The sialidases/neuraminidases represent a family of enzymes whose function is important in the pathogenicity of bacteria and the virulence of influenza. Relenza and Tamiflu represent two drugs that were developed using structure-based drug design (SBDD) and computational-assisted drug design (CADD). These drugs target the active site of the influenza neuraminidase A and B (GH-34 family). Sialidases in the GH-33 family could represent novel drug targets for the treatment of bacterial or parasitic infection. SBDD was employed to develop chemical tools of two GH-33 sialidases, NanB and TcTS. NanB is a potential drug target for S. pneumoniae. The chemical tool developed for NanB follows on from work within the Taylor and Westwood research groups, in which a molecule of CHES and a glycerol were found serendipitously bound within a water channel at an allosteric site. Using this information as a basis for SBDD an allosteric inhibitor of NanB, Optactin was developed. Within this work, synthesis of this inhibitor was achieved and optimised. Optactin was then modified to improve potency. This proceeded through an amide analogue and addition of an arene resulting in a mid- micromolar inhibitor (IC50: 55.4±2.5 μM). Addition of polar substituents improved potency further resulting in a low micromolar inhibitor of NanB, Optactamide (IC50: 3.0±1.7 μM). Application of this tool in vitro demonstrated that NanB and NanA have a role in invasion of S. pneumoniae into lung epithelial cells. TcTS is a potential drug target for the treatment of Chagas disease. A CADD approach using a fragment library was unsuccessful at identifying an allosteric inhibitor of TcTS despite structural similarity with NanB. A re-task of the CADD approach towards the active site was successful in identifying an inhibitor of TcTS and a fragment useful for further development. This work sets the groundwork for the development of a chemical tool targeting TcTS.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:02:01Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_dr_botfm.pdf: 1064227 bytes, checksum: 6970ff58c4a9d38097a4690dd21b1c4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... / The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher’s interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034_20171203.pdf: 153851 bytes, checksum: 30ebdc494e0c9267585653b781683912 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-12-08T12:00:13Z: 000865034_20171203.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-12-08T12:01:06Z : No. of bitstreams: 1 000865034.pdf: 1774770 bytes, checksum: cbbb1c1e9d8ae900c12fb9153a166e2e (MD5) / A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic

Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Coorientador: Teresa Cristina Goulart de Oliveira-Sequeira / Banca: Silvana Torossian Coradi / Banca: Clélia Akiko Hiruma Lima / Banca: Sérgio de Albuquerque / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases (antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24, 48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 μM, quando foi possível... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher's interest, once they have been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth, adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer, whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially after exposure to 100 μM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and cytoplasmic disorganization and drastic changes in... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A partir de uma biblioteca metagenômica de um consórcio microbiano degradador de óleo diesel, um clone (PL3C3) expressando um novo gene de protease foi selecionado dentre vinte e seis positivos para degradação de azocaseína. Através do sequenciamento, foi analisado um contig e identificado uma ORF que codifica a proteína, denominada ORF19 composta por 966 pb, 321 aminoácidos, exibindo 69% de identidade com uma alfa/beta hidrolase de Parvibaculum lavamentivorans DS-1(número de acesso ABS62095.1). A sequência da ORF19 após análise em um banco de dados de protease - MEROPS - mostrou 74,3% de identidade com uma serino-protease da família S9U (número de acesso MER095859). Através da análise filogenética, foi possível sugerir que a ORF19 é um novo membro desta família exibindo a tríade catalítica e motivos conservados característicos. A massa molecular da proteína foi estimado em 35 kDa, tendo por base a sua composição em aminoácidos e estimativas junto ao programa Protparam, e considerando o padrão de migração eletroforética da proteína em condições desnaturantes. O gene da ORF19 foi clonado no vetor de expressão pET28a, porém, a proteína recombinante não foi super-expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Contudo, a troca de hospedeiro, vetor, e estudos para uma super-expressão é necessário para a obtenção da proteína, visando sua futura caracterização. Este estudo contribui para a descoberta de uma nova serino-protease utilizando abordagens moleculares, como a metagenômica / Abstract: From a metagenomic library of a microbial consortium that degrades diesel oil, a clone (PL3C3) expressing a novel protease gene was selected from twenty six positive for azocasein degradation. Through sequencing, an analysis was made contig and identified an ORF encoding a protein, called ORF19 composed of 966 bp, 321 amino acids, exhibiting 69% identity with an alpha / hydrolase beta Parvibaculum lavamentivorans DS-1 (accession number ABS62095. 1). The sequence of ORF19 after analysis of a protease database - MEROPS - showed 74.3% identity with a serine protease family S9U (access number MER095859). Through phylogenetic analysis, it was possible to suggest that ORF19 is a new member of this family displaying the catalytic triad and characteristic conserved motifs. The molecular mass of the protein was estimated at 35 KDa, based on its amino acid composition and estimates Protparam by the program, and considering the pattern of electrophoretic migration of the protein under denaturing conditions. The ORF19 gene was cloned into the pET28a expression vector, but not the recombinant protein was overexpressed in E. coli BL21 (DE3). However, the exchange of host, vector, and studies for overexpression is required to obtain the protein, for their further characterization. This study contributes to the discovery of a new serine protease using molecular approaches, as metagenomic / Mestre

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-23T13:40:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_M.pdf: 3586687 bytes, checksum: c237f07c98d63bb8fea1e7e5a22bb2b4 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A aprotinina é um inibidor de proteases presente em alguns órgãos bovinos como pâncreas, fígado e pulmão. Neste trabalho, as enzimas tripsina e quimotripsina (suínas e bovinas) foram utilizadas como ligantes imobilizados em matriz de agarose visando a recuperação de aprotinina presente em efluente de processamento industrial de insulina através de adsorção por afInidade. As quatro enzimas foram imobilizadas em agarose ativada com bisoxirana e avaliadas quanto a capacidade de adsorção de aprotinina pura, o que permitiu a seleção da tripsina suína e quimotripsina bovina como os ligantes de maior efIciência. Estas proteases foram ainda imobilizadas com sucesso em gel de agarose previamente ativado com brometo de cianogênio, o que permitiu a comparação entre dois métodos distintos de ativação e imobilização de enzimas. O gel de agarose ativado com brometo de cianogênio com tripsina suína imobilizada foi o que apresentou maior capacidade de adsorção de aprotinina pura (12,6 mg!g). Estudo-se, para ambas as enzimas, a influência do pH e força iônica na adsorção e dessorção da aprotinina, em faixas próximas aos valores encontrados na literatura, através de planejamento estatístico experimental. A influência do pH mostrou ser menor para o processo de adsorção e maior para a dessorção, ocorrendo o inverso para a influência da força iônica, principalmente quando o ligante utilizado foi a tripsina. Estudos de adsorção em coluna de leito fIxo para recuperação do inibidor presente em efluente do processamento industrial da insulina produzida a partir de pâncreas bovino constataram a presença de inibição que pôde ser recuperada utilizando ambas as enzimas como ligantes. A análise do poder de inibição de tripsina e quimotripsina, bem como os ensaios de eletroforese das frações dessorvidas das colunas indicam fortemente que o inibidor recuperado é aprotinina / Abstract: Aprotinin is a protease inhibitor found in bovine organs like pancreas, lung and liver. In this work, trypsin and chymotrypsin (bovine and swine) were immobilized in agarose and used as ligands for aprotinin recovery from industrial insulin process wastewater via affinity adsorption. The enzymes were immobilized on bisoxirane activated agarose and evaluated by their aprotinin adsorption capacity. Swine trypsin and bovine chymotrypsin were chosen as the most efficient ligands. These proteases were also immobilized on cianogen bromide activated agarose allowing the comparison of the two activation methods. Swine trypsin immobilized on cianogen bromide activated agarose had the highest aprotinin adsorption capacity (12,6 mglg). The effects of pH and ionic strength on aprotinin adsorption and desorption for immobilized swine trypsin and bovine chymotrypsin were studied using a experimental design method. The effect of the ionic strength was higher than that of the pH on aprotinin adsorption. The effect of pH was the most significant on the aprotinin desorption. Fixed bed adsorption studies with insulin process wastewater showed that inhibition could be recovered using both enzymes as ligands. Analysis of trypsin and chymotrypsin inhibition and electrophoresis assay of chromatographic fractions strongly suggested that the inhibitor recovered is aprotinin / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A giroxina é uma enzima serinoprotease do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. É uma toxina apenas parcialmente caracterizada e com múltiplas atividades. Atua na coagulação, na diminuição da pressão arterial e induz um comportamento neurotóxico descrito como rolamento em barril. Os mecanismos envolvidos nestas atividades não são conhecidos. Considerando que a giroxina é uma enzima com alto potencial para ser um novo fármaco com aplicações em clínica médica como a trombina, tripsina, ancrod®, batroxobin® e calicreína, é importante determinar como a giroxina atua. As análises em eletroforese em gel de poliacrilamida e dicroísmo circular confirmaram a pureza e integridade da molécula. A administração intravenosa em camundongos comprovou a neurotoxicidade (rolamento em barril). O estudo in vivo com microscopia intravital comprovou que a giroxina induz vasodilatação com participação dos receptores ativados por proteases (PARs), do óxido nítrico e da Na+K+ATPase. A adesão e rolamento de leucócitos indicaram que não possui atividade pró-inflamatória. A giroxina induziu a agregação plaquetária, que foi bloqueada pelos inibidores dos receptores PAR-1 e PAR-4 (SCH 79797 e tcY-NH2, respectivamente). Finalmente, foi demonstrado que a giroxina alterou temporariamente a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Neste estudo foi comprovado que os receptores ativados por proteases e o óxido nítrico são mediadores envolvidos nas atividades biológicas da giroxina. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

As plantas sintetizam inibidores de proteinases (IPs) como um dos mecanismos de defesa contra o ataque de insetos-praga. Esses inibidores atuam ligando-se às proteinases digestivas localizadas no aparelho digestivo dos insetos fitófagos, impedindo sua atividade proteolítica. Como conseqüência, ocorre uma redução da disponibilidade de aminoácidos levando a um quadro de deficiência nutricional. Portanto, os IPs são considerados agentes anti-metabólicos. Heliothis virescens (Fabr.,1781) é um inseto-praga de polifagia acentuada, atacando várias culturas de importância econômica. Na tentativa de estudar os efeitos de IPs produzidos pelo fumo e de plantas transgênicas de fumo expressando um IP de batata sobre o desenvolvimento da lagarta desta espécie, foram realizados ensaios biológicos nos quais lagartas foram criadas em dieta artificial (sem inibidor), em plantas de fumo transgênicas (expressando o IP do tipo 2 de batata conhecido como PIN2) e em plantas fumo normais (controle). Os ensaios biológicos mostraram que as lagartas de H. virescens apresentaram crescimento e desenvolvimento normais quando em presença do PIN2. A fim de estudar a adaptação das lagartas à presença dos IPs, foram realizados ensaios bioquímicas envolvendo a caracterização das proteinases intestinais das lagartas. A combinação de técnicas de separação de proteínas pelo peso molecular via eletroforese em gradiente de poliacrilamida (SDS-PAGE) e estudos cinéticos, mostraram a expressão de quatro enzimas do tipo das tripsinas (TI- T4) nos homogeneizados do tubo digestivo de lagartas alimentadas com plantas de fumo (transgênicas ou não) com as seguintes propriedades: T1 (Km= 0,27 mM, PM= 70 kDa),T2 (Km= 0,35 mM, PM= 67 kDa), T3 (Km= 2,4 mM, PM= 29 kDa), T4 (Km= 15 mM, PM= 17 kDa). No entanto, lagartas alimentadas em dieta sem inibidor apresentaram apenas uma tripsina majoritária (Km= 2,9 mM, PM= 29 kDa), o que está de acordo com o peso molecular das tripsinas normalmente encontradas nas lagartas de lepidópteros. Além das tripsinas, foram detectadas uma quimotripsina (26 kDa) para os três tratamentos e uma elastase (35 kDa) para os homogeneizados de lagartas alimentadas à base de folhas. Eletroforese nativa em diferentes concentrações de géis de poliacrilamida mostrou que T1 e T2 ocorreram em lagartas alimentadas com folhas (selvagens ou transgênicas), ao passo que a filtração em gel, na presença ou ausência de SDS, revelou ainda que T3 e T4 podem originar TI e T2. Estes resultados sugerem que a presença de IPs nas folhas de fumo permite a expressão de novas moléculas de tripsina com uma superfície hidrofóbica, a qual favorece a formação de oligômeros. Acredita-se que os oligômeros sejam menos afetados pelos IPs por que se ligam melhor ao substrato diminuindo a afinidade dos IPs, ou ainda por hidrolisá-los. O Papel da elastase na adaptação é incerto / not available