Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

Le contrôle de la glycosylation des protéines recombinantes présente un enjeu considérable dans le développement de la production de protéines d'intérêt thérapeutique dans des systèmes d'expression hétérologues. La glycosylation joue en effet un rôle essentiel dans leurs propriétés, notamment pharmacocinétiques. Le remodelage de la N-glycosylation des protéines recombinantes a été envisagé via l'utilisation de la glycosynthase Cel7B E197A d'Humicola insolens. Cette enzyme doit tout d'abord être modifiée afin de pouvoir fixer un groupement N-acétylglucosaminyle dans le sous-site accepteur +1. Des études de modélisation moléculaire ont mis en évidence deux acides aminés qui pourraient empêcher le positionnement d'une unité glucosidique substituée en position 2. Différents mutants ont été préparés par mutagénèse dirigée afin d'étudier leur spécificité de substrat. Leurs activités glycosynthases ont été caractérisées, montrant l'influence des mutations introduites. Même si la spécificité de substrat désirée n'a pu être obtenue, une modification de la régiosélectivité de la glycosynthase a été mise en évidence vis-à-vis d'un substrat substitué en position 2 par un groupement de type azido.

Le Ga1NAc est présent dans un grand nombre de glycoprotéines, protéoglycanes et glycolipides. Il est le sucre immunodominant des antigènes de groupes sanguins et oncofoetaux qui sont des cibles thérapeutiques. Cependant, la synthèse par voie chimique de ces glycoconjugués à Ga1NAc est longue et coûteuse. In vivo, le Ga1NAc est incorporé par des Ga1NActransférases, enzymes spécifiques qui transfèrent le Ga1NAc de l'UDP-GaINAc sur un substrat accepteur. Mais la synthèse chimio enzymatique des glycanes est freinée par l'obtention difficile de quantités importantes d'UDP-Ga1NAc.<br />Nous avons mis au point un système de synthèse chimio enzymatique de glycoconjugués à Ga1NAc qui utilise 4 enzymes et des substrats simples comme le Ga1NAc, l'UTP et la créatine-P. Ce système permet la synthèse rapide et efficace de glycopeptides et d'oligosaccharides à GaINAc ; il a été utilisé pour glycosyler l'antigène MUC1 et nous avons pu évaluer la réponse immunitaire murine contre la petite glycoprotéine obtenue.<br />Le système de synthèse d'UDP-Ga1NAc peut accepter certains dérivés de Ga1NAc et permettre ainsi la synthèse d'analogues d'UDP-Ga1NAc. Ces molécules sont des sondes appréciables pour étudier l'interaction entre substrats et enzymes par les techniques physicochimiques comme la STDNMR.

Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / La moléculture végétale est une approche prometteuse pour la production de protéines d’intérêt médical ou industriel. Considérant les variations de rendement possibles dans une plante soumise à différentes conditions culturales, nos objectifs étaient : (i) de cartographier l’accumulation d’un antigène viral d’intérêt clinique dans les feuilles du tabac sauvage Nicotiana benthamiana utilisé comme bio-usine, et (ii) d’évaluer l’impact de la lumière en période de croissance sur le rendement total en antigène. Nous avons étudié les relations entre l’âge foliaire, le régime lumineux, l’expression du transgène et le rendement final en antigène dans les feuilles. Nos données confirment l’influence de l’âge sur les variations de rendement d’une feuille à l’autre, et l’impact positif de l’intensité lumineuse sur le rendement par plante. Elles mettent aussi en relief l’importance des tiges secondaires sur le rendement et le rôle clé de la transcription du transgène sur la teneur en antigène à l’échelle cellulaire. / Plant molecular farming is a promising approach to produce proteins of medical or industrial interest. Considering possible variations of protein yield in plants exposed to different cultural conditions, our goals were : (i) to map the accumulation of a clinically useful viral antigen in leaves of the tobacco relative Nicotiana benthamiana used as protein biofactory, and (ii) to evaluate the impact of light conditions during plant growth on total antigen yield. We looked at eventual relations in planta between leaf age, light intensity, light quality, transgene expression and final protein yield in leaves. Our data confirmed the central influence of leaf age on antigen yield variation from one leaf to another, and the positive impact of light intensity on total yield per plant. They also highlight the importance of secondary stem growth on total yield, and the key role of transgene transcription on antigen content at the cell scale.

