Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T02:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiengo_Andrea_M.pdf: 1037181 bytes, checksum: fa41390046e1fd743ebaf166db3e45ec (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O amaranto vem se destacando como uma excelente fonte alternativa ou complementar de proteínas alimentares devido à sua composição balanceada em aminoácidos essenciais. A cultura do amaranto (Amaranthus cruentus BR Alegria) vem sendo introduzida no Brasil por sua ótima qualidade nutricional, alto teor de proteínas e melhor valor biológico que a de cereais, e funcional, além de características agronômicas de adaptabilidade. Apesar de o amaranto ter sido bem caracterizado quimicamente e apresentar componentes relacionados a diferentes atividades bioquímicas com potencial fisiológico, pouco se conhece sobre seu potencial funcional. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade inibidora da enzima conversora da angiotensina (ECA) e a capacidade ligante de ácidos biliares (AB) da farinha desengordurada de amaranto e seus produtos. Farinha integral foi obtida pela moagem do grão de Amaranthus cruentus (variedade BR Alegria) e tratada com hexano para obtenção da farinha desengordura (FDA), utilizada para a produção do concentrado protéico de amaranto (CPA). Para obtenção de hidrolisados protéicos, CPA, sem e com tratamento térmico prévio (90°C/ 30 minutos), foi hidrolisado com a enzima Alcalase, até atingir 12% de grau de hidrólise (GH). As farinhas e seus produtos derivados foram caracterizados quanto à composição e perfis eletroforético e cromatográfico de suas proteínas. A digestão in vitro das proteínas também foi avaliada e o material digerido utilizado para avaliação da atividade inibidora da ECA. A farinha integral de amaranto e seus derivados apresentaram composição semelhante à encontrada na literatura. O tratamento térmico prévio do CPA não alterou o padrão de atividade das enzimas utilizadas, pois o perfil eletroforético e cromatográfico (fase reversa e exclusão molecular) mostraram-se semelhantes. Todos os hidrolisados protéicos e digeridos apresentaram capacidade de inibir a ECA in vitro. No entanto, os digeridos do CPA sem e com tratamento térmico prévio (DCPAst e DCPAtt respectivamente) apresentaram menor atividade inibidora da ECA (IC50 de 0,439 mg proteína/mL e 0,475 mg proteína/mL respectivamente) que os hidrolisados com Alcalase tanto antes (HPAst e HPAtt) como após a digestão in vitro (DHPAst e DHPAtt) que apresentaram IC50 0,118 a 0,176 mg de proteína/mL. Estes resultados sugerem que, in vivo, a ingestão da proteína de amaranto intacta pode apresentar menor atividade inibidora da ECA quando comparada à ingestão da proteína previamente hidrolisada com Alcalase. A digestão in vitro não alterou a atividade inibitória da ECA dos hidrolisados, sugerindo que os peptídeos inibidores da ECA liberados pela ação da Alcalase foram resistentes à hidrólise gastrintestinal. A capacidade ligante de ácidos biliares dos produtos de amaranto (FDA, CPA, HPAst e resíduo alcalino ¿ RA - obtido da extração do CPA) e da colestiramina (utilizada como controle positivo), foi diferente em função do ácido biliar estudado (ácidos cólico, taurocólico, glicocólico e deoxicólico). A colestiramina apresentou a maior atividade ligante para todos os AB testados, diferindo-se de todas as amostras (p<0,05). O RA, mais rico em fibras (8,6%), apresentou a menor atividade ligante para os AB testados, com exceção do ácido glicocólico, que os demais produtos. A FDA apresentou atividade ligante intermediária para todos os AB, porém semelhante à do CPA com o ácido deoxicólico e do HPAst com o ácido taurocólico, que apresentaram as maiores atividades. A FDA e CPA apresentaram capacidade ligante de ácidos biliares secundários tóxicos à mucosa intestinal. A partir dos resultados obtidos não foi possível afirmar se foram as proteínas, as fibras ou eventualmente outro componente não avaliado, o principal responsável por esta atividade. Com a comprovação das atividades inibidora da ECA e ligante de ácidos biliares in vitro, sugere-se a realização de estudos in vivo, sendo o experimento in vivo um método mais confiável para avaliar a atividade biológica das proteínas de amaranto e demais componentes / Abstract: Amaranth has been highlighted as an excellent alternative or complementary source of food protein due to its balanced amino acid composition. The culture of amaranth has been introduced into Brazil on account of its optimum nutritional (high protein content and better biological quality than that of cereal protein) and functional quality, apart from its agricultural characteristics and adaptability. Although amaranth has been well characterised chemically and present components related to different biochemical activities with physiological potential, little is known about its functional potential. The objective of the present work was to evaluate the inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme (ACE) and the capacity to bind with