Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Cette étude visait à caractériser la croissance, la capacité photosynthétique, la concentration en azote et protéines totales solubles, la production de protéines recombinantes (HA) ainsi que la quantité de lumière interceptée à différents stades de développement de plants de Nicotiana benthamiana afin d’optimiser la production de vaccins. L’évolution des réponses physiologiques étudiées fut similaire chez toutes les feuilles primaires, suggérant que le processus de sénescence s’initie et progresse de façon semblable indépendamment de leur ordre d’initiation. Toutefois, la superposition des patrons temporels de sénescence et de croissance foliaire a mené à un rendement HA maximal se situant invariablement dans la partie médiane du plant lorsqu’exprimé sur une base foliaire. À l’échelle du plant entier, nos résultats suggèrent qu’il est possible d’augmenter la production de vaccins en récoltant les plants à un stade de développement plus tardif, ou en augmentant la densité de culture et en récoltant ces plants plus tôt. / Nicotiana benthamiana is a wild relative of tobacco increasingly used as a plant protein expression platform to produce recombinant vaccine antigens against the influenza virus. Investigation on the physiological determinants of this production is essential to optimize and regulate vaccines production following a new flu outbreak. We examined the photosynthetic photon flux density, growth, light-saturated photosynthesis, total soluble protein, nitrogen content and recombinant protein production at different phenological stages. The similar evolution of the studied physiological responses suggested that the senescence process is initiated and progresses in a similar way in all primary leaves, regardless of the order of initiation. In contrast, the superposition of the time pattern of senescence with that of leaf growth shows that maximal HA yield expressed on a leaf basis is invariably located in the middle part of the plant. At the whole plant scale, our results suggest that it is possible to increase the production of antigens by harvesting plants at a later developmental stage, or by increasing plant density and harvesting these plants earlier.

Le travail présenté porte sur le développement d’une nouvelle technologie innovante, nommée PAT Friday®, visant à produire des protéines recombinantes au sein des sécrétions extracellulaires de plantes carnivores génétiquement modifiées. Deux objectifs ont été fixés : Réaliser la preuve de concept de la technologie sur le modèle expérimental Drosera rotundifolia, en transformant la plante avec des gènes marqueurs et humains afin de mettre en évidence la présence des protéines recombinantes dans la glu ; et développer, après évaluation, la technologie sur un modèle potentiellement industrialisable, Nepenthes alata. Les résultats ont indiqué la présence des deux protéines marqueurs GFP et GUS dans les tissus et dans la glu de Drosera rotundifolia transformées. Les plantes ont également été transformées génétiquement avec les gènes humains de l’interféron gamma et du facteur intrinsèque. Les protéines recombinantes humaines ont été mises en évidence au sein des tissus végétaux. Le potentiel industriel du modèle Nepenthes alata a ensuite été étudié : 10 à 15 kg de protéines totales par hectare et par an peuvent être produits, grâce notamment à des récoltes successives non destructrices, et la possibilité de contrôler l’activité des protéases digestives naturelles. L’élaboration d’un protocole de régénération de la plante a été entreprise par embryogénèse somatique et organogénèse indirecte, en vue de sa transformation génétique. La technologie PAT Friday®, avec des étapes simplifiées d’extraction et de purification des protéines d’intérêt produites dans le liquide digestif, offre de nouvelles perspectives dans le domaine des protéines thérapeutiques produites à partir de plantes / The present work focuses on the development of a new innovating technology, called PAT Friday®, aiming at producing recombinant proteins into the extra-foliar fluid of modified carnivorous plants. Two objectives were assigned to this work : 1- to realize a proof of concept of the technology on the experimental model Drosera rotundifolia, transformed with marker and human genes, to confirm the occurence of the recombinant proteins into glu ; and 2 - to evaluate and develop, the technology on the model Nepenthes alata, more adapted to industrial scaling-up. The results indicate the presence of two marker proteins GUS and GFP inside the tissues and into the glu of modified Drosera rotundifolia plants. The same plant species has also been transformed with human gamma interferon and intrinsic factor genes. The corresponding human recombinant proteins have been detected into the plant tissues. Potential industrial scaling-up has been studied with the species Nepenthes alata. The results show a potential productivity of 10 to 15 kg of total proteins per hectare per year, thanks to non-destructive repeated harvests, and possibility to efficiently control the natural proteinase activity. The elaboration of a regeneration protocol has been undertaken through indirect organogenesis and somatic embryogenesis, with a view to transform genetically this plant. PAT Friday® technology, with simplified extraction and purification methods of the proteins of interest targeted into the liquid secretions, opens new perspectives in the field of therapeutical proteins produced in plants

