est un algorithme distribué et asynchrone gérant l'équilibrage de charge pour une utilisation efficace de la plate-forme de calcul; il assure la création d'un découpage non-recouvrant de l'ensemble des protéines. Une mesure de proximité entre les classifications de domaines est définie afin d'évaluer l'effet du parallélisme sur le partitionnement produit. Nous proposons un second algorithme MPI_MkDom3. permettant le calcul simultanée d'une classification des domaines protéiques et des protéines en familles partageant le même arrangement en domaines. / Protein domains are recurring independent segment of proteins. The combinatorial arrangement of domains is at the root of the functional and structural diversity of proteins. Several methods have been developed to infer protein domain decomposition and domain family clustering from sequence information alone. MkDom2 is one of those methods. Mkdom2 infers domain families in a greedy fashion. Families are inferred one after the other in order to create a delineation of domains on proteins and a clustering of those domains in families. MkDom2 is instrumental in the building of the ProDom database. The exponential growth of the number of sequences to process as rendered MkDom2 obsolete, it would now take several years to compute a newrelease of ProDom. We present a nous algorithm, MPI_MkDom2, allowing computation of several families at once across a distributed computing platform. MPI_MkDom2 is an asynchronous distributed algorithm managing load balancing to ensure efficient platform usage; it ensures the creation of a non-overlapping partitioning of the whole protein set. A new proximity measure is defined to assess the effect of the parallel computation on the result. We also Propose a second algorithm, MPI_mkDom3, allowing the simultaneous computation of a clustering of protein domains as well as full protein sharing the same domain decomposition.

Mon travail de thèse s’est axé sur deux projets, le premier a porté sur l’étude fonctionnelle de la sous unité TTDA de TFIIH, un facteur général de transcription impliqué dans la réparation NER, afin d’identifier de nouveaux partenaires de la sous unité TTDA nous avons réalisé un crible double hybride et ainsi sélectionné ZBTB38, une protéine impliqué dans la répression de gènes portant des methylations CpG, nous avons confirmé son interaction avec TTDA, et son implication dans la réparation NER. La deuxième partie a porté sur l’étude du recrutement des facteurs NER sur la chromatine en absence de lésions de l’ADN. En utilisant le système rapporteur LacO/LacR nous avons observé que l’immobilisation de l’un des facteurs NER sur la chromatine non endommagée permet l’assemblage du PInC de façon séquentielle et ordonnée. Nous avons aussi révélé que TTDA, connue pour être impliquée dans la trichothiodystrophie, joue un rôle clé dans la complétion du PInC. / During my thesis I worked on two projects, the first one was focused on the functional study of TTDA subunit of TFIIH, which is a general transcription factor involved in NER, we made a double hybrid screening to identify new interactants of TTDA subunit, and we could select ZBTB38, which is known to be implicated in methyl dependant gene repression; we confirmed its interaction with TTDA and its involvement in NER. The second project was entiteled Molecular Insights into the formation of the nucleotide excision repair complex revealed on undamaged chromatin. we analyzed the formation of the PInC independently of DNA damage by using the LacO-LacR system. We observed a sequential and ordered self-assembly of the PInC operating upon immobilization of individual NER factors on undamaged chromatin and mimicking that functioning on a bona fide NER substrate. We also revealed that the recruitment of TTDA, involved in Trichothiodystrophy disorder, was key in the completion of the PInC.