the bile acids (BA) of defatted amaranth flour and its products. Whole flour was obtained by grinding the Amaranthus cruentus grain (BR Alegria variety), and treating with hexane to obtain the defatted flour (ADF), used to produce the amaranth protein concentrate (APC). To obtain the protein hydrolysates, APC, with and without prior heat treatment (90ºC/ 30 minutes), was hydrolysed using the enzyme Alcalase to a 12% degree of hydrolysis (DH). The flours and their derived products were characterised with respect to the electrophoretic and chromatographic compositions and profiles of their proteins. The in vitro digestibility of the proteins was also evaluated and the digested material used to determine the ACE inhibitory activity. The whole amaranth flour and its derivatives presented a composition similar to that found in the literature, and the prior heat treatment of the APC did not alter the activity pattern of the enzymes used, since the electrophoretic and chromatographic profiles (reverse phase and molecular exclusion) were shown to be similar. All the protein hydrolysates, before and after digestion, showed in vitro ACE inhibitory capacity. However, the digested APC, with or without prior heat treatment (DAPCnt and DAPCht, respectively) presented less ACE inhibitory activity (IC50 of 0,439 mg protein/mL and 0,475 mg protein/mL, respectively) than the Alcalase hydrolysates both before (APHnt and APHtt) and after in vitro digestion (DAPHnt and DAPHtt), which presented IC50 values of from 0,118 to 0,176 mg protein/mL. These results suggest that, in vivo, the ingestion of intact amaranth protein could present less ACE inhibitory activity than when ingesting protein previously hydrolysed with Alcalase. In vitro digestion did not change the ACE inhibitory activity of the hydrolysates, suggesting that the ACE inhibitory peptides liberated by the action of Alcalase were resistant to gastro-intestinal hydrolysis. The bile acid binding capacity of the amaranth products (ADF, APC, APHnt and the alkaline residue ¿ AR ¿ obtained from the extraction of APC) and of cholestyramine (used as the positive control), varied as a function of the bile acid studied (cholic, taurocholic, glycocholic and deoxycholic acids). The cholestyramine showed greater binding activity with all the BAs tested, differing from all the samples (p<0,05). The fibre-rich (8,6%) AR presented the least binding activity with all the BAs tested, as compared to the other products, with the exception of with glycocholic acid. The ADF presented intermediate binding activity with all the BAs, which was nevertheless similar to that of APC with glycocholic acid and of APHnt with taurocholic acid, which presented the highest activities. The ADF and APC presented binding capacity with the secondary bile acids toxic to the intestinal mucous membrane. From the results obtained, it was not possible to affirm if it was the proteins, fibres or even some other non-evaluated component, that was responsible for this activity. Having proven the ACE inhibitory and bile acid binding activities in vitro, it is important to also carry out in vivo studies, since the in vivo experiment is a more reliable method to evaluate the biological activity of the amaranth proteins and their other components / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-07T15:37:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_Mariza_M.pdf: 1934217 bytes, checksum: d2b5831163c6c6be9fad1f62fd40b3fc (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Peptídeos inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) presentes em alimentos têm despertado o interesse de muitos pesquisadores, pois há evidências que sua ingestão, possa auxiliar na prevenção e no tratamento não medicamentoso da hipertensão. O potencial da atividade anti-hipertensiva de peptídeos tem sido avaliado principalmente com relação à capacidade de inibir a ECA, que tem papel fundamental na regulação da pressão arterial. Desta forma, inúmeros estudos têm focado a produção e o isolamento de peptídeos com atividade inibidora da ECA a partir de proteínas de diferentes fontes alimentícias, embora ainda pouco se conhece sobre a biodisponibilidade destes peptídeos. O presente estudo teve como objetivos: avaliação da influência das enzimas do trato gastrintestinal na atividade inibitória da ECA de hidrolisados protéicos e sua correlação com a atividade anti-hipertensiva avaliada in vivo e avaliar o efeito antihipertensivo e na função renal de hidrolisados de diferentes fontes. Utilizou-se hidrolisados comerciais de diferentes fontes protéicas: caseína (Hyprol 8052), soro de leite (Hyprol 3301) e glutén de trigo (Hyprol 4137) fornecidos pela Kerry Bio-Science; caseina (CE90ACE), soro de leite (WE80BG) e soja (SE50BT), doados pela DMV International e colágenos hidrolisados de origem bovina e suína (Gelita South América). Os colágenos hidrolisados foram fracionados em sistema de ultrafiltração com membranas de cut off de 30 a 50 kDa, 5 a 8 kDa e 1 a 2 kDa, obtendo-se os permeados P1 (PM< 30-50kDa), P2 (PM< 5-8kDa) e P3 (PM< 1-2 kDa), respectivamente. Os hidrolisados foram caracterizados físico-quimicamente e em seguida analisados quanto à capacidade de inibição da ECA antes e após a digestão gastrintestinal in vitro, e atividade anti-hipertensiva em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) por via oral. Os produtos que apresentaram as melhores atividades in vivo foram avaliados quanto à sua influência na função renal dos animais e efeito hipotensor prolongado na pressão arterial de SHR, em experimento crônico. A hidrólise gastrintestinal in vitro promoveu efeito variável sobre a atividade inibitória da ECA. Os hidrolisados de maior peso molecular, colágenos hidrolisados bovino e suíno, apresentaram aumento significativo da potência inibitória da ECA. Por outro lado, observou-se redução na capacidade de inibir a ECA dos hidrolisados com menor peso molecular, como os hidrolisados da caseína (Hyprol 8052 e CE90ACE), soro de leite (Hyprol 3301) e soja (SE50BT). Os colágenos hidrolisados bovino e suíno e suas frações, tanto antes como após a digestão gastrintestinal in vitro apresentaram menor potência inibitória da ECA que os demais hidrolisados. Todos os hidrolisados anali sados foram capazes de induzir redução significativa da pressão arterial de SHR, exceto os colágenos hidrolisados bovino (CHB) e suíno (CHS) não fracionados. Os hidrolisados do soro de leite (WE80BG), caseína (CE90ACE), fração P1 do colágeno bovino e suíno (CHBP1 e CHSP1) e a fração P3 do colágeno hidrolisado suíno (CHSP3) foram os mais eficientes em reduzir a pressão arterial de SHR. A administração oral crônica dos hidrolisados WE80BG e CHBP1 induziu uma redução progressiva e significativa da pressão arterial de SHR, sendo a diferença de 20,60 mmHg e 10 mmHg, respectivamente, em relação à pressão basal. O hidrolisado CE90ACE, que apresentou uma das melhores atividades anti-hipertensivas in vivo, induziu redução na filtração glomerular dos animais e promoveu maior excreção de sódio na porção pós-proximal do ducto renal, provavelmente devido a um efeito vasodilatador, decorrente da inibição da ECA. Ao comparar os resultados obtidos in vivo com os valores de IC50 antes e após a hidrólise gastrintestinal, não se observou relação entre a eficiência em inibir a ECA in vitro e a redução da pressão arterial in vivo dos hidrolisados protéicos comerciais. Em conclusão, as enzimas gastrintestinais exercem grande influência sobre atividade antihipertensiva dos hidrolisados protéicos comerciais, podendo aumentar ou diminuir o efeito hipotensor in vivo. Porém, a digestão gastrintestinal in vitro dos hidrolisados antes da avaliação do potencial inibidor da ECA unicamente não se mostrou vantajosa para a predição da atividade biológica dos hidrolisados, pois além da digestão gastrintestinal há outros fatores e/ou mecanismos que podem estar envolvidos com o decréscimo da pressão arterial produzido pela ação dos peptídeos / Abstract: Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides present in foods have motivated the interest of many researchers, since there is evidence that the ingestion of these peptides, could aid in the prevention and in the non-medication treatment of hypertension. The anti-hypertensive activity of the peptides has been mainly assessed in relation to their capacity to inhibit the ACE, which has a fundamental role in regulating the blood pressure. In this way, innumerous studies have focused on the production and isolation of peptides with ACE-inhibitory activity from proteins from different food sources, though still little is known about the bioavailability of this peptides. The objectives of the present study were: assess the influence of the gastrointestinal enzymes on the ACEinhibitory activity of protein hydrolysates and the correlation with the anti-hypertensive activity assessed in vivo, and to assess the anti-hypertensive effect and kidney function of hydrolysates from different sources. Commercial hydrolysates from the following protein sources were used: casein (Hyprol 8052), milk whey (Hyprol 3301) and wheat gluten (Hyprol 4137), all provided by Kerry Bio-Science; casein (CE90ACE), milk whey (WE80BG) and soy (SE50BT), donated by DMV International, and hydrolysed collagens of bovine and porcine origins (Gelita South America). The hydrolysed collagens were fractionated in an ultrafiltration system using membranes with cut-offs of 30 to 50 kDa, 5 to 8 kDa and 1 to 2 kDa, obtaining the permeates P1 (PM<30-50 kDa), P2 (PM<5-8 kDa) and P3 (PM<1-2 kDa), respectively. The hydrolysates were physicochemically characterized and analysed for their ACE-inhibitory capacity before and after in vitro gastrointestinal digestion, and for their anti-hypertensive activity in spontaneously hypertensive rats (SHR) via oral. The products presenting the best activity in vivo, were assessed for their influence on the kidney function of the animals and for their prolonged hypotensive effect on the blood pressure of SHR in a chronic experiment. The in vitro