Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Rodrigo Simões Ribeiro Leite / Banca: Fabiana Fonseca Zanoelo / Resumo: A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: Ariela Veloso de Paula / Banca: Fernando Masarin / Banca: Jonas Contiero / Banca: Hamilton Cabral / Resumo: O atual trabalho teve como objetivo realizar a hidrólise das proteínas do soro do queijo bovino (SQB) utilizando a alcalase® imobilizada em pó de sabugo de milho, para obtenção, purificação parcial e avaliação das propriedades biológicas de peptídeos bioativos. O sabugo de milho (SM) é o principal resíduo formado da indústria de processamento de milho. Alcalase® foi usada para a imobilização em SM e agarose. O desempenho dos dois derivados foi estudado em relação aos parâmetros cinéticos de imobilização. A hidrólise das proteínas do SQB em sistema descontínuo foi realizada em reator de batelada (pH 9,0; 50ºC/48h) usando a alcalase® livre (AL) e derivados alcalase®-glioxil-agarose (AGA); alcalase®-glioxil-SM (AGSM) para fins de comparação. O grau de hidrólise (GH) para AL, AGA e AGSM foi de 59,63, 43,88 e 26,59% respectivamente. O derivado estável AGSM apresentou capacidade de cinco ciclos de reuso de 24 h consecutivos mantendo atividade maior que 70% e exibiu estabilidade térmica (65ºC/pH 7,0) 62 vezes maior do que a AL, retendo 12% de sua atividade inicial após 48 horas, enquanto que a AL e AGA foram totalmente inativados. Os hidrolisados proteicos do soro (HPS) obtidos com AGSM foram fracionados por RP-HPLC em três frações (F1, F2 e F3) de acordo com a hidrofilicidade dos peptídeos (F1: hidrofílicos, F2: hidrofilicidade intermediária e F3: hidrofóbicos). As frações foram analisadas por MALDI-TOF que identificou peptídeos de massa molecular (<1500 m/z). HPS obtido por AGSM a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the present work was to hydrolyze bovine cheese whey proteins (BCW) using the alcalase® immobilized on corn cob powder (CCP), to obtain partial purification and evaluation of the biological properties of bioactive peptides. Corn cob (CC) is the main residue formed in the maize processing industry. Alcalase® was used for the immobilization on CCP and on agarose. The performance of the two derivatives enzymatic was studied in relation to the kinetic properties of immobilization. The free alcalase® (FA) and the derivatives: alcalase®-glyoxyl-agarose (AGA); alcalase®-glyoxyl-corn-cob-powder (AGCCP) were used for the hydrolysis of bovine cheese whey proteins in a batch reactor (pH 9.0, 50oC/48h). The degree of hydrolysis (DH) for FA, AGA and AGCCP was of 59.63, 43.88 and 26.59% respectively. However, AGCCP derivative was very stable and presented reuse capacity of five consecutive 24-hour cycles maintaining its activity greater than 70%. In addition, AGCCP exhibited thermal stability (65ºC, pH 7.0) 62 times greater than FA, retaining 12% of its initial activity after 48 hours, while FA and AGA were totally inactive. The whey protein hydrolysates (WPH) obtained with AGCPP were fractionated by reverse-phase HPLC according to the hydrophilicity of the peptides (F1: hydrophilic, F2: intermediate hydrophilicity and F3: hydrophobic). The fractions were analyzed by MALDI-TOF and molecular weight peptides (<1500 m/z) were identified. Total WPH obtained by AGCCP presented ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Patrícia Soares Santiago / Banca: Ederlan de Souza Ferreira / Resumo: Devido ao avanço científico e tecnológico, notável sucesso tem sido alcançado na identificação de novos compostos antitumorais. Entretanto, problemas associados à baixa estabilidade e seletividade tem limitado o sucesso da grande maioria destes compostos. Dentre as estratégias para aumentar a estabilidade de moléculas bioativas, a bioconjugação em domínios de ligação a albumina (DLA) tem se mostrado promissor para ampliar o tempo de vida médio de moléculas susceptíveis à degradação proteolítica. Neste trabalho, a estrutura e a atividade de um composto contendo um peptídeo citotóxico, um DLA e um sítio de clivagem específico foram avaliadas. Motivado pela perspectiva do peptídeo melitina apresentar atividade antitumoral, o nosso grupo de pesquisa avaliou a síntese e atividade biológica deste composto com o peptídeo RQKRSLGG-WQRPSSW. O peptídeo obtido foi testado contra tipos de celulas tumorais e não tumorais (linhagem MCF-7 e HaCaT, respectivamente), mostrando-se potente, porém tóxico. Nos estudos de dicroísmo circular, os peptídeos não apresentaram estrutura secundária em solução aquosa. Em presença de miméticos de membrana, os peptídeos adquiriram uma estrutura em α-hélice exceto o peptídeo sítio de clivagem-DLA. Estudos de vazamento de carboxifluoresceína em LUVs (POPC:POPS), através da técnica de espectroscopia de fluorescência, mostraram que o peptídeo completo tem capacidade de permeabilização similar ao da melitina e que é dependente da concentração. Os resultados de f... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Due to the scientific and technological advanced permitted remarkable successful in the field of identification of new antitumour compounds. However, problems associated with low stability and selectivity have been a restriction in the successf ul of majority of this compounds. Inside the strategic for increase the stability of bioactive molecules, bioconjugation with albumin - binding domain (ABD) have been promising for increasing t he lifetime of molecules susceptible for the proteolytic degradat ion. Herein, structure and activity of a compound containing a cytotoxic peptide, ABD, and cleavage site were evaluated. The ABD (WQRPSSW) can give more stability for molecules, while the cle avage site RQKRSLGG can give more selectivity to the peptide. Thi s sequence is degraded for the protease Kallikrein 4 (KLK4), which occurs in elevated quantity in the tumours cells, releasing the cytotoxic compound, especially in the microenvironments of t hese cells, promoting the higher selectivity. Inspired for the pe rspective of Melittin peptide holds a promising antitumour activity, our research group evaluated the synthesis and biological activity with this peptide containing the sequence RQKRSLGG - WQRP SSW. The peptide was evaluated against diversity of tumours and n o tumours cells (MCF - 7 and HaCaT respectively), presenting effective activity but toxic. In circular dichroism studies the peptides did not show second structure in aqueous solution. In the p resence of membrane mimet... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Lúcia Barretto Penna / Banca: Ariene G. F. Van Dender / Banca: Elisa Helena Giglio Ponsano / Resumo: O queijo Prato é fabricado por coagulação enzimática, adicionado de corante e complementado ou não pela ação de bactérias láticas específicas, podendo ser classificado como gordo e de média umidade. Atualmente, a procura por produtos lácteos com baixo teor de gordura vem aumentando, pois o consumo de gordura de origem animal apresenta relação com doenças coronárias e carcinogênicas. Além disso, para indivíduos que buscam a manutenção ou perda de peso corporal, o consumo de gordura deve ser restrito. Por outro lado, queijos com teor reduzido de gordura apresentam defeitos nas características sensoriais, no rendimento e na maturação, quando comparados aos queijos com teor integral. Para minimizar as alterações decorrentes da retirada da gordura, é necessário utilizar uma tecnologia que não altere a qualidade do produto final. Neste contexto, no presente trabalho estudou-se o uso da enzima proteolítica, fastuosaína, extraída do fruto verde do gravatá (Bromelia fastuosa) na maturação do queijo Prato com teor reduzido de gordura. Foram realizados 4 processamentos: um pelo método tradicional - sem adição de enzima fastuosaína (Processamento A, controle) e três pelo método modificado, nos quais se utilizaram diferentes concentrações de fastuosaína com diferentes atividades enzimáticas. O leite utilizado na fabricação dos queijos foi submetido a análises de densidade, gordura, extrato seco total, acidez, presença de antibiótico, Salmonella, contagem padrão em placas, coliformes totais e fecais, e os queijos foram submetidos a análises microbiológicas de bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras, Escherichia coli, coliformes totais e fecais, Estafilococos coagulase positiva, Salmonella e Listeria monocytogenes. Durante a maturação os queijos foram submetidos a análises de:...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Prato cheese is manufactured by enzymatic coagulation, with addition of colorings and complemented or not by the action of specific lactic bacteria, and it can be classified as semihard and fatty cheese. Currently, the demand for dairy products with low-fat content is increasing, therefore the consumption of animal fat is related to coronary and carcinogenic diseases. Moreover, for individuals that search for the maintenance or the loss of body weight, the intake of fat must be restricted. On the other hand, cheeses with reduced fat content present defects in sensory characteristics, both in the yield of low-fat cheese and in its ripening, when compared with full-fat product. To minimize the alterations due to the removal of fat, it is necessary to use a technology that does not modify the final quality of the product. In this context, in this work the addition of the proteolytic enzyme, fastuosain, extracted of the green fruit of gravatá (Bromelia fastuosa) on the ripening of the low fat Prato cheese was studied. Four batches of cheese were carried out. One of them was not modified - without addition of fastuosain enzyme (Process A, control) and three batches were added with different concentrations of fastuosain with different enzymatic activities. The milk used in the manufacture of the cheeses was submitted to the analyses of density, fat, total dry matter, acidity, presence of antibiotic, total and fecal coliforms, Salmonella, counting standard in plates and the cheeses were submitted to microbiological analyses of aerobic mesophilic bacteria, total and fecal coliforms, yeasts and molds, Escherichia coli, coagulase positive staphylococci, Salmonella and Listeria monocytogenes. During the ripening the cheeses were submitted to the analyses of: total dry matter, acidity, fat, fat in the dry matter, ashes, nitrogen and total protein, soluble nitrogen (NS)...(Complete abstract click eletronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-23Bitstream added on 2014-06-13T18:49:55Z : No. of bitstreams: 1 zanphorlin_lm_me_sjrp.pdf: 945446 bytes, checksum: 9959e6f0472c3ac5cdce9a3374c74387 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fungos termofílicos têm despertado grande interesse acadêmico e industrial por produzirem uma variedade de enzimas termoestáveis com potenciais aplicações em processos biotecnológicos como biocatálise nas indústrias de couro, farmacêutica, têxtil e alimentícia, e na preparação de produtos de limpeza e cosméticos. Particularmente, as proteases, além de participarem de inúmeros processos fisiológicos vitais como vias metabólicas, hemostasia e sinalização celular, também representam hoje cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste trabalho, descrevemos a produção, purificação e caracterização bioquímica de uma serino-protease produzida por um fungo termofílico do gênero Myceliophthora. As taxas de atividade proteolítica foram avaliadas através de fermentação em meio sólido (FES) e submerso (FSM) e observou-se um rendimento na atividade proteolítica 4,5 vezes maior para o meio sólido. A enzima bruta obtida por ambos os procedimentos (FES e FSM) exibiu a mesma temperatura ótima de 50 ºC, porém em relação ao pH ótimo houve um deslocamento de 7 (FSM) para 9 (FES) sugerindo que o perfil enzimático do fungo difere de acordo com suas condições de fermentação. Baseado nesses resultados prosseguiu-se os estudos com o extrato bruto obtido por FES. A imobilização da enzima bruta em esferas de alginato de cálcio resultou no aumento da temperatura ótima e na estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. O extrato bruto obtido por FES foi, então, fracionado por métodos cromatográficos como exclusão molecular e troca-iônica que resultaram na protease pura com peso molecular de 28,2 kDa determinado por espectrometria de massa. A protease pura demonstrou pH ótimo de 9,0 e temperatura ótima de 45 °C que corroboram... / Thermophilic fungi have attracted great academic and industrial interest because they produce a variety of thermostable enzymes with potential applications in biotechnological processes such as biocatalysis in the industries of leather, pharmaceutical, textile and food, and the preparation of detergents and cosmetics. In particular, proteases not only participate in many vital physiological processes such as metabolic pathways, cell signaling and homeostasis, but also currently represent about 60% of the world market of enzymes. In this work, we describe the production, purification and biochemical characterization of a serine protease produced by a thermophilic fungus of the genus Myceliophthora. The levels of proteolytic activity were evaluated either by solid fermentation (SSF) and submerged (SmF). The crude enzyme obtained by both procedures (SSF and SmF) exhibited similar optimum temperature of around 50 ºC, but in relation to the optimum pH was shifted of 7 (SmF) to 9 (SSF), suggesting that the enzymatic profile of the fungus differs from according to its fermentation conditions. Based on these results, the studies were followed with crude extract obtained by SSF. The immobilized enzyme on beads of calcium alginate resulted in increased optimum temperature and thermal stability when compared to the free enzyme. The crude extract obtained by SSF was then fractionated by chromatographic methods including molecular exclusion and ion-exchange that resulted in the pure protease with molecular weight of 28.2 kDa as determined by mass spectrometry. The pure protease showed optimum pH of 9.0 and optimum temperature of 45 °C that corroborate to the preliminary characterization of the crude extract. Inhibition tests resulted in complete inhibition by PMSF, a canonical... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Alysson Wagner Fernandes Duarte / Resumo: Ambientes extremos são fontes potenciais para a descoberta de novos produtos naturais com propriedades específicas para aplicação biotecnológica, devido ao pouco conhecimento sobre a diversidade e os recursos genéticos dos micro-organismos que habitam esses locais. Micro-organismos do ambiente Antártico têm demonstrado potencial para produção de enzimas ativas em temperaturas brandas com aplicação em diversos setores de importância econômica. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a produção de L-asparaginase e proteases produzidas por fungos filamentosos (n=161) e leveduras (n=137), isolados de oito diferentes amostras de solos da Antártica (coletados na expedição Antártica de nov/dez de 2013 no âmbito do INCT Criosfera). Os fungos filamentosos e as leveduras encontram-se preservados na coleção de pesquisa vinculada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Um total de 101 (62,7%) fungos filamentosos apresentou potencial para produção da enzima L-asparaginase em meio sólido (triagem qualitativa), porém nos testes quantitativos em meio líquido a enzima não foi produzida nas condições utilizadas. Com relação às proteases, 121 (75,1%) fungos apresentaram halo de degradação em meio sólido e 30 (18.6%) isolados apresentaram resultados de atividade de proteases acima de 45,0 U/mL. Dentre eles, 13 (8,7%) foram capazes de produzir proteases acima 100,0 U/mL: sete isolados apresentaram atividade de proteases alcalina e seis de proteases ácidas. Os isolados 5BI ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Extreme environments are potential sources for the discovery of new natural products with specific properties for biotechnological applications due to little knowledge about the diversity and genetic resources of microorganisms that inhabit these places. Microorganisms from the Antarctic environment have shown potential for producing active enzymes in mild temperatures with application in various sectors of economic importance. In this context, the present study evaluated the production of proteases and L-asparaginase by filamentous fungi (n= 161) and yeasts (n= 137) isolated from seven different samples of the Antarctic soils (collected in the Antarctic expedition Nov/Dec 2013 - INCT Cryosphere Project). The isolates are being maintained in the research collection linked to the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). A total of 101 (62.7%) filamentous fungi showed potential for production of L-asparaginase on solid medium (qualitative screening), but in the quantitative screening in liquid medium the enzyme was not produced. Concerning proteases production, 121 (75.1%) filamentous fungi presented halo of degradation on solid medium and 30 (18.6%) isolates showed protease activity above 45.0 U/mL Among them, thirteen (8.7%) isolates were able to produce protease above 100.0 U/mL: seven isolates produced alkaline proteases and six acid proteases. The isolates 5BI (Aspergillus sp.) and 6 MP (Thelebolus sp.) showed the best results in the production of acid and alkaline ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-11-10T11:58:01Z : No. of bitstreams: 1 000786749_20150920.pdf: 227688 bytes, checksum: c800c0192a1f81b1c24ac20d93cf4f4c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-09-21T13:18:45Z: 000786749_20150920.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-21T13:19:48Z : No. of bitstreams: 1 000786749.pdf: 1032630 bytes, checksum: 9ff7c0ae2515a60572247ae468fd531f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Peptidases são enzimas responsáveis por realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam grande importância, pois são utilizadas em vários segmentos industriais, desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Uma das principais aplicações das peptidases é nos laticínios, na produção de queijo, que inicialmente envolve a coagulação das caseínas do leite pela ação de enzimas proteolíticas coagulantes, sendo a renina a principal delas. Enzimas microbianas coagulantes de leite são peptidases aspárticas que catalisam a coagulação do leite, substituindo o coalho de vitelo. Em trabalhos anteriores foi isolado o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31 que produziu em fermentação em estado sólido (FES), uma peptidase com capacidade de hidrolisar a κ-caseína do leite e produzir coágulo de boa qualidade. Entretanto, sua caracterização funcional e especificidade de ação ainda não estão claras. Assim, neste estudo, deu-se continuidade à investigação de estrutura e ação desta enzima coagulante. Foi realizado o monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência, foi feita análise da especificidade primária da peptidase utilizando substrato de fluorescência da série Abz-LSFMAIQ-EDDnp e foi determinada a sequência primária da proteína por espectrometria de massas. O monitoramento da hidrólise enzimática da caseína por cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que o perfil do extrato bruto de Thermomucor indicae-seudaticae N31 apresenta alta similaridade com as enzimas comerciais das marcas Bela-Vista e Chr-Hansen obtidas dos fungos Rhizomucor miehei e Aspergillus niger, respectivamente. A análise de especificidade primária da peptidase demonstrou alta especificidade e afinidade pelo substrato sintético. A determinação do ... / Peptidase enzymes are responsible for catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins. These enzymes present great importance, therefore, are used in several industrial segments, since the food industry even in the processing of leather and formulations of medicinal products. One major application of peptidases is in the dairy industry for cheese production, which initially involves clotting of milk caseins by the action of coagulant proteolytic enzymes being rennin the main one. Microbial rennet-like milk-clotting enzymes are aspartic proteinases that catalyze milk coagulation, substituting calf rennet. In previous study it was isolated a thermophilic fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 that produced on Solid State Fermentation (SSF), a peptidase with capacity to hydrolyses the k-casein of milk and produce good quality curd. However its functional characterization and specificity of action is not clear yet. Thus, in this study we continued the investigation of structure and action of this enzyme coagulant. Was carried out the monitoring of enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase, was analyzed the specificity of primary peptidase using substrate of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide series Abz-LSFMAIQ-EDDnp and determined the primary sequence of the protein by mass spectrometry. Monitoring the enzymatic hydrolysis of casein by high performance liquid chromatography-reverse phase showed that the crude extract Thermomucor indicae-seudaticae N31 shows high similarity with commercial enzymes brands Bela-Vista and Chr-Hansen obtained from fungi Rhizomucor miehei and Aspergillus niger, respectively. The analysis of primary peptidase specificity demonstrated high specificity and affinity for the synthetic substrate. The determination of the cleavage site showed 46% hydrolysis of the bond between the amino acids phenylalanine and methionine and 54% between alanine ...

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Luiz Juliano Neto / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: Fungos termofílicos têm despertado grande interesse acadêmico e industrial por produzirem uma variedade de enzimas termoestáveis com potenciais aplicações em processos biotecnológicos como biocatálise nas indústrias de couro, farmacêutica, têxtil e alimentícia, e na preparação de produtos de limpeza e cosméticos. Particularmente, as proteases, além de participarem de inúmeros processos fisiológicos vitais como vias metabólicas, hemostasia e sinalização celular, também representam hoje cerca de 60% do mercado mundial de enzimas. Neste trabalho, descrevemos a produção, purificação e caracterização bioquímica de uma serino-protease produzida por um fungo termofílico do gênero Myceliophthora. As taxas de atividade proteolítica foram avaliadas através de fermentação em meio sólido (FES) e submerso (FSM) e observou-se um rendimento na atividade proteolítica 4,5 vezes maior para o meio sólido. A enzima bruta obtida por ambos os procedimentos (FES e FSM) exibiu a mesma temperatura ótima de 50 ºC, porém em relação ao pH ótimo houve um deslocamento de 7 (FSM) para 9 (FES) sugerindo que o perfil enzimático do fungo difere de acordo com suas condições de fermentação. Baseado nesses resultados prosseguiu-se os estudos com o extrato bruto obtido por FES. A imobilização da enzima bruta em esferas de alginato de cálcio resultou no aumento da temperatura ótima e na estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. O extrato bruto obtido por FES foi, então, fracionado por métodos cromatográficos como exclusão molecular e troca-iônica que resultaram na protease pura com peso molecular de 28,2 kDa determinado por espectrometria de massa. A protease pura demonstrou pH ótimo de 9,0 e temperatura ótima de 45 °C que corroboram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Thermophilic fungi have attracted great academic and industrial interest because they produce a variety of thermostable