Les gradients de concentration de peptides ou de protéines, ou leur relargage localisé, jouent un rôle primordial dans les voies de communication inter-cellulaire. L'activation locale de cellules est étudiée in vitro à l'aide de sources artificielles contraignantes ou invasives de protéines (pipettes, dispositifs microfluidiques). Des méthodes plus douces et moins invasives sont très demandées. À cet effet, nous avons développé deux types de capsules capables de libérer des macromolécules sous l'effet d'une stimulation extérieure. Le premier système emploie des liposomes additionnés d'un amphiphile à azobenzène, tensioactif ou polyélectrolyte, capable de générer des pores à travers la membrane sous l'effet de la lumière. Les temps de dissolution des assemblages lipides/tensioactifs et les cinétiques de relargage (perméabilité) sous irradiation lumineuse ont été étudiées par diffusion dynamique de la lumière et fluorescence. Le second système repose sur des capsules à cœur aqueux et à coque polymère, formées par polyaddition interfaciale. Nous avons montré que l'inclusion de chaînes thermosensibles dans la membrane (polyNIPAM, par ex.) rendait la stabilité de la capsule dépendante de la température. Nous avons démontré sur des capsules millimétriques, chargées avec du dextrane ou des protéines, que cela permettait le contrôle du relargage. L'utilisation de polymère à UCST en milieu aqueux nous a permis d'obtenir les premières capsules thermosensibles capables de libérer leur contenu par élévation de la température au dessus d'une valeur critique. Cela ouvre une voie prometteuse au développement d'un système biocompatible de libération de protéines. / Concentration gradients and local delivery of peptides or proteins play a crucial role in intercellular communication. In vitro, the effects of local activation of cells are studied with constrained or invasive artificial protein sources (pipettes, microfluidics). Milder and remotely-triggered techniques for the release of encapsulated biomolecules are highly in demand. To this aim we developed two classes of capsules able to release macromolecules upon an external stimulation. The first system is based on liposomes sensitized with azobenzene-containing amphiphiles (surfactants or polyelectrolytes) that can open pores in the membrane upon exposure to light. The dissolution time of lipids/surfactants assemblies and rate of release (permeability) under light irradiation has been assessed by dynamic light scattering and fluorescence measurements. The second system is a model of capsules with an aqueous core and a polymer shell, formed by interfacial polyaddition. We showed that inclusion of temperature-responsive chains in the membrane, e.g. polyNIPAM, confers temperature-dependant stability to the capsules; we demonstrated with millimeter-sized capsules loaded with dextran or proteins that this can be used to trigger the release. Using chains with UCST in water, we obtained the first temperature-sensitive capsules able to release their content upon increasing the temperature above a threshold. This represents a promising route to the biocompatible delivery of proteins.

Les TSPO forment une famille ancienne et hautement conservée à travers l’évolution de protéines à 5 domaines transmembranaires, que l’on retrouve aussi bien chez les animaux que les plantes, ou encore les bactéries. La TSPO animale (ou TSPO1), la plus étudiée des TSPO à ce jour, se trouve majoritairement dans les tissus stéroïdiens où sa fonction précise est controversée. Chez certaines espèces animales, il existe une isoforme, la TSPO2, localisée dans la membrane plasmique des globules rouges alors que la TSPO1 est mitochondriale. La fonction de la TSPO2 n’est pas bien caractérisée. La TSPO végétale, localisée dans le réticulum endoplasmique, possède une extension N-terminale que n’ont pas les TSPO animale et bactérienne. Elle semble être impliquée dans la régulation du stress, tout comme la TSPO bactérienne. Les études structure/fonction des différentes TSPO réalisées dans ce travail ont nécessité leur production par voie recombinante car elles sont naturellement peu abondantes.Nous avons produit la TSPO1 murine marquée 15N,13C par surexpression dans la bactérie E. coli. Puis la protéine purifiée en détergent (SDS et DPC) a été étudiée par différentes techniques (CD, fluorescence, RMN). L’ajout du ligand spécifique de la TSPO1, le PK11195, stabilise une conformation en DPC ce qui a permis en 2014 la résolution de sa structure, par RMN du liquide, par une équipe allemande. Afin d’étudier la TSPO1 dans un environnement plus proche de sa membrane native, nous l’avons reconstituée dans des liposomes DMPC/DMPE et étudiée par RMN du solide. Les 1ers résultats sont encourageants et ouvrent une nouvelle approche expérimentale pour la détermination de sa structure en présence et, plus particulièrement, en absence de ligand. La surexpression de la TSPO2 humaine dans la bactérie E. coli s’est avérée difficile et nous avons dû la réalisée par système acellulaire (cell-free). Les quantités obtenues par cette méthode permettent d’envisager le développement futur des études des relations structure/fonction.La production et la purification