La production de protéines hétérologues permet de développer une nouvelle génération de vaccins. La bactérie Escherichia coli est l’un des organismes hôtes les plus utilisés pour la production de protéines hétérologues, appelées également protéines recombinantes. Le déclenchement de la production de protéine altère la croissance bactérienne en réponse à la réallocation des ressources métaboliques vers la synthèse de la protéine ; ce qui peut conduire à l’arrêt complet de la croissance. Le maintien de la croissance bactérienne durant la production de la protéine recombinante est pourtant essentiel pour améliorer significativement la quantité et la fonctionnalité des protéines produites. Dans une démarche rationnelle visant à développer un système biologique robuste et performant pour la production d’une grande diversité de protéines recombinantes chez E. coli, les contraintes métaboliques liées à leur production ont été quantifiées. A partir de ces résultats, le système d’expression T7 a été intégré à la régulation métabolique et traductionnelle de la bactérie E. coli BL21 (DE3) afin d’adapter la vitesse de production avec les capacités métaboliques de la souche. Ce nouveau système biologique de production a ainsi permis d’augmenter considérablement les quantités de protéines produites et offre la possibilité de développer de nouveaux procédés performants de production semi-continus et continus en milieu chimiquement défini. / The production of heterologous proteins offers the ability to develop a new generation of vaccines. The most used organism for the production of heterologous proteins, also called recombinant proteins, is the bacterium Escherichia coli. However, the induction of the production often alleviates the bacterial growth by the new allocation of metabolic resources toward the production of the recombinant protein. Even, this may also lead to growth arrest. The production of high quantities of functional recombinant proteins requires a good balance between of bacterial growth and production of the recombinant protein.In order to rationally develop a robust and an efficient biological system for the production of a large variety of recombinant proteins in E. coli, the metabolic constraints associated to their production have been quantified. From this observation, the T7 expression system has been integrated into the metabolic and translational regulation of the E. coli BL21 (DE3) in order to adjust as perfect as possible the protein production rate to the metabolic capacities of the strain. This new biological production system has made it possible to significantly increase the quantities of proteins produced and opens up the possibility of developing performant semi-continuous and continuous production processes in a chemically defined medium.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales chez les patients immunodéprimés ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de la mucoviscidose (CF). La colonisation des voies respiratoires des patients CF est souvent mortelle car une fois installée, cette bactérie est difficile à éradiquer et provoque le déclin des fonctions respiratoires des patients. L'antibiothérapie devient inefficace face au développement de souches multi-résistantes et sa capacité à former un biofilm. L'étape cruciale initiant l'infection ou la formation du biofilm est l'adhésion durant laquelle des interactions spécifiques lectines/oligosaccharides permettent la fixation de la bactérie à la surface de la cellule hôte. Bloquer l'adhésion serait un moyen de lutter contre l'infection. Dans l'approche d'une thérapie anti-adhésive, plusieurs lectines impliquées dans l'adhésion et l'élaboration du biofilm sont prises comme cibles. Dans un premier temps, des lectines fimbriales putatives identifiées récemment, CupB6 et CupE6, ont fait l'objet d'une étude. Des essais d'expression, de purification et de cristallisation ont été réalisés dans l'objectif de résoudre leur structure cristallographique. Une étude visant à identifier le ligand naturel de CupB6 a également été entreprise. Puis une étude a été menée pour caractériser le potentiel d'inhibition de plusieurs molécules dérivées du galactose sur la lectine soluble, PA-IL. Certaines de ces molécules pourraient être utilisées comme glycomimétiques offrant une alternative aux antibiotiques. Une étude par microcalorimétrie et cristallographie aux rayons X a permis d'étudier la spécificité d'une lectine de légumineuse, PELa.

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Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales chez les patients immunodéprimés ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de la mucoviscidose (CF). La colonisation des voies respiratoires des patients CF est souvent mortelle car une fois installée, cette bactérie est difficile à éradiquer et provoque le déclin des fonctions respiratoires des patients. L'antibiothérapie devient inefficace face au développement de souches multi-résistantes et sa capacité à former un biofilm. L'étape cruciale initiant l'infection ou la formation du biofilm est l'adhésion durant laquelle des interactions spécifiques lectines/oligosaccharides permettent la fixation de la bactérie à la surface de la cellule hôte. Bloquer l'adhésion serait un moyen de lutter contre l'infection. Dans l'approche d'une thérapie anti-adhésive, plusieurs lectines impliquées dans l'adhésion et l'élaboration du biofilm sont prises comme cibles. Dans un premier temps, des lectines fimbriales putatives identifiées récemment, CupB6 et CupE6, ont fait l'objet d'une étude. Des essais d'expression, de purification et de cristallisation ont été réalisés dans l'objectif de résoudre leur structure cristallographique. Une étude visant à identifier le ligand naturel de CupB6 a également été entreprise. Puis une étude a été menée pour caractériser le potentiel d'inhibition de plusieurs molécules dérivées du galactose sur la lectine soluble, PA-IL. Certaines de ces molécules pourraient être utilisées comme glycomimétiques offrant une alternative aux antibiotiques. Une étude par microcalorimétrie et cristallographie aux rayons X a permis d'étudier la spécificité d'une lectine de légumineuse, PELa. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic bacterium responsible for numerous nosocomial infections in immunosuppressed patients. It is the first mortal pathogen in cystic fibrosis (CF) patients. The invasion of the respiratory tract of CF patients by the bacterium is often lethal because it is hard to eradicate and it rapidly impairs the respiratory functions of the patients. None of the current antibiotherapy procedures are efficient against multiresistant, biofilm forming P. aeruginosa. The first step leading to infection or biofilm formation involves the initial adhesion of bacterial cells to the host pulmonary cells via specific lectin/oligosaccharid interactions. Blocking the adhesion would be a way to fight against the infection. The anti-adhesion therapy targets several bacterial lectins involved in adhesiveness and biofilm formation. In this work, the recently identified putative fimbrial lectins CupB6 and CupE6 have been studied. Expression and purification tests followed by crystallization trials have been performed. In parallel, attempts to identify the natural ligand of CupB6 were also carried out. This work also presents a systematic characterization of the inhibitory effects of various galactose-derived molecules on the PA-IL lectin. Some of these molecules could be used as glycomimetic drugs thus offering an interesting alternative to standard antibiotics. Finally, the combination of microcalorimetry together with X-ray crystallography enabled us to gain insights into the ligand specificity of PELa, a legume lectin.

Confidentiel / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes natives. / Understanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes.