CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / mRNA sequences coding for two cystatins were isolated from leaves of hydroponically growing cowpea plants. The sequences were ligated in the expression vector pET302NT-HIS, which was introduced into Escherichia coli, ArcticExpress (DE3) cells. The expression was induced by addition of 0.5 mM IPTG and the recombinant proteins VuCys1 (Vigna unguiculata one-domain cystatin) and VuCys2 (Vigna unguiculata two-domain cystatin), both fused to an N-terminal 6x-His tag, were purified by homogeneity using an affinity matrix containing Ni2+ immobilized to Sepharose. The apparent molecular masses for VuCys1 (yield of 10 mgP.L-1 culture) and VuCys2 (yield of 22 mgP.mL-1 culture) were 14 and 26 kDa, respectively. Both inhibitors were strongly active against the proteinases papain and chymopapain, while bromelain and particularly cathepsin B were less susceptible to in vitro inhibition. No inhibition was detected against the serine proteinase trypsin. Thermal stability tests revealed that both cystatins are thermostable proteins able to achieve a minimum residual proteolytic inhibition activity against papain of 95% (VuCys1) and 85% (VuCys2) when incubated at 100 C for 60 minutes. Similar stability results were also obtained when the proteins were tested to the ability of to inhibit papain activity after incubation in pH values ranging from 2.0 to 11.0. Circular dichroism spectroscopy measurements demonstrated that the secondary structure arrangement of both cystatins undergoes only fewer alterations when both proteins were incubated in temperatures varying from 10 to 90 C and pH values varying from 2.0 to 11.0, as well. These data are in agreement with the thermal and pH stability results previously obtained on papain inhibition assays. Biological assays conducted with different phytopathogenic fungi didnât show any negative impact on spore germination as well as on mycelial growth of the tested fungi. Different human pathogens, including the pathogenic yeast Candida albicans were shown to be insensible to VuCys1 and VuCys2. Some scientific reports have proposed the use of cystatins as potential molecules in the control and inhibition of the activity of cysteine proteinases related to carcinogenic process. However, cytotoxicity assays performed on three tumor cell lineages revealed no toxic effects of VuCys1 and VuCys2. Inhibitor activities were also tested against digestive enzymes isolated from third instar larvae of the bruchid insects Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus, two major cowpea plagues. Both cystatins were able to cause high inhibition of C. maculatus enzymes; however they were poorly active against Z. subfasciatus counterpart. Feeding tests were conducted in which both cystatins were added to artificial seeds at final concentrations of 0.025, 0.05 and 0.1% and supplied to C. maculatus. Despite the in vitro inhibition of C. maculatus larvae enzymes, the bioassay data suggest that larvae and adult insects appear to develop adaptive mechanisms which can make them insensible to the ingestion of the inhibitors. Crystallographic studies were carried out in order to solve the tridimensional structure of cystatins. 576 different crystallization conditions were tested in which three were favorable to the formation and growth of diffractable crystals of VuCys1 protein. These crystals belong to the orthorhombic space group P212121 and the unit cell dimension was a = 41.48 Ã; b = 64.68 à and c = 87.91 Ã, α = β = γ = 90. V. unguiculata one-domain cystatin presents a typical 3D domain swapped dimmer molecular structure, which was solved at 1.95 à resolution. No crystals were obtained for VuCys2. The physiological importance of this structure to the plant, the structural stability of both inhibitors and the results raised from biological assays are all discussed in this work. / SequÃncias de mRNA que codificam para duas cistatinas foram isoladas de folhas de plantas de feijÃo-caupi cultivadas em sistema hidropÃnico. As sequÃncias foram ligadas no vetor de expressÃo pET302NT-His, o qual foi introduzido em cÃlulas de Escherichia coli, ArcticExpress (DE3). A induÃÃo da expressÃo foi realizada por meio de adiÃÃo de IPTG (0,5 mM) e as proteÃnas recombinantes VuCys1 â (cistatina de um domÃnio de Vigna unguiculata) e VuCys2 â (cistatina de dois domÃnios de V. unguiculata) ambas fusionadas a uma cauda de histidina N-terminal, foram purificadas por homogeneidade em matriz de afinidade constituÃda de Ni2+ imobilizado à Sepharose. VuCys1 apresentou uma massa molecular aparente de 14 kDa e um rendimento de 10 mgP.L-1 de meio de cultura, jà a proteÃna VuCys2 mostrou uma massa molecular aparente de 26 kDa e um rendimento de 22 mgP.L-1 de meio de cultura. As duas proteÃnas foram fortemente ativas contra as proteinases papaÃna e quimopapaÃna, moderadamente ativas contra bromelaÃna e apenas fracamente ativas contra catepsina B, enquanto que nenhuma atividade inibitÃria foi detectada contra a proteinase serÃnica tripsina. Ensaios de estabilidade tÃrmica mostraram que as duas cistatinas sÃo proteÃnas termoestÃveis, uma vez que, mesmo apÃs incubaÃÃo a 100 C por 60 minutos apresentam atividade inibitÃria residual contra papaÃna superior a 95% (VuCys1) e superior a 85% (VuCys2). Resultados similares de estabilidade tambÃm foram obtidos quando as proteÃnas foram testadas quanto à capacidade de inibir a atividade de papaÃna, apÃs incubaÃÃo em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. AnÃlises espectroscÃpicas de dicroÃsmo circular revelaram que o padrÃo de estruturas secundÃrias de ambos inibidores sofre pouca alteraÃÃo apÃs incubaÃÃo em temperaturas variando de 10 a 90 C e em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Estes dados estÃo de acordo com os resultados de elevada estabilidade tÃrmica e a extremos de pH previamente obtidos nos ensaios de inibiÃÃo in vitro de papaÃna. Ensaios biolÃgicos realizados com diferentes espÃcies de fungos fitopatogÃnicos nÃo mostraram nenhum efeito negativo das proteÃnas sobre a germinaÃÃo de esporos ou crescimento micelial dos fungos testados. Os inibidores tambÃm nÃo se mostraram ativos contra diferentes patÃgenos humanos, incluindo a levedura patogÃnica Candida albicans. Alguns relatos cientÃficos propÃem o uso de cistatinas como agentes em potencial no controle e inibiÃÃo da atividade de proteinases cisteÃnicas relacionados a processos carcinogÃnicos. Contudo, testes de citotoxicidade dos inibidores para trÃs diferentes linhagens de cÃlulas tumorais nÃo mostraram potencial citotÃxico. Os inibidores tambÃm foram testados quanto à capacidade de inibir a atividade de enzimas digestivas isoladas do intestino de larvas de terceiro instar dos insetos bruquÃdeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, duas importantes pragas do feijÃo-caupi. Ambas as cistatinas apresentaram elevado potencial inibitÃrio contra as enzimas de C. maculatus sendo, porÃm, fracamente ativas contra as de Z. subfasciatus. Bioensaios foram realizados nos quais as cistatinas foram inseridas em sementes artificiais nas concentraÃÃes finais de 0,025; 0,05 e 0,1% e administradas a C. maculatus. A despeito da inibiÃÃo in vitro das enzimas digestivas das larvas de C. maculatus, os resultados do bioensaio sugerem que, tanto larvas como insetos adultos, parecem desenvolver mecanismos adaptativos à administraÃÃo dos inibidores que os tornam insensÃveis à sua ingestÃo. Estudos cristalogrÃficos foram realizados na tentativa de solucionar a estrutura tridimensional das cistatinas. 576 condiÃÃes de cristalizaÃÃo foram testadas das quais trÃs levaram à formaÃÃo e crescimento de cristais difratÃveis de VuCys1. Os cristais pertencem ao grupo espacial ortorrÃmbico, P212121, e a cÃlula unitÃria apresentou dimensÃes de a = 41,48; b = 64,68 e c = 87,91 Ã, α = β = γ = 90. VuCys1 apresenta uma estrutura molecular de dÃmero de domÃnios trocados a qual foi resolvida a uma resoluÃÃo de 1,95 Ã. Cristais de VuCys2 nÃo foram obtidos nas condiÃÃes testadas. O significado fisiolÃgico desta estrutura para a planta, a estabilidade estrutural de ambos inibidores e os resultados referentes aos diferentes bioensaios sÃo discutidos no presente trabalho.