du Nter de la TSPO d’A. thaliana marqué 15N,13C ont permis la détermination de sa structure par RMN du liquide. Son interaction avec des lipides chargés mise en évidence par les études RMN, suggère une nouvelle fonction de l’AtTSPO dans le trafic lipidique. / TSPO are five-transmembrane domain proteins that form a protein family highly conserved throughout evolution and that are found in animals as well as in plants and bacteria.Animal TSPO (referred to as TSPO1), the most studied TSPO, is highly expressed in tissues involved in steroid biosynthesis where its precise role remains controversial. In some animal species the presence of a less characterized TSPO isoform, TSPO2, has been reported. TSPO2 was found to be located in the plasma membrane of red blood cells whereas TSPO1 is located in mitochondrial outer membrane. Plant TSPO, which is located in the endoplasmic reticulum, possesses an N-terminal extension that is absent in bacterial and animal TSPO. This TSPO, along with the bacterial TSPO, seems to be involved in stress regulation.The structural and functional studies of TSPO proteins conducted in this work required their production through recombinant expression because they are naturally non-abundant proteins.We made use of E. coli to produce the recombinant 15N,13C-labelled mouse TSPO1. Then the protein purified in detergent was studied through several methods (CD, fluorescence, NMR). High-affinity binding of PK11195 to TSPO1 stabilizes a conformation in DPC, which made possible the structure determination of the protein in solution by NMR by a German team. We have incorporated TSPO1 into DMPC/DPME liposomes in order to provide a native-like environment and we then studied it by solid-state NMR. Preliminary results are encouraging and open up a new approach for TSPO1 structure determination in presence or in absence of ligand.Human TSPO2 overexpression in E. coli proved to be difficult and we therefore use the cell-free method. The amounts we obtained by this method allows us to consider future developments of structurefunction relationship studies.Production and purification of 13C,15N labelled N-terminal of A. thaliana TSPO have made it possible to determine its structure by liquid state NMR. Interaction of this peptide with charged lipids revealed by NMR, suggests a new fonction of AtTSPO in lipid trafficking.

La protéine tyrosine phosphatase SHP-2 est connue pour jouer un rôle important dans le maintien de l’homéostasie de plusieurs tissus et organes par ses effets régulateurs sur plusieurs voies de signalisation intracellulaire. Notre laboratoire a récemment démontré que la délétion embryonnaire de SHP-2 (SHP-2CEI-KO) à l’épithélium intestinal entraîne le développement rapide d’une inflammation colique sévère. La délétion ayant lieu au stade embryonnaire, une altération dans le développement intestinal pourrait être en cause dans l’initiation de cette inflammation. Afin d’éliminer cette possibilité, un modèle de délétion conditionnelle inductible de SHP-2 dans les cellules épithéliales intestinales (SHP-2CEI-KOER) a été généré, la délétion ayant été induite par injection de tamoxifène trois mois après la naissance. Ce modèle a permis d’éliminer la composante développementale, la délétion ayant lieu chez la souris adulte. De manière intéressante, les souris subissant la délétion de SHP-2 développent aussi une inflammation colique suite à 18 jours de traitement au tamoxifène. Cette inflammation s’accompagne d’une diminution de l’activité de la signalisation MEK/ERK MAPK et d’une activation de la signalisation JAK/STAT. Des altérations dans la différenciation des cellules caliciformes et de Paneth sont observées, les souris expérimentales présentant une diminution du nombre de cellules caliciformes ainsi qu’une présence aberrante de cellules intermédiaires (précurseurs des cellules caliciformes) dans leur côlon. Cette diminution du nombre de cellules caliciformes est présente dès le 10e jour de traitement au tamoxifène, précédant donc l’apparition des signes d’inflammation colique, ceux-ci débutant seulement au 12e jour de traitement au tamoxifène. Nos résultats sur une lignée cellulaire capable de se différencier dans un phénotype caliciforme, les LS174T, montrent une activation de la voie Notch suite à l’inactivation de la voie ERK/MAPK, cette activation étant associée à une augmentation de l’expression des gènes associés aux cellules caliciformes. Ces résultats corrèlent avec l’observation que MEK/ERK est inhibée dans l’épithélium déficient pour l’expression de SHP-2 alors que celle de Notch est activée. Ces résultats nous indiquent donc un rôle important de la tyrosine phosphatase SHP-2 dans le maintien de l’homéostasie intestinale, et ce, même chez l’adulte. L’inactivation de SHP-2 résulte en effet dans la perte de l’intégrité de la muqueuse colique amenant l’inflammation. De manière intéressante, des polymorphismes (SNP) dans le gène encodant SHP-2 ont été récemment associés à une susceptibilité accrue à développer une colite ulcéreuse chez des patients. Pris ensemble, ces résultats suggèrent donc que SHP-2 pourrait constituer une nouvelle cible dans le traitement des maladies inflammatoires intestinales.