enzymes with potential applications in biotechnological processes such as biocatalysis in the industries of leather, pharmaceutical, textile and food, and the preparation of detergents and cosmetics. In particular, proteases not only participate in many vital physiological processes such as metabolic pathways, cell signaling and homeostasis, but also currently represent about 60% of the world market of enzymes. In this work, we describe the production, purification and biochemical characterization of a serine protease produced by a thermophilic fungus of the genus Myceliophthora. The levels of proteolytic activity were evaluated either by solid fermentation (SSF) and submerged (SmF). The crude enzyme obtained by both procedures (SSF and SmF) exhibited similar optimum temperature of around 50 ºC, but in relation to the optimum pH was shifted of 7 (SmF) to 9 (SSF), suggesting that the enzymatic profile of the fungus differs from according to its fermentation conditions. Based on these results, the studies were followed with crude extract obtained by SSF. The immobilized enzyme on beads of calcium alginate resulted in increased optimum temperature and thermal stability when compared to the free enzyme. The crude extract obtained by SSF was then fractionated by chromatographic methods including molecular exclusion and ion-exchange that resulted in the pure protease with molecular weight of 28.2 kDa as determined by mass spectrometry. The pure protease showed optimum pH of 9.0 and optimum temperature of 45 °C that corroborate to the preliminary characterization of the crude extract. Inhibition tests resulted in complete inhibition by PMSF, a canonical... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-16Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 silva_rr_me_sjrp.pdf: 961028 bytes, checksum: 0d7989443c42fd25745d208364a42a88 (MD5) / A produção de proteases de origem microbiana depende das condições de cultivo e da diversidade bioquímica de cada espécie. Estudos comparativos entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm) usando farelo de trigo e meio sintético, respectivamente, foram realizados para a determinação dos parâmetros de produção de proteases pelo fungo Aspergillus fumigatus Fresenius. A melhor produção de protease foi em FES no período de 96 horas utilizando farelo de trigo, temperatura de 30 ºC e 1x106 esporos/5g de substrato com 1.517 U/mL. Em FSm o pico de produção foi em pH 6,0, a 30ºC, 5x105 esporos/mL de meio no período de 72 e 96 horas em meio contendo 0,5 e 0,25% de caseína, respectivamente, ambos com 40 U/mL. Conforme a produtividade dos processos fermentativos, o extrato enzimático da FES foi utilizado para estudos de purificação e caracterização bioquímica. Neste estudo, a protease purificada apresentou atividade ótima em pH 7,5 e 50ºC, sendo inibida por Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) e mais intensamente por antipaína (1,6 µM). Sobre efeito de íons, foi observado modulação da atividade proteolítica, principalmente com inibição por AlCl3, cuja atividade proteolítica residual foi de 18% após incubação com este íon. Na presença de Ditiotreitol (DTT) e uréia houve diminuição da atividade proteolítica, apresentando atividades residuais de 63% em 200 mM de DTT e 10% com 5 M de uréia. Comparativamente, na concentração de 0,1% de cada surfactante estudado, notou-se redução da atividade proteolítica, sendo 97% em presença de Brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), 79% para 4 - (1,1,3,3 - Tetrametilbutil) fenil- polietileno glicol (Triton X-100), 55% com Polyoxyethylenesorbitan monolaurato (Tween-20) e completa redução da atividade (0%) em... / The microbial protease production depends on growing conditions and the biochemical diversity of each species. Comparative studies between solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) using wheat bran and synthetic medium, respectively, were performed to determine the optimum parameters for protease production by the fungus Aspergillus fumigatus Fresenius. The best protease production was in SSF within 96 hours using wheat bran, temperature 30°C and 1x106 spores/5g of substrate, with 1,517 U/mL. In SmF peak production was at pH 6.0 at 30°C, 5x105 spores/mL of media within 72 and 96 hours in medium containing 0.5 and 0.25% casein, respectively, with 40 U/mL. According to the productivity of the fermentative processes, enzymatic extract was used from SSF to study purification and biochemical characterization. In this study, purified protease showed optimum activity at pH 7.5 and 50°C, and inhibited by Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and more intensely for antipain (1,6 µM). Concerning to the effect of ions, we