Receptores ativados por protease (PARs) pertencem à família de GPCRs. Desses, PAR-1, PAR-3 e PAR-4 são ativados por trombina, e PAR-2 por tripsina. Como as proteases, peptídeos sintéticos (PARs-AP) também ativam esses receptores. Estudamos o papel dos PARs na reatividade vascular de Wistar e SHR. In vitro, PAR-1 AP, promoveu maior vasoconstrição em aorta com endotélio (E+) de SHR vs Wistar. PAR-2 AP promoveu vasodilatação similar em aorta E+ de SHR e Wistar, enquanto PAR-4 AP e peptídeos reversos não causaram efeito. In vivo/in situ PAR-1 e PAR-2 AP mostraram intensa vasomotilidade em arteríolas mesentéricas. A expressão gênica de PAR-1 está aumentada em aorta e arteríolas de SHR, mas a expressão protéica está aumentada apenas em arteríolas. Demonstramos ainda que a vasoconstrição induzida por PAR-1 AP, é dependente de Ca++ e da liberação de Ang II, ET-1 e O2- pelo endotélio. Assim, sugerimos que PAR-1 pode ser um alvo terapêutico para novos antihipertensivos com efeito antitrombótico, já que este receptor também tem sido envolvido em eventos romboembólicos. / Protease activated receptors are a new GPCRs family. The PAR-1, PAR-3 and PAR-4 are activated by thrombin and PAR-2 by tripsin. Like proteases, synthetic peptides (PARs-AP) can also activate those receptors. We studied the role of PARs in vascular reactivity of Wistar and SHR. In vitro, PAR-1 promoted higher vasoconstriction to PAR-1 AP in SHR aorta with endothelium (E+) than the Wistar ones. PAR-2 AP produced similar vasodilation in Wistar and SHR aorta E+, while neither PAR-4 nor reverse peptides presented any effect. In vivo/in situ PAR-1 and PAR-2 showed an intensive vasomotion in mesenteric vessels. PAR-1 gene expression was increased in SHR aorta and arterioles, while the protein expression was increased only in the arterioles. We have also shown that the vasoconstriction induced by PAR-1 AP, is Ca++-dependent and Ang II, ET-1 and O2- release from endothelium. Thus, we suggest that PAR-1 might represent a therapeutic target to new antihypertensive drugs with antithrombotic effect, since this receptor has been involved in thromboembolics events.

As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução, desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e insensíveis aos IPs de plantas. Uma das abordagens desse trabalho foi identificar novas serinoproteinases no intestino de lagartas de Spodoptera frugiperda. Duas novas quimotripsinas e trê novas tripsinas foram identificadas e juntamente com mais 10 genes já conhecidos que codificam estas enzimas foram submetidos à análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Entre essas duas famílias de serinoproteinases (SPs) os genes que codificam as quimotripsinas apresentam uma regulação positiva mais ampla do que aqueles que codificam as tripsinas. Estudos de modelagem molecular das quimotripsinas também foram realizados. Foram construídos modelos tridimensionais à partir de modelagem por homologia além de análises de dinâmica molecular e docagem com oito diferentes IPs do tipo Bowman- Birk. Os resultados mostram quais quimotripsinas apresentam as maiores afinidades aos inibidores testados de maneira geral e individual, inferidos à partir da estimativa de energia livre do sistema. Também foi encontrada uma serina extra próxima ao sítio catalítico de três quimotrispsinas modeladas que pode interferir na afinidade dessas enzimas já que este aminoácido apresenta perda de área acessível ao solvente quando complexada ao IP de soja testado. Os resultados de expressão gênica e grau de sensibilidade foram comparados e não se observou qualquer relação entre esses parâmentros. Isso sugere que as lagartas da espécie S. frugiperda combinam diferentes estratégias adaptativas como o aumento de expressão de todas as suas quimotripsinas independentemente do grau de sensibilidade das enzimas. / Plants have developed different mechanisms to reduce insect attack, including defence proteins such as proteinase inhibitors (PIs). In turn, insects have evolved strategies to overcome these plant defence mechanisms, such as the hyperexpression of PI-sensitive and insensitive digestive enzymes, allowing the insect to thrive. One of the aims of this work was to identify new serine proteinases (SPs) in the gut of the fall armyworm larvae, Spodoptera frugiperda. Two new chymotrypsins and three new trypsins were identified, and together with 10 previously identified genes, the genes that encode these enzymes were subjected to real-time PCR and gene expression analysis. Between these two families of serine-proteinases the genes that encode chymotrypsins show a greater positive regulation then those encoding the trypsins. Molecular modelling studies of the chymotrypsins were carried out, and 3D models were generated using homology modelling, which were then further refined by dynamic molecular and docking analyses with 8 different Bowman-Birk type PIs. The results demonstrate which chymotrypsins possess the highest affinities to the tested inhibitors in a general and individual manner, inferred from the estimated free energies. A serine residue in very close proximity to the catalytic site was present in three of chymotrypsins investigated, which may be affecting the enzymes affinity since the residue has a reduced accessible area to the solvent when complexed to the soya PI tested. The genetic expression patterns and the degree of PI-sensitivity were also compared and no relation between the parameters was found. This suggests that the larvae of the species S. frugiperda combine different adaptive strategies like the increase in expression of its entire chymotrypsin arsenal regardless of the degree of PI-sensitivity of the enzymes.

As plantas desenvolveram diferentes mecanismos para reduzir o ataque de insetos, incluindo compostos protéicos de defesa, como os inibidores de proteinases (IPs). Os insetos, ao longo da evolução, desenvolveram estratégias para superar as barreiras defensivas das plantas, permitindo a sua alimentação e desenvolvimento, como a super expressão de genes de enzimas digestivas sensíveis e insensíveis aos IPs de plantas. Uma das abordagens desse trabalho foi identificar novas serinoproteinases no intestino de lagartas de Spodoptera frugiperda. Duas novas quimotripsinas e trê novas tripsinas foram identificadas e juntamente com mais 10 genes já conhecidos que codificam estas enzimas foram submetidos à análise de expressão gênica por PCR em tempo real. Entre essas duas famílias de serinoproteinases (SPs) os genes que codificam as quimotripsinas apresentam uma regulação positiva mais ampla do que aqueles que codificam as tripsinas. Estudos de modelagem molecular das quimotripsinas também foram realizados. Foram construídos modelos tridimensionais à partir de modelagem por homologia além de análises de dinâmica molecular e docagem com oito diferentes IPs do tipo Bowman- Birk. Os resultados mostram quais quimotripsinas apresentam as maiores afinidades aos inibidores testados de maneira geral e individual, inferidos à partir da estimativa de energia livre do sistema. Também foi encontrada uma serina extra próxima ao sítio catalítico de três quimotrispsinas modeladas que pode interferir na afinidade dessas enzimas já que este aminoácido apresenta perda de área acessível ao solvente quando complexada ao IP de soja testado. Os resultados de expressão gênica e grau de sensibilidade foram comparados e não se observou qualquer relação entre esses parâmentros. Isso sugere que as lagartas da espécie S. frugiperda combinam diferentes estratégias adaptativas como o aumento de expressão de todas as suas quimotripsinas independentemente do grau de sensibilidade das enzimas. / Plants have developed different mechanisms to reduce insect attack, including defence proteins such as proteinase inhibitors (PIs). In turn, insects have evolved strategies to overcome these plant defence mechanisms, such as the hyperexpression of PI-sensitive and insensitive digestive enzymes, allowing the insect to thrive. One of the aims of this work was to identify new serine proteinases (SPs) in the gut of the fall armyworm larvae, Spodoptera frugiperda. Two new chymotrypsins and three new trypsins were identified, and together with 10 previously identified genes, the genes that encode these enzymes were subjected to real-time PCR and gene expression analysis. Between these two families of serine-proteinases the genes that encode chymotrypsins show a greater positive regulation then those encoding the trypsins. Molecular modelling studies of the chymotrypsins were carried out, and 3D models were generated using homology modelling, which were then further refined by dynamic molecular and docking analyses with 8 different Bowman-Birk type PIs. The results demonstrate which chymotrypsins possess the highest affinities to the tested inhibitors in a general and individual manner, inferred from the estimated free energies. A serine residue in very close proximity to the catalytic site was present in three of chymotrypsins investigated, which may be affecting the enzymes affinity since the residue has a reduced accessible area to the solvent when complexed to the soya PI tested. The genetic expression patterns and the degree of PI-sensitivity were also compared and no relation between the parameters was found. This suggests that the larvae of the species S. frugiperda combine different adaptive strategies like the increase in expression of its entire chymotrypsin arsenal regardless of the degree of PI-sensitivity of the enzymes.

MONTEIRO JUNIOR, José Edvar. Caracterização bioquímica, funcional e estrutural de duas cistatinas recombinantes de feijão-caupi. 2012. 179 f.Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T14:56:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:37:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) Previous issue date: 2012 / mRNA sequences coding for two cystatins were isolated from leaves of hydroponically growing cowpea plants. The sequences were ligated in the expression vector pET302NT-HIS, which was introduced into Escherichia coli, ArcticExpress (DE3) cells. The expression was induced by addition of 0.5 mM IPTG and the recombinant proteins VuCys1 (Vigna unguiculata one-domain cystatin) and VuCys2 (Vigna unguiculata two-domain cystatin), both fused to an N-terminal 6x-His tag, were purified by homogeneity using an affinity matrix containing Ni2+ immobilized to Sepharose. The apparent molecular masses for VuCys1 (yield of 10 mgP.L-1 culture) and VuCys2 (yield of 22 mgP.mL-1 culture) were 14 and 26 kDa, respectively. Both inhibitors were strongly active against the proteinases papain and chymopapain, while bromelain and particularly cathepsin B were less susceptible to in vitro inhibition. No inhibition was detected against the serine proteinase trypsin. Thermal stability tests revealed that both cystatins are thermostable proteins able to achieve a minimum residual proteolytic inhibition activity against papain of 95% (VuCys1) and 85% (VuCys2) when incubated at 100 C for 60 minutes. Similar stability results were also obtained when the proteins were tested to the ability of to inhibit papain activity after incubation in pH values ranging from 2.0 to 11.0. Circular dichroism spectroscopy measurements demonstrated that the secondary structure arrangement of both cystatins undergoes only fewer alterations when both proteins were incubated in temperatures varying from 10 to 90 C and pH values varying from 2.0 to 11.0, as well. These data are in agreement with the thermal and pH stability results previously obtained on papain inhibition assays. Biological assays conducted with different phytopathogenic fungi didn’t show any negative impact on spore germination as well as on mycelial growth of the tested fungi. Different human pathogens, including the pathogenic yeast Candida albicans were shown to be insensible to VuCys1 and VuCys2. Some scientific reports have proposed the use of cystatins as potential molecules in the control and inhibition of the activity of cysteine proteinases related to carcinogenic process. However, cytotoxicity assays performed on three tumor cell lineages revealed no toxic effects of VuCys1 and VuCys2. Inhibitor activities were also tested against digestive enzymes isolated from third instar larvae of the bruchid insects Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus, two major cowpea plagues. Both cystatins were able to cause high inhibition of C. maculatus enzymes; however they were poorly active against Z. subfasciatus counterpart. Feeding tests were conducted in which both cystatins were added to artificial seeds at final concentrations of 0.025, 0.05 and 0.1% and supplied to C. maculatus. Despite the in vitro inhibition of C. maculatus larvae enzymes, the bioassay data suggest that larvae and adult insects appear to develop adaptive mechanisms which can make them insensible to the ingestion of the inhibitors. Crystallographic studies were carried out in order to solve the tridimensional structure of cystatins. 576 different crystallization conditions were tested in which three were favorable to the formation and growth of diffractable crystals of VuCys1 protein. These crystals belong to the orthorhombic space group P212121 and the unit cell dimension was a = 41.48 Å; b = 64.68 Å and c = 87.91 Å, α = β = γ = 90. V. unguiculata one-domain cystatin presents a typical 3D domain swapped dimmer molecular structure, which was solved at 1.95 Å resolution. No crystals were obtained for VuCys2. The physiological importance of this structure to the plant, the structural stability of both inhibitors and the results raised from biological assays are all discussed in this work. / Sequências de mRNA que codificam para duas cistatinas foram isoladas de folhas de plantas de feijão-caupi cultivadas em sistema hidropônico. As sequências foram ligadas no vetor de expressão pET302NT-His, o qual foi introduzido em células de Escherichia coli, ArcticExpress (DE3). A indução da expressão foi realizada por meio de adição de IPTG (0,5 mM) e as proteínas recombinantes VuCys1 – (cistatina de um domínio de Vigna unguiculata) e VuCys2 – (cistatina de dois domínios de V. unguiculata) ambas fusionadas a uma cauda de histidina N-terminal, foram purificadas por homogeneidade em matriz de afinidade constituída de Ni2+ imobilizado à Sepharose. VuCys1 apresentou uma massa molecular aparente de 14 kDa e um rendimento de 10 mgP.L-1 de meio de cultura, já a proteína VuCys2 mostrou uma massa molecular aparente de 26 kDa e um rendimento de 22 mgP.L-1 de meio de cultura. As duas proteínas foram fortemente ativas contra as proteinases papaína e quimopapaína, moderadamente ativas contra bromelaína e apenas fracamente ativas contra catepsina B, enquanto que nenhuma atividade inibitória foi detectada contra a proteinase serínica tripsina. Ensaios de estabilidade térmica mostraram que as duas cistatinas são proteínas termoestáveis, uma vez que, mesmo após incubação a 100 C por 60 minutos apresentam atividade inibitória residual contra papaína superior a 95% (VuCys1) e superior a 85% (VuCys2). Resultados similares de estabilidade também foram obtidos quando as proteínas foram testadas quanto à capacidade de inibir a atividade de papaína, após incubação em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular revelaram que o padrão de estruturas secundárias de ambos inibidores sofre pouca alteração após incubação em temperaturas variando de 10 a 90 C e em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Estes dados estão de acordo com os resultados de elevada estabilidade térmica e a extremos de pH previamente obtidos nos ensaios de inibição in vitro de papaína. Ensaios biológicos realizados com diferentes espécies de fungos fitopatogênicos não mostraram nenhum efeito negativo das proteínas sobre a germinação de esporos ou crescimento micelial dos fungos testados. Os inibidores também não se mostraram ativos contra diferentes patógenos humanos, incluindo a levedura patogênica Candida albicans. Alguns relatos científicos propõem o uso de cistatinas como agentes em potencial no controle e inibição da atividade de proteinases cisteínicas relacionados a processos carcinogênicos. Contudo, testes de citotoxicidade dos inibidores para três diferentes linhagens de células tumorais não mostraram potencial citotóxico. Os inibidores também foram testados quanto à capacidade de inibir a atividade de enzimas digestivas isoladas do intestino de larvas de terceiro instar dos insetos bruquídeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, duas importantes pragas do feijão-caupi. Ambas as cistatinas apresentaram elevado potencial inibitório contra as enzimas de C. maculatus sendo, porém, fracamente ativas contra as de Z. subfasciatus. Bioensaios foram realizados nos quais as cistatinas foram inseridas em sementes artificiais nas concentrações finais de 0,025; 0,05 e 0,1% e administradas a C. maculatus. A despeito da inibição in vitro das enzimas digestivas das larvas de C. maculatus, os resultados do bioensaio sugerem que, tanto larvas como insetos adultos, parecem desenvolver mecanismos adaptativos à administração dos inibidores que os tornam insensíveis à sua ingestão. Estudos cristalográficos foram realizados na tentativa de solucionar a estrutura tridimensional das cistatinas. 576 condições de cristalização foram testadas das quais três levaram à formação e crescimento de cristais difratáveis de VuCys1. Os cristais pertencem ao grupo espacial ortorrômbico, P212121, e a célula unitária apresentou dimensões de a = 41,48; b = 64,68 e c = 87,91 Å, α = β = γ = 90. VuCys1 apresenta uma estrutura molecular de dímero de domínios trocados a qual foi resolvida a uma resolução de 1,95 Å. Cristais de VuCys2 não foram obtidos nas condições testadas. O significado fisiológico desta estrutura para a planta, a estabilidade estrutural de ambos inibidores e os resultados referentes aos diferentes bioensaios são discutidos no presente trabalho.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L) à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios existente em suas sementes. Portanto, à uma fonte potencial de Ãleo renovÃvel que tem recebido considerÃvel atenÃÃo da comunidade cientÃfica. O objetivo deste estudo foi fazer uma anÃlise da expressÃo gÃnica de proteinases cisteÃnicas relacionadas à morte celular programada (MCP) em sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de pinhÃo manso, no intuito de conhecer melhor o transcriptoma dos principais genes envolvidos no processo de MCP e durante a deposiÃÃo de proteÃnas de reservas durante a maturaÃÃo das sementes de pinhÃo manso. Para quantificar com acurÃcia os nÃveis de expressÃo gÃnica por RT-qPCR foi necessÃrio realizar uma seleÃÃo de genes de referÃncia (genes constitutivos). Os genes constitutivos escolhidos para esse estudo foram: GliceraldeÃdo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUB), alfa-tubulina (TA2), proteÃna fosfatase 2-A (PP2A2), fator de alongaÃÃo-alfa (EF1-α) e actina, todos eles citados e escolhidos na literatura para estudo de normalizaÃÃo de genes em plantas. AtravÃs do programa geNorm de foi possÃvel mostrar os genes de referÃncia mais estÃveis dentre os seis genes de referÃncia. Nossos resultados apontaram que os genes de referÃncia mais estÃveis ​​para as amostras de endosperma e integumento em desenvolvimento foram: GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2. Os genes de menor estabilidade foram: a actina11; poliubiquitina (PUB). Na germinaÃÃo, os genes mais estÃveis foram GAPDH, PUB e TA2. Entretanto, os genes com menores valores de estabilidade foram a actina, EF1-α e PP2A2. Em nossos estudos, o programa geNorm tambÃm mostrou o nÃmero de genes de referÃncia necessÃrios para a normalizaÃÃo dos dados obtidos por RT-qPCR. Na anÃlise desse estudo, nos mostramos que para as sementes em desenvolvimento, a adoÃÃo de quatro genes mais estÃveis foram GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2 necessÃrios para normalizaÃÃo dos dados de RT-qPCR. Nos dados de sementes em germinaÃÃo, mostrou-se a adoÃÃo de trÃs genes mais estÃveis ​​(GAPDH, PUB e TA2). Contudo, Para validar nossos resultados com genes de referÃncia, foi usado o perfil padrÃo da expressÃo do gene que expressa a oleosina, na qual mostrou que o padrÃo de expressÃo da oleosina està de acordo com os fornecidos pela literatura, revelando que os genes de referÃncia sÃo eficientes para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. De posse desses resultados, realizou-se um estudo de expressÃo de genes supostamente envolvidos na morte celular programada e na maturaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Nossos resultados mostraram que os genes com seqÃÃncia C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 e o gene γ-VPE JCCB0060111 mostraram um altos nÃveis de expressÃo nos estÃgios mais avanÃados em tecidos do integumento e endosperma em sementes de pinhÃo manso em desenvolvimento, e com base em nossas anÃlises, esses genes expressam proteinases cisteÃnicas que estÃo possivelmente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, os genes que expressam as seguintes VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081; e JcCA0012422 de acordo com nossos estudos, provavelmente estÃo envolvidas na maturaÃÃo das proteÃnas de reservas de sementes em desenvolvimento de pinhÃo manso. Esses dados forneceram importantes informaÃÃes a cerca do padrÃo de expressÃo de genes que estÃo envolvidos no transcriptoma de sementes em desenvolvimento, mais precisamente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, o estudo de normalizaÃÃo e validaÃÃo de genes de referÃncia nos tecidos de integumento e endosperma do pinhÃo manso propiciaram um melhor entendimento no que diz respeito à estabilidade desses genes nas condiÃÃes estudadas. / Jatropha (Jatropha curcas L) is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the wealth of existing lipids in their seeds. Therefore, it is a potential source of renewable oil that has received considerable attention from the scientific community. The objective of this study was to analyze the gene expression of cysteine ​​proteinases related to programmed cell death (PCD) in developing seeds and during germination of Jatropha in order to better understand the transcriptome of the major genes involved in the MCP and during the deposition of protein reserves during maturation of seeds of Jatropha. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR was necessary to make a selection of reference genes (genes constituting). The constituent genes chosen for this study were: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), polyubiquitin (PUB), alpha-tubulin (TA2), protein phosphatase 2 A (PP2A2), elongation factor-alpha (EF1-α) and actin, all cited in the literature and were chosen for study standardization of genes into plants. Through the program of geNorm was possible to show the more stable reference genes among the six genes of reference. Our results indicate that the most stable reference genes for samples of the developing endosperm and integument were: GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2. The genes were less stable: the actina11; polyubiquitin (PUB). In germination, the most stable genes were GAPDH, PUB and TA2. However, genes with lower stability values ​​were actin, EF1-α and PP2A2. In our studies, the geNorm program also showed the number of reference genes needed for normalization of data obtained by RT-qPCR. In the analysis of this study, we show that for the developing seeds, the use of four most stable genes were GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2 needed for normalization of RT-qPCR data. In the data of germinating seeds, was the adoption of more stable three genes (GAPDH, PUB and TA2). However, To validate our findings with reference genes, we used the standard profile of gene expression which expresses oleosina, which showed that the expression pattern of oleosina is provided according to the literature, genes reveals that the reference are efficient to normalize the data obtained by RT-qPCR. With these results, we carried out a study of expression of genes supposedly involved in programmed cell death and maturation of seeds of Jatropha. Our results showed that genes with sequence C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 and γ-VPE gene JCCB0060111 showed high levels of expression in later stages in tissues of the integument and endosperm of seeds of Jatropha in developing and Based on our analysis, these genes express cysteine ​​proteinases that are possibly involved in the MCP. Nevertheless, genes that express the following VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081, and JcCA0012422 according to our studies, are probably involved in the maturation of protein reserves in developing seeds of Jatropha. These data provided important information about the expression pattern of genes that are involved in the transcriptome of developing seed, more specifically involved in the process of MCP. However, the study of standardization and validation of reference genes in tissues of the integument and endosperm Jatropha provided a better understanding as regards the stability of these genes in the studied conditions

published_or_final_version / Physiology / Master / Master of Philosophy

published_or_final_version / Pharmacology and Pharmacy / Master / Master of Philosophy

The Best PhD Thesis in the Faculties of Dentistry, Engineering, Medicine and Science (University of Hong Kong), Li Ka Shing Prize,2008-2009 / published_or_final_version / Pathology / Doctoral / Doctor of Philosophy

In developed countries, breast cancer is the commonest malignancy among women. Understanding the mechanisms involved in breast cancer progression and the influence of the microenvironment on cancer cell proliferation, results in better treatments. This study aimed to optimise breast cancer xenograft rates using a novel chamber developed for tissue engineering purposes. The established tumours were subjected to enzyme digestion, creating a single cell suspension, which was then injected into immunocompromised mice at primary, metastatic and intra-cardiac sites. The resulting tumours in the mammary fat pad (MFP) and bone were compared using species-specific reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and cDNA microarray, to examine the influence of the microenvironment on gene expression. The achieved xenograft graft rates of 25% were similar to those previously reported. The matrix metalloproteinase family of enzymes (MMPs) degrade extracellular matrix, influencing invasion and migration of malignant cells. RT-PCR results showed that the majority of the MMPs expressed in the cancers were stromal rather than tumour in origin. MT1-MMP, MMP-2 and MMP-11 had significantly higher expression levels in the MFP than in the bone, but MMP-9 was expressed more in the bone than MFP. There was also an up-regulation of stromal production of MT1-MMP and MMP-13 in the MFP in the presence of tumour. This may have significance when considering which MMPs are the most appropriate targets for inhibition during cancer treatment. The most significant of the differentially expressed genes on microarray analysis were trefoil factor 1 (TFF1) and insulin growth-factor binding protein 3 (IGFBP-3), both expressed significantly more in tumours from the MFP than the bone. The thesis presented demonstrates some of the complexities of tumour-stromal interactions and supports Paget’s seed-soil theory, confirming in several ways the variation in gene expression in breast cancer between primary and metastatic sites.