Les DYRKs (dual specificity, tyrosine phosphorylation regulated Kinases) et CLKs (cdc2-like kinases) sont deux familles de kinases du groupe CMGC. Elles sont impliquées dans le développement de la maladie d'Alzheimer et de la trisomie 21. Nous présentons ici une optimisation et une caractérisation biologique détaillée des Leucettines, une famille d’inhibiteurs pharmacologiques de DYRKs/CLKs dérivés de la Leucettamine B, un alcaloïde extrait d'une éponge marine. Nous avons étudié la relation structure/activité de cette classe d'inhibiteurs sur un ensemble de réponses biologiques. Afin d'étudier les cibles potentielles de ces inhibiteurs, nous avons mis en œuvre une méthode de chromatographie d’affinité. La sélectivité de la Leucettine L41, sélectionnée comme représentative des Leucettines, a été étudiée par des essais d'activité et d'interaction de kinases recombinantes in vitro, et des tests de chromatographie d'affinité (Leucettines immobilisées sur billes d'agarose, compétition sur billes d’inhibiteurs non sélectifs). Des approches transcriptomiques et protéomiques ont été utilisées afin de mieux comprendre le mécanisme d'action cellulaire de la Leucettine L41. Ces approches ont confirmé la sélectivité de la Leucettine L41 pour DYRKs et CLKs mais aussi révélé l’existence de cibles secondaires intéressantes. La Leucettine L41 module l'épissage alternatif de pré-ARNm. Elle présente des propriétés neuroprotectrices vis-à-vis de la mort cellulaire induite par le glutamate. Les Leucettines méritent un développement en tant qu'agents thérapeutiques potentiels pour le traitement de la maladie d'Alzheimer et de la trisomie 21. / DYRKs (dual specificity, tyrosine phosphorylation regulated kinases) and CLKs (cdc2-like kinases) are two families of kinases belonging to the CMGC group. They are involved in the development of Alzheimer's disease and Down syndrome. We here present the optimization and a detailed biological characterization of Leucettines, a family of pharmacological inhibitors of DYRKs/CLKs derived from Leucettamine B, an alkaloid produced by a marine sponge. We studied the structure/activity relationship of this class of inhibitors on a set of biological responses. To investigate potential targets of these inhibitors, we implemented an affinity chromatography method. The selectivity of Leucettine L41, selected as a representative Leucettine, was studied by in vitro activity and interaction assays of recombinant kinases and affinity chromatography approaches (Leucettines immobilized on agarose beads, competition on non-selective inhibitors). Transcriptomics and proteomics approaches were used to better understand the cellular mechanism of action of Leucettine L41. These approaches confirmed the selectivity of Leucettine L41 for DYRKs and CLKs but also revealed the existence of interesting secondary targets. Leucettine L41 modulates alternative splicing of pre-mRNAs. It displays neuroprotective properties towards glutamate-induced cell death. Leucettines deserve further development as potential therapeutic agents for the treatment of Alzheimer's disease and Down syndrome.