gastrointestinal hydrolysis promoted a variable effect on the ACE-inhibitory activity. The higher molecular weight hydrolysates, bovine and porcine collagen hydrolysates, presented a significant increase in the ACE-inhibitory potential. On the other hand a reduction in the ACE-inhibitory potential was observed for the smaller molecular weight hydrolysates, such as the casein (Hyprol 8052 and CE90ACE), milk whey (Hyprol 3301) and soy (SE50BT) hydrolysates. The bovine and porcine collagen hydrolysates and their fractions, both before and after in vitro gastrointestinal digestion, presented lower ACE-inhibitory potential than the other hydrolysates.All the hydrolysates analysed were capable of inducing a significant reduction in blood pressure in the SHR, except for the non-fractionated bovine (BCH) and porcine (PCH) collagen hydrolysates. The milk whey (WE80BG) and casein (CE90ACE) hydrolysates, P1 fractions of bovine and porcine collagen (BCHP1 and PCHP1) and the P3 fraction of the porcine collagen hydrolysate (PCHP3) were the most efficient in reducing the blood pressure in SHR. The chronic oral administration of the hydrolysates WE80BG and BCHP1 induced a progressive, significant reduction in the blood pressure of the SHR, showing a difference of 20.60 mmHg and 10 mmHg, respectively, as compared to the basal pressure. The hydrolysate CE90ACE, which presented one of the best in vivo anti-hypertensive activities, induced a reduction in glomerular filtration by the animals and promoted greater sodium excretion at the post-proximal portion of the kidney duct, probably due to a vasodilatory effect on account of ACE-inhibition. On comparing the in vivo results with the IC50 values, before and after gastrointestinal hydrolysis, no relation was observed between the in vitro ACE-inhibitory efficiency and the in vivo reduction in blood pressure by the commercial protein hydrolysates. In conclusion, the gastrointestinal enzymes exert considerable influence on the anti-hypertensive activity of the commercial protein hydrolysates, and can increase or decrease the in vivo hypotensive effect. Thus the in vitro gastrointestinal digestion of the hydrolisates alone, before the assessment of the ACE-inhibitory potential, is apparently of no advantage in predicting the biological activity of the hydrolysates, since apart from the gastrointestinal digestion other factors and/or mechanisms can also be involved in the decrease in blood pressure produced by the action of the peptides / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

As proteínas têm sido objeto de extenso estudo e um dos passos mais importantes que se obteve industrialmente nas últimas décadas foi a produção de proteínas hidrolisadas, viabilizando sua aplicação em uma gama de produtos cosméticos e alimentícios. Os hidrolisados de proteína são incorporados em formulações destinadas aos cuidados de cabelo e pele, possuindo facilidade de penetração na cutícula dos cabelos proporcionando brilho, hidratação e condicionamento. Também são incluídos em cremes e loções para o corpo, possuindo propriedades amaciantes, hidratantes e de proteção à pele. Neste trabalho, a técnica de eletroforese capilar foi utilizada para a obtenção do perfil eletroforético de diversos hidrolisados, a saber, de soja, leite, seda, queratina, pele de animal bovino, incluindo proteína de origem marinha, variando-se condições analíticas e instrumentais. Os hidrolisados apresentaram um perfil pouco resolvido e uma investigação com extração em fase sólida foi realizada, proporcionando um fracionamento de peptídeos e, posteriormente um perfil eletroforético com maior resolução. O método de Kjeldhal foi empregado para a determinação de proteínas totais dos diversos hidrolisados de proteína estudados. Duas metodologias para a obtenção das massas molares dos hidrolisados de proteína foram implementadas, utilizando a eletroforese capilar em gel. Um dos métodos empregou o polímero linear de acrilamida para a separação de padrões de proteína na faixa de 14 a 94 kDa. Outro método desenvolvido utilizou dextran (com massa molar de 2.000.000), como rede polimérica, para a separação de padrões de proteína entre 2.512 a 16.949 Da e de 14 a 67 kDa. Os hidrolisados de proteína estudados apresentaram massa molar na faixa de 10-70 kDa. O método com detecção indireta foi desenvolvido para a separação de uma mistura de 20 aminoácidos, sendo que dezesseis aminoácidos foram efetivamente separados em dois métodos distintos. A metodologia estudada foi aplicada para a identificação dos aminoácidos dos hidrolisados de proteína (QUERATAN, SILKION, LACTOSOL, PROSOJA, PROMARIN e PROTEINAN). A quantificação dos aminoácidos foi realizada para o hidrolisado de queratina (QUERATAN), apresentando concentrações na faixa de mgL-1. / Proteins have been object of extensive investigation and in the last years, an important step has been reached from an industrial point of view, which was the production of protein hydrolysates, employed in cosmetic and nourishing products. Protein hydrolysates are employed in shampoo formulations and skin care products because they confer to the products characteristics associated to protection, conditioning and repair of the hair fiber whereas to the body they contributes to moisturization. In this work, the profile of protein hydrolysates from a variety of sources was determined by capillary electrophoresis optimizing analytical and instrument conditions. The protein hydrolysates presented a poorly resolved peak profile. However, when the hydrolisates were submitted to solid phase extraction procedures, a rich peptide mapping was obtained. The Method of Kjeldhal was employed to determine the total protein of several protein hydrolysates. Two methodologies to determine molar masses of protein hydrolysates were implemented using capillary gel electrophoresis. Acrilamide was used to separate protein standards from 14,4 to 94 kDa and dextran, a physical gel, was used to separated protein of 2,5- 16 kd and 14 - 67 kDa. Additionally, an indirect UV/vis absorbance detection methodology was developed to identify and quantify free amino acids in the protein hydrolysates.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4595.pdf: 1437433 bytes, checksum: f83e0ea8c49064050b3f382c7d942d28 (MD5) Previous issue date: 2012-08-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Diseases caused by Streptococcus pneumoniae are one of the main problems of public health in the world. The pneumococcal surface protein A(PspA) is a potential canditate as carrier in a conjugate vaccine against this bacteria. Considering the inherent high losses of the purification and conjugation steps, it is fundamental to adopt a strategy of cultivation and expression that allows the obtainance of large quantities of protein. Thus, the use of Escherichia coli as expression system as well as its cultivation in complex medium constitutes promising alternatives for reducing the cost and increasing the productivity of the process. The goal of this work was to study the influence of the temperature and cultivation medium composition over the production of a PspA belonging to clade 4 protein fragment (PspA4Pro) during rE coli cultivations, aiming at to evaluate the possibility of employing vegetable-based nitrogen sources (soybean protein hydrolisates) instead of the Triptona, an animal-derived nitrogen source. The experiments were carried out in both shakers and benchscale bioreactor, using a complex medium which contained glucose and glycerol as carbon sources, lactose as inducer and Soytone, Phytone or Triptone as nitrogen sources, besides yeast extract. Samples were collected during the experiments to follow the cell growth (measurements of absorbance, dry cell weight and permittivity signal from biomass sensors), the carbon sources consumption and the production of organic acids by HPLC analysis. The stability of the plasmid (agar plates with or without kanamycin) and the production of recombinant protein (Bradford and SDS-PAGE electrophoresis followed by densitometry) were also evaluated. Preliminary experiments were performed in shake flasks, incubated at 300rpm and 37ºC, employing both complex and defined media. The highest productivity was achieved in complex medium, with a 42% superior protein production. Subsequently, nine complementary experiments were conducted in shake flasks with complex medium, under the agitation of 300rpm and temperatures of 37ºC (growth phase) and 25, 31 or 37ºC (induction phase). The largest specific production of soluble PspA4Pro was verified at 25ºC, reaching, respectively, 209±6, 192±5mg/g dry cell mass for Phytone and Triptone, with final absorbance values (after 12h of induction) of 9.0±0.4 and 8.5±0.4. The best protein production for Soytone (124±4mg/g dry cell weight) was observed at 31ºC, yielding a final absorbance 8.0±0.4. From the results obtained in the preliminary tests, the nitrogen source Phytone was selected for experiments in bioreactor. Four batch cultures were conducted in bench-scale bioreactor (5L), containing a modified auto-induction complex medium (10g/L glucose, 60g/L glycerol and 20g/L lactose), being three of them with Phytone and one with Triptone, for comparison. The best results in terms of protein production (245±7mg of PspA4Pro soluble/g dry mass) were obtained in the presence of Phytone, corresponding to an increase of 16% towards the maximum value achieved in the cultivation with Triptone. These results demonstrate the potential of vegetable-based nutrients as alternatives to animal-derived nitrogen sources in complex media, contributing to adequate these media formulations to the current guidelines of good manufacturing practices. / Doenças causadas por Streptococcus pneumoniae constituem um dos principais problemas de saúde pública mundial. A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é candidata em potencial a ser carreadora em vacina conjugada contra essa bactéria. Considerando as altas perdas inerentes às etapas de purificação e conjugação da proteína, é fundamental adotar uma estratégia de cultivo e expressão que permita obter grandes quantidades de proteína. Nesse sentido, o emprego da bactéria Escherichia coli como sistema de expressão e o cultivo da mesma em meio complexo se apresentam como alternativas promissoras para redução do custo e aumento da produtividade do processo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a influência da temperatura e da composição do meio de cultivo sobre a produção do fragmento da proteína PspA do clado 4 (PspA4Pro) em cultivos de rE. coli, visando avaliar a viabilidade de utilização de fontes de nitrogênio de origem vegetal (hidrolisados protéicos de soja) em substituição à Triptona, de origem animal. Os experimentos foram realizados em câmara incubadora e em biorreatores de bancada, utilizando meio complexo contendo glicose e glicerol e lactose como fontes de carbono, lactose como indutor e Soytone, Phytone ou Triptona como fontes de nitrogênio, além de extrato de levedura. Amostras foram coletadas ao longo dos experimentos para acompanhamento do crescimento celular (medida de absorbância, massa seca e permissividade por sensor de biomassa), do consumo das fontes de carbono e da produção de ácidos orgânicos por análises em cromatografia líquida de alto desempenho. A estabilidade do plasmídeo (plaqueamento em meio contendo ou não canamicina) e a produção de proteína recombinante (Bradford e eletroforese SDS-PAGE seguida por densitometria) também foram avaliadas. Experimentos preliminares foram realizados em frascos agitados e incubados a 300rpm e 37oC, empregando tanto o meio complexo como o definido. A maior produtividade foi obtida em meio complexo, a qual foi 42% superior a alcançada com meio definido. Em seguida, nove experimentos complementares foram conduzidos em frascos agitados em meio complexo sob agitação de 300rpm e à temperatura de 37ºC (fase de crescimento) e de 25, 31 ou 37ºC (fase de indução). Verificou-se que a temperatura de 25ºC proporcionou a maior produção específica de PspA4Pro solúvel, alcançando-se, respectivamente, 209±6, 192±5mg/g massa seca para o Phytone e para a Triptona, com absorbâncias finais (após 12h de indução) de 9,0±0,4 e 8,5±0,4. Já para o Soytone, a melhor produção de proteína (124±4mg/g massa seca) foi observada à temperatura de 31ºC, obtendo-se uma absorbância de final de 8,0±0,4. A partir dos resultados obtidos nos ensaios preliminares, a fonte de nitrogênio de origem vegetal Phytone foi selecionada para experimentos em biorreator. Quatro cultivos em batelada foram conduzidos em biorreator de bancada (5L), contendo meio complexo de autoindução modificado (10g/L glicose, 60g/L glicerol e 20g/L lactose), sendo 3 com Phytone e um com Triptona, para comparação. Os melhores resultados em termos de produção de proteína (245±7mg de PspA4Pro solúvel/g massa seca) foram obtidos na presença de Phytone, correspondendo a um aumento de 16% em relação ao valor máximo alcançado no cultivo com Triptona. Esses resultados comprovam o potencial dos nutrientes de origem vegetal como alternativa às fontes de nitrogênio de origem animal em meios complexos, contribuindo para adequar as formulações desses meios às atuais diretrizes de boas práticas de fabricação.

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T21:19:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_FernandaGuimaraesDrummonde_M.pdf: 1363127 bytes, checksum: 68b1a97c95798f4425019ee900814160 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Existem evidências numerosas sobre o papel dos radicais livres em uma série de condições patológicas, incluindo envelhecimento, câncer, esclerose múltipla, doenças cardiovasculares. Hidrolisados protéicos de diferentes fontes têm sido estudados por seu potencial antioxidante. A atuação antioxidante da proteína, na maioria das vezes, encontra-se limitada devido à conformação espacial, que concentra resíduos capazes de neutralizar radicais livres no interior da molécula, dificultando o acesso das espécies reativas aos centros nucleofílicos. A hidrólise da proteína contribui para aumentar a exposição desses resíduos de aminoácidos, aumentando sua atuação como antioxidante. Compostos fenólicos podem estar presentes em hidrolisados proteicos de origem vegetal, devido a sua associação com as proteínas. Métodos in vitro que simulam as condições do trato gastrointestinal permitem estudar como a digestão pode interferir na atividade antioxidante de peptídeos e compostos fenólicos. O presente trabalho tem como objetivos obter hidrolisados proteicos com capacidade antioxidante a partir da farinha de linhaça e avaliar o efeito da digestão in vitro pode interferir nessa atividade. A farinha de linhaça marrom foi desengordurada, obtendo-se a farinha de linhaça marrom desengordurada (FLMD). O concentrado proteico de linhaça (CPL) foi obtido a partir da FLMD por extração alcalina e precipitação no ponto isoelétrico seguida de neutralização. Para obtenção dos hidrolisados proteicos (HPL), a partir do CPL, com Alcalase, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) 2². As variáveis independentes foram pH que variou entre 7,5 a 9,5 e relação enzima: substrato (E:S) que variou de 1:150 a 1:30. As variáveis dependentes foram grau de hidrólise (GH), teor de substâncias redutoras do reagente de Folin-Ciocalteau e atividade antioxidante, determinada por FRAP e ORAC. Teor de substâncias redutoras e atividade antioxidante foram avaliados a partir dos extratos aquosos e metanólico (metanol 70%). Os hidrolisados de maior atividade antioxidante, a FLMD e o CPL foram submetidos à digestão in vitro, simulando as condições da digestão gastrintestinal. As amostras antes e após a digestão in vitro foram caracterizadas por eletroforese em sistema SDS-PAGE Tricina e por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (HPLC- RP). O teor de substâncias redutoras e da atividade antioxidante das amostras FLMD, CPL e HPL foram avaliados antes e após a digestão in vitro. As condições ótimas para obtenção de HPL de maior GH (21,0%) são pH entre 7,5 e 8,0 e E:S entre 1:60 e 1:30, indicando que a faixa de pH ótimo da enzima e a alta E:S favorecem maior hidrólise do CPL. Para obtenção de HPL com maior teor de substâncias redutoras para os extratos aquoso (24 mg EAG/ g HPL) e metanólico (20 mg EAG/ g HPL) as condições ótimas são pH ~ 8,5 /E:S 1:30. Este resultado parece estar relacionado à liberação de compostos fenólicos ligados a proteína e também de peptídeos durante a hidrólise. Açúcares e aminoácidos aromáticos presentes no hidrolisado podem interferir na reação e superestimar o teor de fenóis dos HPL. A maior atividade antioxidante determinada pelo método de FRAP para o extrato aquoso (42 mg SF/ g HPL) se dá nas condições de pH ~ 9,5/E:S ~1:150 e para o extrato metanólico (40 mg SF/ g HPL) pH entre 8,5 e 9,0/E:S entre 1:90 a 1:150. Para o método de ORAC, as condições ótimas para maior atividade antioxidante no extrato aquoso (300 µmol TE/ g HPL) são pH entre 7,5 a 9,5/E:S ~ 1:30 ou ~1:150 e para o extrato metanólico (330 µmol TE/ g HPL) são pH ~ 8,5/E:S entre 1:150 e 1:30. Os hidrolisados de maior atividade antioxidante foram os obtidos em pH 8,5/E:S 1:90, e em pH 9,2/E:S 1:133 denominados HPL 0 e HPL 3, respectivamente. Para a FLMD, CPL e os hidrolisados, após a digestão in vitro, observou-se que o teor de substâncias redutoras totais aumentou (9 a 20 vezes) para todas as amostras. O teor de substâncias redutoras do CPL (~24 mg EAG/ g amostra), em ambos os extratos, após a digestão in vitro se igualou ao teor dos hidrolisados (~23 mg EAG/ g amostra). Este resultado sugere que tanto a hidrólise com Alcalase quanto o processo digestório liberam compostos redutores, dentre eles fenólicos da proteína de linhaça. A atividade antioxidante dos extratos de FLMD e CPL, determinada por FRAP, também aumentou (de 3 a 10 vezes) após a digestão, mas não se igualou à atividade antioxidante dos hidrolisados (48 mg SF/g amostra). No entanto, o CPL apresentou atividade antioxidante determinada por ORAC semelhante à dos hidrolisados no extrato aquoso (~420,24 µmol TE/ g amostra) e 10 % maior que o encontrado para os hidrolisados (~365 µmol TE/ g amostra) no extrato metanólico. Após a digestão in vitro, os hidrolisados apresentaram a maior atividade antioxidante medida por FRAP (50 mg SF/ g amostra), e o CPL, a maior atividade determinada pelo método de ORAC (~430 µmol TE/ g amostra). Estes resultados sugerem o processo digestório é tão ou mais eficiente que a Alcalase em liberar os compostos com atividade redutora no CPL. Uma vez que a metodologia de determinação da atividade antioxidante por ORAC tem maior proximidade com o mecanismo de oxirredução que ocorre in vivo, esses resultados sugerem o uso do CPL como melhor produto protéico da linhaça com maior potencial antioxidante para a formulação de nutracêuticos e alimentos funcionais / Abstract: There are several evidences which indicate the role of free radicals on a series of pathological conditions, including aging, cancer, multiple sclerosis and cardiovascular disease. Hydrolysates from different sources have been studied because of their antioxidant potential. The antioxidant activity of the protein, in most cases, is limited due to their conformation, which concentrates residues capable of neutralize free radicals in the molecule¿s core, hampering the access of the reactive species to nucleophilic sites. The protein hydrolysis contributes to increasing the exposure of these amino acid residues, increasing their role as antioxidants. Phenolic compounds may also be present in vegetable protein hydrolysates because of their association with proteins. In vitro methods that simulate the conditions of the gastrointestinal digestion are an important way to evaluate how the digestion affects the antioxidant activity of phenolic compounds and peptides. This study aims at obtaining hydrolysates with antioxidant capacity from defatted flaxseed flour and evaluate the effect of the in vitro digestion on this activity. The brown flaxseed flour was defatted, resulting in the brown defatted flaxseed meal (BDFM). The flaxseed protein concentrate (FPC) was obtained from the BDFM by alkaline extraction and precipitation at the isoelectric point followed by neutralization. To obtain the flaxseed protein hydrolysates (FPL), using FPC and Alcalase, a central composite rotational design (DCCR) was performed. The independent variables were pH ranging from 7.5 to 9.5 and enzyme: substrate ratio (E: S) that ranged from 1:150 to 1:30. The dependent variables were the degree of hydrolysis (DH), total phenolic content and antioxidant activity, determined by FRAP and ORAC. Phenolic and antioxidant activity were evaluated from the aqueous and methanol (70% methanol). The hydrolysates with the highest antioxidant activity, the CPL FLMD were submitted to the in vitro digestion. The samples obtained before and after the in vitro digestion were characterized by electrophoresis SDS-PAGE- tricine and HPLC. The total phenolic content and antioxidant activity of FLMD, CPL and HPL were evaluated before and after in vitro digestion. The optimum conditions to obtain HPL with the highest GDH (21.0%) are pH (7.5-8) and E:S ratio (1:60-1:30), which indicates that the Alcalase optimum pH and highest E:S ratio collaborates to highest hydrolysis of CPL. To obtain HPL with higher content of Folin-Ciocalteau reducing compounds content in aqueous (EAG 24 mg / g HPL) and methanol (20 mg EAG / g HPL) extracts, the optimum conditions were pH ~ 8.5 / E: S 1:30. This result seems to be related to the release of phenolic compounds bound to protein and also of peptides during hydrolysis. The highest antioxidant activity determined by the FRAP method in the aqueous extract (42 mg SF / g HPL) occurs under pH ~ 9.5 / E: S ~ 1:150 and the methanol extract (40 mg SF / g HPL) pH 8.5-9.0 / E: S 1:90-1:150. For the ORAC method, optimum conditions for increased antioxidant activity in aqueous extract (300 µmol TE / g HPL) are pH 7.5-9.5 / E: S ~ 1:30 or 1:150 and the methanol extract (330 µmol TE / g HPL) are pH ~ 8.5 / E: S 1:30-1:150. The hydrolysates with the highest antioxidant activities were obtained at pH 8.5 / E: S 1:90, and at pH 9.2 / E: S 1:133 denominated HPL ) and HPL 3, respectively. For FLMD, CPL and hydrolysates, after in vitro digestion, the content increased (9-20 times) for all samples. The Folin-Ciocalteau reducing capacity of the CPL (EAG ~ 24 mg / g sample) in both extracts after in vitro digestion equaled the content of hydrolysates (EAG ~ 23 mg / g sample). This result suggests that both hydrolysis with Alcalase and the digestion process are able to release phenolic compounds from the flaxseed products. The antioxidant activity of extracts of FLMD, CPL determined by FRAP, also increased (from 3 to 10 times) after digestion, but did not reached the antioxidant activity of hydrolysates (48 mg SF / g sample). However, when the activity was determined by ORAC, the FPC showed value similar to the hydrolysates, measured on the aqueous extract (~ 420.24 µmol TE / g sample) and 10% higher than on the methanol extract (~ 365 µmol TE / g sample). After in vitro digestion, hydrolysates showed the highest antioxidant activity measured by FRAP (SF 50 mg / g sample), and the FPC, the highest activity determined by ORAC method (~ 430 micromol TE / g sample). These results suggest that digestive process are equally or more effective than Alcalase in releasing peptides and phenolic compounds present in the FPC. Since the methodology for determining the antioxidant activity by ORAC utilizes a biologically relevant radical source, these results suggest the use of FPC as the best protein product of flaxseed with potential antioxidant in the formulation of nutraceuticals and functional foods / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

The physicochemical properties of tuna protein hydrolysates were enhanced by interaction with sodium alginate. The increase in emulsifying capacity and stability was from 50 to 150 m² g⁻¹ and from 36 to 49 min, respectively. The increase in foaming capacity and stability was from 100% to 140% and from 65% to 70%, respectively. The reason for the increased physicochemical properties was the reduced zeta potential level of tuna protein hydrolysates after interaction with sodium alginate. The change in internal structure of tuna protein hydrolysates after interaction with sodium alginate was determined by SEM and FTIR. The SEM results showed that a net cross-linking structure was formed from a sheet structure after the tuna protein hydrolysates interacted with sodium alginate. FTIR demonstrated that parts of the β-sheet of tuna protein hydrolysates were changed into an irregular coiled structure or α-helix after interaction with sodium alginate. In order to understand the interacted complex better, the rheological properties of interacted tuna protein hydrolysates with sodium alginate were further determined. In this study, the one-step was developed, easy-to-operate and cost-effective process that can further add value to tuna protein hydrolysates derived from tuna processing by-products.