La moléculture végétale est une alternative abordable et sécuritaire pour la production de protéines recombinantes d’intérêt clinique. Cependant, ces protéines sont souvent sujettes à la dégradation par les protéases endogènes dans les cellules végétales. Plusieurs stratégies ont été mises en place pour contrer ce phénomène, incluant notamment la co-expression d’inhibiteurs de protéases compagnons. Peu de données ont décrit toutefois comment la physiologie de la plante hôte, associée en particulier à son développement, a un impact sur l’expression et la protection d’une protéine d’intérêt. Dans ce projet, nous avons évalué les activités de protéases de types cystéine et aspartate dans des feuilles agroinfiltrées de la plante hôte Nicotiana benthamiana, en fonction de leur stade de développement. Nous démontrons que l’expression de l’inhibiteur SlCYS8 de tomate, actif contre les protéases de type cystéine, permet d’augmenter d’environ 40% le rendement en anticorps monoclonal C5-1, notre protéine modèle, dans les feuilles jeunes et matures où les activités protéolytiques sont moindres. Ces résultats prometteurs sur le plan appliqué font ressortir, en revanche, la complexité des processus biochimiques en cause et la pertinence de développer des stratégies complémentaires pour augmenter les teneurs en protéine recombinante. Dans cette optique, une nouvelle approche basée sur une diversion dirigée du métabolisme de défense de la plante hôte a été explorée. Nous démontrons qu’une activation du sentier de l’acide jasmonique induit dans les feuilles la production de protéines de stress, incluant des inhibiteurs de protéases de classes fonctionnelles variées; et une diminution de la teneur en RuBisCO, un contaminant majeur pendant la purification des protéines recombinantes. Sur cette base, nous avons adjoint à notre procédure de transfection un prétraitement des plantes au jasmonate de méthyle, une forme volatile de l’acide jasmonique. Ce prétraitement a permis d’une part de réduire considérablement les teneurs en RuBisCO dans les feuilles, et de doubler d’autre part le taux d’expression et le rendement en anticorps C5-1. Nos données appuient l’utilité éventuelle d’une manipulation du métabolisme de défense sur les rendements en protéine recombinante, complémentaire aux approches basées sur la co-expression d’inhibiteurs de protéases recombinants. / Plant molecular farming is an affordable and safe alternative to conventional expression animal and microbial systems for the production of clinically-useful recombinant proteins. However, these proteins are often susceptible to degradation by endogenous proteases of the host plant cells. Several strategies have been described to counter degradation processes including the co-expression of companion protease inhibitors. Few data, however, were available describing how the host plant’s physiology, especially its developmental stage, could impact the expression and protection of a clinically useful heterologous protein. In this study, we assessed changes in the activity of cysteine and aspartate proteases in the widely adopted expression host Nicotiana benthamiana, as a function of leaf age. We demonstrate that the expression of a tomato cysteine protease inhibitor, SlCYS8, allows to increase by nearly 40% the total yield of a model protein, the blood-typing C5-1 monoclonal antibody, in young and mature leaves where proteolytic activities are lower. Our results, while promising in practice, highlighted on the other hand the complexity of biochemical processes involved and the relevance of developing additional strategies to boost recombinant protein accumulation in planta. Towards this end, a new approach based on a deliberate diversion of the host plant defense metabolism was explored. We show that an activation of the jasmonic acid pathway in leaves induces the production of stress-related proteins, including protease inhibitors of various functional classes; and a significant decrease in the content of RuBisCO, a major contaminant during the purification of recombinant proteins. Based on this we included in our transfection procedure a pretreatment of plants with methyl jasmonate, a volatile form of jasmonic acid. This pretreatment significantly reduced RuBisCO levels in leaves, concomitant with a more than twofold increase of C5-1 yield in mature leaves. Our data highlight, overall, the potential of manipulating the host plant’s defense metabolism to increase heterologous protein yields, in complement to current protein protection strategies involving the co-expression of recombinant protease inhibitors.

Les systèmes d’expression végétaux sont utilisés couramment pour la production hétérologue de protéines recombinantes complexes. Des contraintes biochimiques dans le système de sécrétion cellulaire, comme l’abondance de protéases peu spécifiques ou des variations de pH d’un organite à l’autre, compromettent toutefois l’expression de plusieurs protéines d’intérêt. Des approches ont été développées pour améliorer l’environnement intracellulaire dans la plante hôte de manière à accroître la qualité et le rendement des protéines sécrétées. Dans ce projet, nous avons évalué l’impact de l’homéostasie du pH dans le système de sécrétion cellulaire des feuilles du Nicotiana benthamiana sur l’expression et la stabilité des protéines recombinantes. Nous démontrons le potentiel du canal ionique M2 du virus de l’Influenza comme nouvel outil pour augmenter le pH des compartiments acides du système de sécrétion cellulaire, une approche éventuellement utile pour la stabilisation des protéines sensibles aux milieux acides. En lien avec l’influence bien documentée du pH sur l’activité des protéases cellulaires, nous montrons ensuite qu’une modification du pH induite par l’expression du canal M2 influence les profils de dégradation de protéines de fusion sensibles à la protéolyse, des observations qui confirment l’impact du pH sur l’activité protéolytique des cellules végétales et qui suggèrent le potentiel du canal ionique M2 comme protéine accessoire pour augmenter la stabilité et le rendement des protéines recombinantes in planta. Finalement, nous abordons l’impact du canal ionique M2 sur l’expression des protéines endogènes à l’échelle de la cellule. Nous démontrons qu’une altération du pH dans le système de sécrétion en réponse à l’expression du canal ionique a des effets étendus sur le protéome foliaire, affectant la teneur de protéines retrouvées dans plusieurs compartiments cellulaires incluant les chloroplastes, le cytosol et la vacuole. Nous rapportons aussi l’établissement d’un ‘protéome hybride’ dans les plantes exprimant M2, composé de protéines caractéristiques aussi bien de plantes témoins non infectées que de plantes agroinfectées exprimant activement des protéines de défense. En résumé, nos données mettent en évidence le rôle de l’homéostasie du pH sur le protéome des cellules végétales et l’impact significatif du gradient de pH dans le système de sécrétion cellulaire sur la stabilité et le rendement des protéines recombinantes sensibles à l’acidité ou à la protéolyse. / Plant expression systems are commonly used for the heterologous production of complex recombinant proteins. However, biochemical conditions in the plant cell secretory pathway, such as the presence of poorly-specific proteases or pH variations from one organelle to another, impair the expression of several potentially useful proteins. Approaches have been developed to improve the cellular environment of the host plant in such a way as to increase the quality and yield of secreted recombinant proteins. In this project, we assessed the impact of pH homoeostasis in the leaf cell secretory pathway of wild tobacco Nicotiana benthamiana on the expression and stability of recombinant proteins. We demonstrate the potential of Influenza virus proton channel M2 as a new tool to increase pH in acidic compartments of the cell secretory pathway, eventually useful to stabilize acid-labile recombinant proteins. In line with the well-established influence of pH on cell protease activities, we then show that pH modification induced by the expression of the M2 channel influences the degradation profile of fusion proteins susceptible to proteolysis, thus confirming the impact of pH on protease activities in plant cells and highlighting the potential of M2 as an accessory protein to increase the stability and yield of recombinant proteins in planta. Finally, we describe the impact of the M2 proton channel on the expression of endogenous proteins at the cellular scale. We show that pH alteration in the secretion system upon M2 expression has cell-wide effects on the leaf proteome, affecting the content of proteins found in various cell compartments including the chloroplast, the cytosol and the vacuole. We report the establishment of a ‘hybrid proteome’ in leaf cells expressing the proton channel, composed of protein clusters characteristic of both control, non-infected plants and agroinfected plants actively expressing defense-related proteins. Overall, our data highlight the central role of pH homeostasis on the proteome of plant cells and the strong impact of pH gradient in the cell secretory pathway on the stability and yield of acidic pH-labile and protease-susceptible recombinant proteins.