Déterminer les protéines cibles de l’uranium est un enjeu majeur dans la détermination de la toxicité de ce métal et la conception d’agents décorporants. Dans ce contexte, ce travail étudie les possibilités offertes par le couplage CE-ICP/MS dans la détection de complexes protéine-uranium. Par des conditions de séparation judicieusement choisies, il est possible d’obtenir une distribution de l’uranium dans des échantillons de complexité moyenne. Cette approche a été validée sur des protéines cibles connues (seules ou en mélange) pour lesquelles les constantes d’équilibre apparentes ont été déterminées avec une justesse comparable à celle des méthodes biophysiques. L’intérêt de ce couplage a été illustré au travers de diverses applications. Ainsi l’analyse directe de sérum a confirmé l’implication forte de la fétuine, une glycoprotéine humaine, dans le devenir de l’uranium dans le sang. De plus, l’intégration ce couplage dans une approche multi-techniques (ICP/MS, DLS, CE-ICP/MS) a permis d’étudier l’influence de l’uranium dans la formation de particules de calciprotéines et fournit la preuve du maintien de l’interaction protéine-uranium dans de tels édifices. / Identification of proteins targeted by uranium is of major concern in the determination of uranium toxicity and the development of decorporation agents. In this study, we examine the capabilities offered by hyphenated CE - ICP/MS for the detection of protein-uranium complexes. With judicious separation conditions, it is possible to obtain the uranium distribution in samples of moderate complexity. This approach was validated by using known proteins targeted by uranium (individually or in simple mixtures). Apparent equilibrium constants were determined with an accuracy similar to the ones obtained by biophysical methods. The interest of using this hyphenation was illustrated through diverse applications. The direct analysis of human serum confirmed the strong involvement of fetuin, a human glycoprotein, in the uranium blood distribution. Last but not least, the integration of this hyphenation into a multi-techniques approach (ICP/MS, DLS, CE-ICP/MS) allowed evaluating the influence of uranium on the formation of calciprotein particles and provided a proof of the preservation of protein-uranium complexes in such conditions.

De nos jours, les nanomatériaux sont utilisés dans de très nombreux domaines allant de l’agroalimentaire à la santé en passant par l’industrie automobile et le textile. Dans ce contexte, de nombreuses disciplines comme la métrologie et la nanotoxicologie se sont fortement développées. Dans les milieux biologiques, les protéines interagissent avec les nanoparticules pour former une couronne de protéines. Cette couronne de protéines joue un rôle important dans les interactions des nanoparticules avec leur environnement. Comprendre et caractériser les interactions des nanoparticules avec les protéines permettraient d’améliorer l’utilisation des nanoparticules dans différents domaines, notamment dans celui de la santé. Nous avons d’abord mis au point une méthode de purification des nanoparticules permettant de préserver la structure et la composition de la couronne protéique (Asymmetric flow field-flow fractionation, AF4). Nous avons ensuite caractérisé la couronne protéique associée à ces nanoparticules par plusieurs méthodes telles que la sédimentation centrifuge différentielle, la microscopie électronique, des méthodes basées sur la diffusion de la lumière (diffusion dynamique de la lumière (DLS) et la résonance plasmonique de surface localisée ou non), le dichroïsme circulaire classique et le Synchrotron Radiation Circular Dichroism (SRCD, Diamond, UK). Nous avons montré qu’une couronne d’albumine sérique humaine provoque une augmentation du diamètre hydrodynamique des nanoparticules d’or de 14 à 25,3 nm et une diminution de la densité d’un facteur 2. Ceci nous a permis de calculer que 19 molécules d’albumine en moyenne interagissent avec une nanoparticule. Les spectres de dichroïsme circulaire ont permis d’estimer que l’albumine conserve environ 70% de ses structures hélicoïdales lorsqu’elle est complexée avec les nanoparticules. Nous avons estimé l’affinité avec laquelle les nanoparticules d’or interagissent qui est d’environ 351 nM pour l’albumine et 513 nM pour la transthyrétine qui est riche en brins béta. Nous avons également optimisé une méthode de couplage de l’AF4 à un appareil de mesure de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour améliorer la précision de la mesure du diamètre hydrodynamique des nanoparticules. Cette méthode précise et flexible permettra de caractériser de nombreuses modifications de surface des nanoparticules comme l’ajout de polyéthylène glycol, utilisées pour la conception de nano-médicaments / Nowadays, nanomaterials are used in numerous areas ranging from food to health through cars and textile engineering. In this context, many disciplines such as metrology and nanotoxicology, have been developed. In biological fluids, proteins interact with nanoparticles to form the protein corona, which plays an important role in mediating the interactions of the nanoparticles with their environment. Understanding and characterizing the interactions of nanoparticles with proteins and the corona structure would improve their use in various fields and particularly in the health sector. We have first developed a method based on Asymmetric Flow Field Flow Fractionation (AF4) for purifying gold nanoparticles preserving the structure and composition of the protein corona. Then we have characterized the protein corona associated to these nanoparticles by differential centrifugal sedimentation, electron microscopy, light scattering (dynamic light scattering, DLS), surface plasmon resonance (SPR) and localized SPR and by circular dichroism (classical CD and Synchrotron Radiation Circular Dichroism, SRCD, Diamond, UK). We have shown that human serum albumin corona increased the hydrodynamic diameter of the gold nanoparticles from 14 to 25.3 nm and decreases their density by a factor of 2. This enabled us to calculate that 19 albumin molecules on average interact with a nanoparticle. We have estimated by circular dichroism that albumin maintains about 70% of its helical structures when complexed with nanoparticles. The affinity between gold nanoparticles and proteins, is about 351 nM for albumin and 513 nM for transthyretin, which are enriched in helices and beta strands respectively. We have also optimized a coupling method between the AF4 system and the dynamic light scattering apparatus to improve the measurement accuracy of the hydrodynamic diameter of the nanoparticles. This accurate and flexible method will be helpful to characterize many surface modifications of the nanoparticles such as the addition of polyethylene glycol used for the design of nanodrugs

La paroi primaire végétale est une enveloppe dynamique impliquée dans le développement ainsi que la réponse aux contraintes environnementales. Elle est composée de réseaux de polysaccharides et de protéines dans lesquels interviennent des protéines multi-domaines de type LRX et des protéines à domaine PAC. Ce travail de thèse a consisté à rechercher la fonction de ces protéines dans les parois. Des analyses protéomiques réalisées sur des extraits de protéines pariétales de racines de plantes sauvages ou mutantes lrx1 d'A. thaliana ont permis d'identifier 424/434 protéines pariétales de plantes sauvages/lrx1 respectivement et 25 protéines candidates pouvant jouer un rôle dans la morphogenèse des poils absorbants. Par ailleurs, des protéines à domaine PAC ont été identifiées dans toutes les plantes terrestres étudiées. L'apparition des protéines à domaine PAC a pu être associée à la terrestrialisation. Une analyse phylogénique a permis de grouper les domaines PAC en 10 clades, chacun comportant un domaine PAC d'Amborella trichopoda. Outre les 6 résidus Cys caractérisant le domaine PAC, des motifs conservés ont été repérés dans les clades, ouvrant la voie pour des études fonctionnelles. Des tests in vitro ont montré que les domaines PAC interagissent avec différents types de polysaccharides pariétaux et permis de définir trois types de spécificité vis-à-vis de polysaccharides tels que les ß(1,4) galactanes/RGI, les mannanes, les xyloglucanes et/ou la cellulose. Un nouveau modèle d'interactions supramoléculaires dans les parois végétales faisant intervenir des protéines à domaine PAC et des polysaccharides pariétaux a été proposé / The plant primary cell wall is a dynamic envelope involved in development and in response to environmental constraints. It is composed of networks of polysaccharides and proteins to which multi-domain proteins like LRX (Leucine-Rich repeat Extensin) and PAC (Proline-rich Arabinogalactan Protein Cys-containing) domain proteins contribute. This work aimed at finding partners of such proteins in cell walls using different experimental approaches. Proteomics analyses have been performed on proteins extracted from cell walls of roots of wild type or lrx1 plants. They have allowed the identification of 424/434 cell wall proteins of wild type/lrx1 roots respectively as well as of 25 candidate proteins which could play a role in root hair morphogenesis. Besides, PAC domain proteins have been identified in all the studied terrestrial plants using a bioinformatic approach. The appearance of PAC domain proteins could be associated to terrestrialisation. A phylogenic analysis has allowed to group PAC domains in 10 clades, each of them containing a PAC domain of Amborella trichopoda, an ancestor of angiosperms. In addition to the 6 Cys residues which define the PAC domain, conserved motifs have been identified in each clade. This finding opens the way to functional studies. In vitro tests have shown that the PAC domains could interact with different kinds of cell wall polysaccharides. Three types of specificity could be defined towards ß(1,4) galactans/RGI, mannans, xyloglucans and/or cellulose. A new model of molecular interactions in plant cell walls including PAC domain proteins and polysaccharides has been proposed

La protéine SRSF1, aussi appelée ASF/SF2, fait partie de la famille des protéines SR, une famille de protéines liant l’ARN très conservées. Ces protéines jouent un rôle régulateur de l’épissage, également lors de l’épissage alternatif. Une centaine d’ARN cible ont été décrits pour SRSF1 mais la manière dont SRSF1 sélectionne ses cibles parmi tous les pré-ARNm est mal comprise. Des études in vitro et in vivo ont montré que les protéines SR reconnaissent un petit motif dégénéré qui est souvent présent en plusieurs copies dans les ESE («enhancer splicing element »). Bien que les protéines SR lient ces motifs avec une faible spécificité, la définition des exons se fait avec une grande fidélité. Afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de SRSF1, j’ai réalisé une étude cinétique des interactions SRSF1-ARN dans les cellules vivantes par des techniques de microscopies avancées. Grâce au système CRISPR, j’ai pu étiqueter la protéine SRSF1 avec la protéine Halo puis j’ai combiné une technique de photo-blanchiment (FRAP) et une technique de suivi de particule unique (« single particle tracking, SPT) pour mesurer la diffusion de SRSF1 et son affinité pour l’ARN. J’ai mesuré la durée de vie des événements de liaison individuellement aussi bien sur le pool global de pré-ARNm que sur des cibles spécifiques. Nos résultats indiquent que la liaison de SRSF1 ne dépasse pas quelques secondes, même sur les cibles de haute affinité. Cette cinétique rapide permet à SRSF1 d’être en contact avec l’ensemble des transcrits naissants qui est produit en permanence dans la cellule. De plus, mon travail apporte une analyse cinétique de la dynamique des snRNP à la résolution de la molécule unique dans le nucléoplasme des cellules vivantes. Nous avons déterminé les coefficients de diffusion des snRNP et la durée de leur association à l’ARN dans ces cellules. / SRSF1, formerly known as ASF/SF2, belongs to the SR protein family, which is a conserved family of RNA-binding protein that plays essential roles as regulators of both constitutive and alternative splicing. Hundreds of RNA targets have been described for SRSF1 but how SRSF1 selects its targets from the entire pool of cellular pre-mRNAs remains an open question. In vitro and in vivo studies have shown that SR proteins recognize short degenerated motifs often present in multiple copies at ESEs. Similar cryptic motifs are however frequently present in pre-mRNAs, and this low specificity of binding contrasts with the great fidelity of exon definition. To better understand the mechanism of action of SRSF1, I performed a kinetic study of SRSF1-RNA interactions in live cells using advanced microscopic techniques. Taking advantage by the CRISPR system, I tagged endogenous SRSF1 with Halo protein, and I combined photobleaching (FRAP) and single particle tracking (SPT) techniques to estimate diffusion and binding rates of SRSF1. I measured the duration of individual binding events, both on the cellular pool of pre-mRNAs and on specific targets. Our results indicate that binding of SRSF1 does not exceed few seconds, even on high-affinity targets. This rapid kinetics allows SRSF1 to rapidly sample the entire pool of nascent RNAs continuously produced in cells. Moreover, we provided a kinetic analysis of snRNP dynamics at a single-molecule resolution in the nucleoplasm of living cells. Our results enabled us to determine diffusion coefficients of snRNPs and their RNA binding duration in vivo.