observed modulation of the proteolytic activity, especially with inhibition by AlCl3, which residual activity was of 18 % after incubation with this ion. In the presence of Dithiothreitol (DTT) and ureia, we observed progressive decrease in proteolytic activity, presenting residual activities of 63% with 200 mM DTT, and 10% with 5 M ureia. Comparatively, in the concentration of 0.1% of each surfactant studied, there was a reduction in the proteolytic activity in 97% in presence of Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB), 79% with 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (Triton X-100), 55% with Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween-20) and a complete inactivation in the presence of Sodium dodecyl sulfate... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:50:11Z : No. of bitstreams: 1 garcia_gac_me_sjrp.pdf: 1471575 bytes, checksum: 697e072c570bcfd7b45d96719c8b22e5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O queijo Prato é fabricado por coagulação enzimática, adicionado de corante e complementado ou não pela ação de bactérias láticas específicas, podendo ser classificado como gordo e de média umidade. Atualmente, a procura por produtos lácteos com baixo teor de gordura vem aumentando, pois o consumo de gordura de origem animal apresenta relação com doenças coronárias e carcinogênicas. Além disso, para indivíduos que buscam a manutenção ou perda de peso corporal, o consumo de gordura deve ser restrito. Por outro lado, queijos com teor reduzido de gordura apresentam defeitos nas características sensoriais, no rendimento e na maturação, quando comparados aos queijos com teor integral. Para minimizar as alterações decorrentes da retirada da gordura, é necessário utilizar uma tecnologia que não altere a qualidade do produto final. Neste contexto, no presente trabalho estudou-se o uso da enzima proteolítica, fastuosaína, extraída do fruto verde do gravatá (Bromelia fastuosa) na maturação do queijo Prato com teor reduzido de gordura. Foram realizados 4 processamentos: um pelo método tradicional - sem adição de enzima fastuosaína (Processamento A, controle) e três pelo método modificado, nos quais se utilizaram diferentes concentrações de fastuosaína com diferentes atividades enzimáticas. O leite utilizado na fabricação dos queijos foi submetido a análises de densidade, gordura, extrato seco total, acidez, presença de antibiótico, Salmonella, contagem padrão em placas, coliformes totais e fecais, e os queijos foram submetidos a análises microbiológicas de bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras, Escherichia coli, coliformes totais e fecais, Estafilococos coagulase positiva, Salmonella e Listeria monocytogenes. Durante a maturação os queijos foram submetidos a análises de:... / Prato cheese is manufactured by enzymatic coagulation, with addition of colorings and complemented or not by the action of specific lactic bacteria, and it can be classified as semihard and fatty cheese. Currently, the demand for dairy products with low-fat content is increasing, therefore the consumption of animal fat is related to coronary and carcinogenic diseases. Moreover, for individuals that search for the maintenance or the loss of body weight, the intake of fat must be restricted. On the other hand, cheeses with reduced fat content present defects in sensory characteristics, both in the yield of low-fat cheese and in its ripening, when compared with full-fat product. To minimize the alterations due to the removal of fat, it is necessary to use a technology that does not modify the final quality of the product. In this context, in this work the addition of the proteolytic enzyme, fastuosain, extracted of the green fruit of gravatá (Bromelia fastuosa) on the ripening of the low fat Prato cheese was studied. Four batches of cheese were carried out. One of them was not modified - without addition of fastuosain enzyme (Process A, control) and three batches were added with different concentrations of fastuosain with different enzymatic activities. The milk used in the manufacture of the cheeses was submitted to the analyses of density, fat, total dry matter, acidity, presence of antibiotic, total and fecal coliforms, Salmonella, counting standard in plates and the cheeses were submitted to microbiological analyses of aerobic mesophilic bacteria, total and fecal coliforms, yeasts and molds, Escherichia coli, coagulase positive staphylococci, Salmonella and Listeria monocytogenes. During the ripening the cheeses were submitted to the analyses of: total dry matter, acidity, fat, fat in the dry matter, ashes, nitrogen and total protein, soluble nitrogen (NS)...(Complete abstract click eletronic access below)