A presença de plasmídeos conjugativos como IncP, IncU e IncFII carreando genes de resistência em Pseudomonas aeruginosa é de grande importância, pois podem ser trocados entre diferentes bactérias gram-negativas, disseminando a resistência aos antibióticos. Conhecer estes genes de resistência bem como os elementos genéticos que os carreiam é importante para entender os fatores que contribuem para a disseminação da resistência, auxiliando no controle da disseminação da resistência aos antibióticos. Ainda hoje não existe esquema para a tipagem de plasmídeos de P. aeruginosa, e são encontrados poucos trabalhos sobre estes plasmídeos. O objetivo deste estudo foi identificar os genes de resistência a antibióticos, o ambiente genético em que estes genes estão inseridos e a clonalidade dos isolados produtores de genes bla. No período do estudo, foram estudados 293 isolados de P. aeruginosa resistentes às cefalosporinas de 3ª e/ou 4ª gerações e/ou aos carbapenêmicos isoladas de pacientes de hospitais de Ribeirão Preto-SP, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, de Barretos-SP e de Rio Branco-AC. Genes de resistência foram pesquisados por PCR. O perfil clonal dos isolados produtores de genes bla foi determinado por PFGE e MLST. A tipagem de plasmídeos foi feita por PFGE-S1 nuclease, hibridações com sondas específicas e tipagem de replicons (PBRT). Foram identificados 12 isolados carreando o gene blaSPM-1, 16 isolados carreando o gene blaCTX-M-2 e 3 isolados carreando o gene blaKPC-2. Em todos os 12 isolados produtores de SPM-1 foram identificadas duas cópias do elemento de inserção ISCR4, sendo uma cópia upstream e uma cópia downstream ao gene blaSPM-1 inseridos no cromossomo bacteriano. Em 13 dos 16 isolados produtores de CTX-M-2 o gene blaCTX-M-2 foi encontrado associado ao elemento de inserção ISCR1 e em 3 ao elemento de inserção ISEcp1 também inseridos no cromossomo bacteriano. Em 2 isolados o gene blaKPC-2 é carreado por um plasmídeo de ~3kb não tipável por PBRT e um em está inserido no cromossomo bacteriano. O ambiente genético do gene blaKPC-2 nos isolados estudados é diferente daqueles encontrados na literatura. Os isolados produtores de genes bla citados apresentaram diversidade clonal, tanto por PFGE quanto MLST demonstrando que vários clones estão envolvidos na disseminação desses genes. Este trabalho identificou e caracterizou 31 isolados produtores de ?-lactamases, o ambiente genético destes genes e a clonalidade de isolados de várias cidades do Brasil e em períodos diferenciados, demonstrando a disseminação desses genes em diferentes hospitais brasileiros. Esses dados auxiliam no conhecimento dos fatores que estão envolvidos na disseminação da resistência aos antibióticos e podem auxiliar as CCIHs dos hospitais a definirem estratégias para controlar a disseminação desses microrganismos prevenindo surtos de bactérias multirresistentes. / The presence of conjugative plasmids as IncP, IncU and Inc FII carrying resistance genes in Pseudomonas aeruginosa is very important because t these plasmids can be shared among different bacteria, spreading antibiotic resistance. Knowledge of these genes as well as genetic elements carrying these genes it is important to understend the factors that contribute to the spread of resistance, helping to control the spread of antibiotic resistance. Today there is no plasmid typing scheme to P. aeruginosa and few papers are found about this subject. The purpose of this study was to investigate resistance genes, genetic environment of these genes and clonal relationship of the isolates carrying these resistance genes. In the period of this study was studied 293 P. aeruginosa resistant to third and fourth generations of cephalosporins and/or carbapenens isolated of patients from hosptital from Ribeirão Preto, Belo Horizonte-MG, Franca-SP, Cuiabá-MT, Barretos-SP and Rio Branco-AC. Resistance genes were investigated by PCR. Twelve isolates were identified carrying blaSPM-1 gene, 16 isolates carrying blaCTX-M-2 gene and 3 isolates carrying blaKPC-2 gene. Clonal profiles of isolates producing resistance genes were investigated by PFGE and MLST. Plasmid typing was performed by PFGE-S1 nuclease, specific hybridizations and PCR replicon typing (PBRT). Two isolates presented a 3kb plasmid non-typeable by PBRT carrying blaKPC-2 gene. In all isolates SPM-1-producers were identified two copies of insertion sequence ISCR4, a copy upstream and a copy downstream to blaSPM-1 gene inserted in chromosomal DNA. In 13 of 16 isolates CTX-M-2-producers the blaCTX-M-2 gene was found associated to insertion sequence ISCR1 and in 3 isolates was associated to insertion sequence ISEcp1 also inserted in chromosomal DNA. Genetic environment of blaKPC-2 gene in the isolates studied it is different from those found in the literature. Isolates producing bla genes are clonally diversified using both PFGE and MLST showing that various clones are responsible to spread these resistance genes. This work identified and characterized 31 P. aeruginosa-?-lactamase-producing, the genetic environment of these genes and the clonal relationship of isolates collected from different periods from different cities of Brazil. These data can help us to understand the factors that are involved in the spread of antibiotics resistance and to help the Hospital Infection Control Committee to define strategies to control the spread of these microorganisms preventing outbreaks of resistant.

O objetivo deste trabalho foi a seleção de bactérias capazes de biodegradar os pesticidas organoclorados dieldrin, DDD e PCP. Inicialmente, foram realizados os ensaios de tolerância visando à seleção das bactérias degradadoras; posteriormente foram realizados os ensaios de biodegradação em meio liquido utilizando a bactéria selecionada. Dentre as 14 linhagens bacterianas isoladas testadas, selecionou-se a linhagem Pseudomonas aeruginosa L2-1 por apresentar maior tolerância a todos os pesticidas. Os ensaios de biodegradação foram realizados em diferentes meios de cultura, variando-se a concentração de glicose, a fonte de nitrogênio e a presença de ramnolipídeo. Os ensaios de biodegradação foram realizados determinando-se a concentração de pesticida, a concentração de glicose, o número de células viáveis, e o pH. O meio de cultura que mais favoreceu a biodegradação dos três pesticidas foi o meio com nitrato de sódio e 0,5% de glicose, obtendo-se biodegradação de aproximadamente 50% para cada pesticida após três dias de incubação. Na ausência de glicose, o meio com nitrato de amônio e 0,1% de ramnolipídeo, favoreceu a biodegradação, obtendo-se após 14 dias de incubação 36,8% de biodegradação de dieldrin; 33,7% de DDD e 42,8% de PCP. De uma forma geral, as taxas de biodegradação pela P. aeruginosa L2-1 foram maiores em menores concentrações de glicose e na presença de ramnolipídeo. Ao alterar a fonte de nitrogênio foram observados resultados diversos sobre a taxa de biodegradação: na ausência de glicose, o nitrato de sódio favoreceu a biodegradação de PCP, enquanto o nitrato de amônio favoreceu a biodegradação de dieldrin, na presença de glicose observou-se o inverso. A taxa de biodegradação do DDD não foi significativamente alterada ao variar a fonte de nitrogênio. A bactéria selecionada P. aeruginosa L2-1 apresentou potencial para biodegradação de pesticidas organoclorados, sendo que as condições nutricionais do meio influenciaram diretamente a biodegradação. / The objective of this work was the selection of bacteria capable of biodegrading the organochloride pesticides dieldrin, DDD and PCP. Initially tolerance tests were conducted in order to select degrading bacteria subsequently, biodegradation tests were carried out in liquid medium using the selected bacteria. Among the 14 bacterial isolated strains, Pseudomonas aeruginosa L2-1 was selected due to its greater tolerance to all pesticides. The biodegradation tests were conducted on different culture media, varying the concentrations of glucose, nitrogen source and presence of rhamnolipid. Biodegradation studies were performed by measuring the concentration of pesticide, the concentration of glucose, the number of viable cell and pH during time. The best medium for the biodegradation of all three pesticides was composed of sodium nitrate and 0.5% glucose, giving approximately 50% yield after three days of incubation. In the absence of glucose, the medium containing ammonium nitrate and 0.1% rhamnolipid improved biodegradation yielding, after 14 days of incubation, 36.8% biodegradation of dieldrin; 33.7% DDD and 42.8% of PCP. In general, the biodegradation rates of pesticides by P. aeruginosa L2-1 were greater at lower concentrations of glucose and in the presence of rhamnolipid. Nitrogen source had different effects on the rate of biodegradation: in the absence of glucose, sodium nitrate favored the biodegradation of PCP, whereas ammonium nitrate favored the biodegradation of dieldrin; and in the presence of glucose, it was observed the opposite. The biodegradation rate of the DDD was not significantly altered by the nitrogen source tested. The selected bacteria, P. aeruginosa L2-1, showed potential for the biodegradation of organochloride pesticides demonstrating that nutritional conditions has a direct effect on degradation yields.

Orientador: Carlos Emilio Levy / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:09:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauch_RenanMarrichi_M.pdf: 2012702 bytes, checksum: 947bbc196f2331b0a48b9596a06effdc (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Fibrose Cística (FC) é uma doença genética decorrente da disfunção da proteína reguladora da condutância transmembrana (CFTR), essencial para o transporte de íons e água pela membrana celular, sendo a doença pulmonar a mais preponderante das manifestações, havendo colonização bacteriana seguida de infecções, principalmente por Pseudomonas aeruginosa, bactéria de maior relevância para pacientes com FC. Neste estudo, buscamos padronizar e avaliar o valor diagnóstico e prognóstico de um teste de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) para pesquisa de anticorpos séricos IgG anti-P. aeruginosa, comparando os resultados com a cultura microbiológica de material respiratório (padrão-ouro atual). Os níveis de anticorpos foram avaliados primeiramente em um estudo transversal, com 117 pacientes com FC atentidos no HC-Unicamp, buscando determinar a acurácia do teste, e paralelamente em um estudo longitudinal, com 78 pacientes inicialmente sem infecção crônica por P. aeruginosa, buscando monitorar a variação dos níveis de anticorpos em diferentes períodos de coleta de amostras. Observamos que a taxa de soropositividade e a mediana dos níveis de IgG anti-Pseudomonas foram significativamente maiores em pacientes cronicamente infectados pela bactéria, tendo o teste sensibilidade de 96,8%, especificidade de 98,1%, valor preditivo positivo de 96,8% e valor preditivo negativo de 98,1% para a detecção da infecção crônica. Houve aumento progressivo dos níveis de anticorpos dos pacientes ao longo do tempo, com maior significância em dois períodos de coleta, entre pacientes que apresentaram evolução no perfil de colonização/infecção por P. aeruginosa. Foi possível, pela pesquisa de anticorpos, a detecção da bactéria até 15 meses antes do primeiro isolamento positivo em cultura e pacientes com níveis de anticorpos elevados no início do estudo apresentaram maior risco de posterior evolução no perfil de colonização/infecção por P. aeruginosa. Concluímos que a sorologia pode ser um recurso diagnóstico de grande utilidade para a detecção precoce da infecção pulmonar P. aeruginosa em pacientes com FC, complementando resultados da cultura microbiológica. Introduzindo-a na rotina de acompanhamento dos pacientes, será possível a terapia antimicrobiana precoce, o que poderá ajudar a melhorar a função pulmonar dos pacientes e sua qualidade de vida / Abstract: Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disease, resulting from disfunction of the CFTR protein, which is essential for the transportation of ions and water across the cell membrane, being the pulmonary disease the most prominent manifestation, where there is bacterial colonization followed by infections, mainly caused by Pseudomonas aeruginosa, the most relevant bacterium for CF patients. The aim of this study was to standardize and to evaluate the diagnostic and prognostic values of an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) test for detection of serum anti-P. aeruginosa IgG antibodies, comparing the results with the microbiological respiratory culture (current gold standard). The antibody levels were first evaluated in a cross sectional study, with 117 CF patients attended at the HC-Unicamp, seeking to evaluate the accuracy of the test, and in a parallel longitudinal study, with 78 patients initially without P. aeruginosa chronic infection, seeking to monitor the variation in the antibody levels in different periods of sample collection. We observed that the seropositivity rate and the median of the anti-Pseudomonas IgG antibody levels were significantly higher in chronically infected patients, with the serological test presenting a sensitivity of 96.8%, specificity of 98.1%, positive predictive value of 96.8% and negative predictive value of 98.1% for detection of chronic infection. There was a progressive increase of the antibody levels in the patients over time, with greater significance, in two collection periods, among patients who presented evolution in the P. aeruginosa colonization/infection status. Through antibody measurement, we could detect the bacterium until 15 months before the first positive isolation in microbiological culture and the patients with elevated antibody levels in the baseline showed higher risk for later evolution in the P. aeruginosa colonization/infection status. We conclude that serology can be a very useful diagnostic resource for early detection of P. aeruginosa pulmonary infection, complementing microbiological results. By introducing it on the follow-up routine, the early antimicrobial therapy will be possible, which will help to improve the patients¿ lung function and quality of life / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências

Orientador: Selma Giorgio, Luciana Maria de Hollanda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. / Made available in DSpace on 2018-08-18T19:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_FlaviaLuna_M.pdf: 5109370 bytes, checksum: b5d1a1158570ae39829ed8ec9ff682e5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Pseudomonas aeruginosa é um dos principais patógenos oportunistas responsáveis pelas infecções nosocomiais. Essas infecções representam um grave problema de saúde para pessoas com feridas graves e queimaduras, sendo responsável por altas taxas de mortalidade nos pacientes. Os tecidos cronicamente lesados apresentam microáreas de hipóxia, pouco vascularizadas, que são extremamente difíceis de serem tratadas, diminuem e alteram os efeitos dos medicamentos propiciando que linhagens multiresistentes desse patógeno infectem e sobrevivam. Assim, torna-se imprescindível o desenvolvimento de tratamentos que sejam eficazes tanto no combate do patógeno, como na regeneração do tecido destruído. A terapia com oxigenação hiperbárica (HBO) promove a regeneração tecidual pela formação de novos vasos, apresenta propriedades bacteriostáticas e bactericidas e pode atuar de forma sinérgica com antibióticos. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar o papel da HBO no crescimento de P. aeruginosa, na ação de imipenem e em macrófagos e peles artificiais infectadas com esse patógeno. Nossos resultados mostraram que a exposição de seis cepas de P. aeruginosa a HBO (100% de O2 a 3 ATA pressão) diminui o crescimento bacteriano, além de potencializar o efeito de imipenem/cilastatina no combate a esta bactéria. A exposição a HBO durante 90 minutos protegeu macrófagos peritoneais da lise causada pela infecção bacteriana. Quando peles artificiais infectadas com P. aeruginosa foram expostas a HBO a carga bacteriana destes tecidos diminuiu. Os nossos resultados evidenciam a importância do tratamento hiperbárico no controle de infecções causadas por este patógeno / Abstract: Pseudomonas aeruginosa is a major opportunistic pathogens responsible for nosocomial infections. These infections represent a serious health problem for people with severe wounds and burns and are responsible for high mortality rates in these patients. The chronically injured tissues have small areas of hypoxia, these areas, low vascularization, are extremely difficult to treat, reduce and alter the effects of medicines providing that multiresistant strains of this pathogen to infect and survive in these places. Thus, it is essential to develop a treatment that is effective both in combating the pathogen, as in the regeneration of damaged tissue. Therapy with hyperbaric oxygen (HBO) promotes tissue regeneration by new vessel formation, has bacteriostatic and bactericidal properties and can act synergistically with antibiotics. The aim of this study was to evaluate the role of HBO on the growth of P. aeruginosa, in the imipenem action and infected macrophages and artificial skin infected with this pathogen. Our results show that exposure of six strains of P. aeruginosa to hyperbaric conditions (100% O2 at 3 ATA pressure) reduces bacterial growth, and maximize the effect of imipenem/ cilastatina against this bacterium. Exposure to HBO for 90 minutes protected macrophages from lysis caused by bacterial infection. Artificial skins infected with P. aeruginosa and exposed to HBO showed a decrease in bacterial load. These results support the importance of hyperbaric oxygen therapy in control infections caused by this pathogen / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui peut développer deux modes d’infection. Les infections aigües sont associées à la production et à la sécrétion de toxines qui peuvent avoir un effet cytotoxique, alors que dans le contexte d’une infection chronique la bactérie a tendance à s’établir sous la forme d’un biofilm. Un biofilm est une population de microorganismes organisée en une communauté et attachée sur une surface. Cette surface peut être biotique ou abiotique. Les biofilms bactériens ont des caractéristiques intrinsèques qui les rendent plus résistants à des conditions environnementales difficiles (pH, oxygène, UV, flux, etc…). Dans le cadre d’une infection l’établissement du biofilm résulte aussi en une population bactérienne difficile à éliminer par le système immunitaire mais également résistante aux antibiotiques. Des déterminants moléculaires majeurs qui interviennent dans la formation du biofilm sont le flagelle, les pili de type IV et les fimbriae Cup pour l’attachement, ou bien encore les exopolysaccharides qui sont avec l’ADN des composants essentiels de la matrice extracellulaire du biofilm qui englobe la population bactérienne. Chez P. aeuginosa, si l’alginate est le polysaccharide majeur, il a été montré que des souches non-mucoides forment également des biofilms et que dans ce contexte la synthèse et la sécrétion du polysaccharide majeur de la matrice sont dépendantes des gènes pel. Mon travail a consisté dans l’étude de l’organisation structurale du système Pel et le contrôle de son activité. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen, and in the course of an infection can develop two lifestyles. One of them is involved in secretion of toxins and results in acute infection, and the other one causes chronic infections and is characterized by formation of a biofilm. A biofilm is a highly organized bacterial population, organized as a complex community that is attached to a surface. Bacterial biofilm shows higher resistance to different enviromental factors including physical factors, antimicrobials or host immune response. Major components taking part in biofilm formation are flagella, type IV pili, cup fimbriae as well as exopolysaccharides. The latter provides a protective matrix for the biofilm, together with proteins and DNA. In non-mucoid strains the major exopolysaccharide of biofilm matrix is synthetised and secreted by pel gene cluster. My work concentrates on the structural organisation of Pel polysaccharide secretion machinery, regulation of its activity as well as detailed characterisation of the Pel polysaccharide itself.

It was demonstrated that induction of a major outer protein, HI, was associated with increased resistance to chelators of divalent cations such as EDTA and to the cationic antibiotics polymyxins and aminoglycosides. Outer membrane protein HI was the major cellular protein in cells grown in Mg²⁺-deficient medium (0.02 mM Mg²⁺) and in mutants selected for resistance to polymyxin. Increase in protein HI was associated with decrease in cell envelope Mg²⁺. Induction of protein HI was prevented by supplementation of Mg²⁺-deficient medium with 0.5 mM Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺ or Sr²⁺, but not by Zn²⁺, Ba²⁺, or Sn²⁺. Cells grown in Ca²⁺, Mn²⁺ or Zn²⁺ showed enhanced levels of these cations as main major cell envelope associated cation. Only cells grown in the presence of those cations which failed to prevent HI induction were resistant to chelators, polymyxin B and gentamicin. Protein HI overproducing cells also demonstrated altered streptomycin uptake. It was further demonstrated that aminoglycosides could interact with the outer membrane so as to make it more permeable to other substances. Mg²⁺ inhibited aminoglycoside-mediated permeabilization. Both aminoglycosides and polymyxin B could be shown to displace a small amount of Mg²⁺ from the cell envelope. / Science, Faculty of / Microbiology and Immunology, Department of / Graduate