Aujourd'hui, la production de protéines thérapeutiques est effectuée principalement à partir de lignées de cellules d'ovaires de hamster chinois CHO. Ces cellules, contrairement aux systèmes bactériens et certains systèmes eucaryotes, sont capables d'effectuer toutes les modifications post traductionnelles nécessaires à la fonctionnalité de la protéine. Avec plusieurs centaines de protéines actuellement en essais précliniques, il est nécessaire de développer des méthodes de production de glycoprotéines efficaces et rapides dans les cellules CHO. Au cours de cette thèse deux nouveaux systèmes d'expression performants de protéines recombinantes dans les cellules CHO sont présentés. Ces systèmes reposent sur l'utilisation d'un virus épisomal (adenovirals) ou intégratif (lentivirus) comme vecteur de transfert et du système inductible au cumate pour le contrôle de l'expression des transgènes. Dans ce système inductible, la transcription débute lorsque le transactivateur au cumate (cTA) ou le transactivateur inverse au cumate (rcTA) se lie sur le promoteur inductible au cumate CR5. En présence de cumate, la liaison du cTA sur le promoteur CR5 est inhibée empêchant la transcription contrairement au rcTA dont la liaison avec le promoteur CR5 est possible seulement en présence de cumate. La première méthode consiste à infecter des cellules CHO exprimant le cTA (CHO-cTA) et le récepteur du coxackievirus et de 1'adenovirus (CAR) par un adenovirus de type 5 exprimant le transgène de la protéine d'intérêt dans ce cas-ci celui de l'alcaline phosphatase sécrétée (SEAP) sous le contrôle du promoteur CR5. Cette technique permet de produire à 30°C six jours suivant l'infection jusqu'à 63 ug/mL de SEAP dans des conditions de culture non optimisées. Des lentivirus ont également été utilisés pour l'expression stable de différents transgènes dans les cellules CHO exprimant le cTA ou le rcTA. Des lots de clones CHO ont été générés produisant à 30°C jusqu'à 65 ug/mL de SEAP dans les cellules CHO-cTA et 235 ug/mL d'une protéine de fusion CD200Fc, 160 ug/mL d'anticorps chimérique chB43 et 206 ug/mL d'érytliropoïétine EPO dans les cellules CHO-rcTA, sous des conditions de culture non optimisées. Ces résultats démontrent que l'utilisation de virus couplé à un système de contrôle performant de l'expression de transgènes permet de produire rapidement et en quantité importante une gamme variée de protéines thérapeutiques dans les cellules CHO.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le potentiel des plantes pour la production hétérologue de protéines recombinantes est maintenant bien établi, mais des problèmes de stabilité et de modifications post-traductionnelles inadéquates des protéines persistent et nuisent au développement des plateformes végétales. Bien que les plantes aient la capacité d'effectuer la plupart des modifications post-traductionnelles nécessaires aux propriétés biologiques des protéines produites, il existe des différences subtiles mais significatives entre les modifications post-traductionnelles des protéines chez les mammifères et les plantes. Ces différences peuvent affecter les propriétés biologiques des protéines recombinantes végétales et entraver leur valeur commerciale. Parmi ces modifications, la N-glycosylation et la maturation protéolytique sont celles qui affectent le plus souvent les rendements et la qualité des produits recombinants. Afin d'étudier le potentiel des plantes à produire des glycoproteines complexes, nous avons exprimé en culture cellulaire de tabac Nicotiana tabacum cv BY-2 l'inhibiteur de protéases alpha 1-antichymotrypsine (AACT) humaine, une glycopotéine d'intérêt clinique. La protéine a été adressée vers le compartiment endomembranaire de sécrétion (RE, vacuole et apoplasme) ou exprimée directement dans le cytosol afin d'établir l'impact de la localisation cellulaire sur sa stabilité et sa glycosylation. Nos études ont montré que, bien qu'exprimé dans tous les compartiments cellulaires, le produit obtenu était plus hétérogène au sein du système endomembranaire, probablement en raison d'une maturation de la N-glycosylation et à une maturation protéolytique indue. Inversement, la protéine recombinante exprimée dans le cytosol, sous forme non glycosylée, montrait une plus grande stabilité. Des études d'immunolocalisation ont par ailleurs démontré que cette forme de l'AACT exprimée dans le cytosol montrait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L'AACT possède un site de liaison à l'ADN et une mutation de ce site a permis ici d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire. Ces derniers résultats suggèrent que la liaison à l'ADN est impliquée dans la rétention nucléaire de l'AACT. / Plants represent interesting production platforms for recombinant proteins of therapeutical value. While the proof of concept for protein production in plants is no longer a matter of debate, protein stability and post-translational modifications essential for biological activity pose, on the other hand, serious challenges to the development of plant factories. Plant cells can perform most protein post-translational modifications, but plant and mammalian proteins often present minor but significant differences, with a possible negative impact on their commercial value. To assess the potential of plants for the production of structurallycomplex mammalian proteins, we expressed human alphal-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY-2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular final destination on accumulation, stability and glycosylation of the resulting variants. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms. This post-translational maturation apparently was the result of glycan maturation and proteolytic processing of the polypeptide along the secretory pathway. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution thus suggesting a role of DNA binding in recombinant AACT nuclear retention. Taken together, these results illustrate the complex and unpredictable nature of recombinant protein posttranslational maturation, and stress the need for additional empirical data on the expression of complex glycopropteins in plant cells.

Au cours des dernières années, les plantes ont émergé comme une plateforme de choix pour la production de protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique ou industriel. La moléculture n'est par contre pas exempte de difficultés alors que les protéines hétérologues rencontrent souvent, par exemple, des problèmes de dégradation causés par les protéases endogènes, avec un impact direct sur le rendement et la qualité du produit. Pour répondre à cette problématique, nous avons exprimé des inhibiteurs de protéases hétérologues dans le but de moduler in vivo l'activité protéolytique des plantes et ainsi permettre une protection de protéines recombinantes coexprimées. Afin d'évaluer sur une base globale le potentiel des inhibiteurs de protéases en moléculture, ces expériences furent réalisées avec différents systèmes d'expression et à différents endroits dans la cellule. La transformation de plants de pommes de terre (Solanum tuberosum) avec l'inhibiteur de cathepsine D de tomate (SICDI) ciblé dans le cytosol a provoqué une augmentation marquée du contenu en protéines foliaires associée à une hausse générale de la majorité des protéines endogènes. L'expression de cet inhibiteur à large spectre a par ailleurs permis la protection d'une protéine d'intérêt médical, l' alpha-l-antichymotrypsine humaine, exprimée de façon transitoire dans le cytosol des feuilles d'une lignée transgénique, illustrant le potentiel de la plateforme pour ce compartiment de la cellule. Puisque de nombreuses protéines nécessitent des modifications post-traductionnelles complexes qui ont lieu dans le système de sécrétion, il apparaissait par la suite pertinent de vérifier l'effet des inhibiteurs de protéases dans ce dernier compartiment. Cette évaluation fut réalisée à l'aide d'un système d'expression transitoire par agroinfiltration chez Nicotiana benthamiana. La plateforme étant encore peu caractérisée, une attention particulière ad' abord été accordée aux réactions de la plante au cours du processus d'infiltration, résultant en l'élaboration d'une carte protéomique de l' apoplaste foliaire de N. benthamiana. La coexpression de deux inhibiteurs de protéases dans le système de sécrétion de N. benthamiana, soit SICDI et la cystatine 9 de tomate, avec l'anticorps d'intérêt médical C5-1 a par ailleurs permis une augmentation du rendement de l'anticorps, confirmant l'utilité des inhibiteurs de protéases dans la protection des protéines recombinantes sécrétées.