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Pseudomonas aeruginosa es un importante patógeno oportunista del ser humano y tiene amplia versatilidad metabólica por lo que se puede adaptar a vivir en ambientes ubicuos, pudiendo persistir en ciertas superficies como tejidos formando comunidades especializadas llamadas biopelículas, además de elaborar otros factores de virulencia, como el pili tipo IV (T4P) vinculado no sólo a la motilidad llamada “contracción” sino también pareciera estar relacionada con las etapas tempranas en la formación de las biopelículas. La presente tesis tuvo como principal objetivo determinar la presencia de los diferentes genotipos del T4P así como los factores de virulencia asociados en cepas clínicas de diferentes fuentes, encontrando que la distribución de genotipos fue 25,9 % para el Grupo II, 19 % para el Grupo I, 24,1 % para el Grupo III, 10,3 % el Grupo IV y 20,7 % para el Grupo V, de tal manera que en nuestro medio existe distribución homogénea de los diversos genotipos. Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, Genotipos de pilA, Motilidad

Los avances en la ciencia y la tecnología desde la revolución industrial, han aumentado la capacidad del ser humano para explotar los recursos naturales causando un constante aumento de perturbaciones en los diversos ecosistemas. En este contexto, el uso de los biosurfactantes que solubilizan fracciones de hidrocarburos contaminantes, representa una prometedora alternativa de aplicación para cualquier proceso tecnológico de remediación de ambientes naturales. El objetivo del presente trabajo se basó en la evaluación de la actividad emulsificante y la capacidad de remoción de metales pesados de un biosurfactante de naturaleza ramnolipídica producido empleando glicerol como única fuente de carbono por una cepa de Pseudomonas aeruginosa PB25. Con los resultados obtenidos se logró determinar una velocidad de crecimiento específica (µ) de 0,0351 h^-1 y un tiempo generacional (tg) de 19,75 h; registrándose a su vez una concentración máxima de ramnolípidos de 2,47 g/L en la fase estacionaria de crecimiento, con valores de rendimiento de 0.13 gramos de ramnolípido por gramo de glicerol y de productividad de 0.082 g/L-h. De igual forma se logró conseguir un valor máximo de actividad emulsificante frente a crudo de petróleo de 5.257 UAE/mL e Índices de Emulsificación E24 de 53, 64, 62 y 84 % para crudo de petróleo, petróleo diesel 2, gasolina y kerosene respectivamente. Asimismo, se obtuvieron valores máximos de remoción del 98% y 99% para plomo y cadmio respectivamente presentes en soluciones acuosas a pH 11. Por lo tanto, es posible afirmar que este tipo de biosurfactante puede ser empleado en futuros procesos biotecnológicos de remediación de ambientes naturales contaminados por la presencia de metales pesados y/o crudo de petróleo y sus derivados. Palabras clave: Remediación, biosurfactantes, ramnolípidos, Pseudomonas aeruginosa, actividad emulsificante, hidrocarburos, metales pesados. / --- Since the industrial revolution, advances in science and technology have increased the human capacity to exploit natural resources causing ever-increasing disturbances in ecosystems. In this context, the use of biosurfactants represents a promising alternative application for any technological process of remediation of natural environments. The objective of this work was based on the evaluation of the emulsifying activity and the ability to remove heavy metals with a rhamnolipidic biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa strain PB25, using glycerol as sole carbon source. In this media this strain had a specific growth rate (μ) of 0,0351 h^-1 and a generational time (td) of 19,75 h. At the same time it produced maximum concentration of 2.47 g/L rhamnolipid, with yields (Y) of 0.13 g/g and productivity of 0.082 g/L-h. Similarly, the rhamnolipid is managed to achieve a maximum value of emulsifying activity compared to crude oil from 5.257 UAE/mL and E24 emulsification index of 53, 64, 62 and 84% for crude oil, diesel oil 2, gasoline and kerosene respectively. In addition, the rhamnolipid got to remove 98% of lead and 99% of cadmium in aqueous solutions at pH 11. In conclusion, this type of biosurfactant can be used in future biotechnological processes for the remediation of natural environments contaminated by the presence of heavy metals and/or crude oil and its derivatives. Keywords: Remediation, biosurfactant, rhamnolipid, Pseudomonas aeruginosa, emulsifying activity, hydrocarbons, heavy metals.