Les biopuces sont des systèmes miniaturisés qui permettent des analyses en parallèle et à haut débit. Ainsi, les puces à protéines/peptides sont très utiles dans l'étude des interactions entre diverses molécules biologiques. Nous avons réalisé des puces à protéines et peptides en se basant sur la technologie des polymères conducteurs : la méthode consiste à immobiliser les molécules sondes (protéines ou peptides) sur des supports par électrocopolymérisation à partir d'un mélange de pyrrole et de pyrrole lié à la molécule sonde. Le support consiste en un prisme recouvert d'un film d'or permettant l'analyse des interactions protéine-protéine ou antigène-anticorps par imagerie de la résonance plasmonique de surface. Cette méthode optique, compatible avec des mesures en parallèle, permet une analyse directe, en temps réel et donne accès aux paramètres cinétiques des interactions. Ces puces, de réalisation facile, présentent une très bonne spécificité et une bonne sensibilité. Elles peuvent être régénérées un grand nombre de fois et sont compatibles avec l'analyse d'échantillons biologiques complexes tels que du sérum non dilué. Ces caractéristiques permettent un champ d'application très large, en recherche fondamentale ou clinique mais aussi en diagnostic.

Les travaux présentés dans cette thèse concernent le développement d'un outil d'analyse multiparamétrique pour la quantification de biomarqueurs urinaires du cancer de la vessie.La première partie des travaux de recherche a pour objectif la sélection de marqueurs pour le diagnostic et la récidive des tumeurs urothéliales. Une première étude a permis l'évaluation de la sélectivité de marqueurs candidats dans des échantillons urinaires de patients atteints de cancer de la vessie. Cinq des vingt marqueurs initiaux ont été sélectionnés pour leur performance diagnostique, définissant le Panel 1 : VEGF, MMP9, IL8, PTGS2 et EN2. Une seconde étude a été réalisée afin d'évaluer le potentiel de marqueurs et de paramètres cliniques pour le diagnostic de la récidive des tumeurs urothéliales. Les échantillons urinaires évalués provenaient donc de patients présentant une récidive du cancer de la vessie et de patients ne présentant pas de récidive. Le Panel 2 a ainsi été défini, basé sur le modèle de régression multiple le plus performant. Il comprend les paramètres cliniques et moléculaires suivants : nombre de récidives antérieures, nombre de thérapies par BCG, stade de la tumeur au moment du diagnostic, CDH1, IL8, ErbB2, IL6, EN2 et VEGF.La seconde partie concerne le développement d'un test multiparamétrique pour la quantification des marqueurs sélectionnés. Il s'agit d'une plateforme automatisée, à haut-débit et sous un format de plaque de microtitration 96-puits. La méthode de quantification choisie est un immunoessai de type sandwich sous la forme de puce à protéines. Le développement de la plateforme a débuté avec le Panel 1 dont trois des cinq marqueurs (VEGF, MMP9 et IL8) ont été intégrés avec succès. Suite à la seconde étude de sélection de marqueurs, le développement de l'immunoessai multiparamétrique a été orienté vers le Panel 2. À l'exception du marqueur EN2, nécessitant une configuration d'immunoessai différente, tous les marqueurs du Panel 2 ont pu être intégrés à la plateforme / The work reported in this thesis focuses on the development of a multiplex analytical tool for the quantification of selected bladder cancer urinary biomarkers.The aim of the first part of this work is the selection of urinary biomarkers for the diagnosis and recurrence of urothelial tumors. A first study evaluated the selectivity of candidate markers in urine samples of bladder cancer patients. Five of the twenty initial markers were selected for their diagnostic performance. They define Panel 1: VEGF, MMP9, IL8, PTGS2 and EN2. A second study was then conducted to assess the potential of urinary markers and clinical parameters for the diagnosis of bladder cancer recurrence. Two types of urine samples were thus evaluated: samples from recurrent bladder cancer patients and samples from bladder cancer patients without recurrence. Panel 2 was then defined based on the best performing multivariate regression model. It includes the following clinical and molecular parameters: number of past recurrences, number of BCG therapies, tumor stage at diagnosis, CDH1, IL8, ErbB2, IL6, EN2 and VEGF.The second part involves the development of a multiplex test for the quantification of the selected markers. It is a high-throughput automated platform in a 96-well microtiter plate format. It was designed as a multiplex sandwich immunoassay based on a protein microarray. The platform development began with Panel 1 for which three of the five markers (VEGF, MMP9 and IL8) were successful integrated into a multiplex immunoassay. The end of the second marker selection study marked the development transition from Panel 1 to Panel 2. With the exception of EN2, requiring a different immunoassay configuration, all the Panel 2 markers were integrated into the platform

Les travaux présentés dans cette thèse s'intéressent à l'immobilisation de biomolécules pour le développement d'outils d'analyse multiparamétrique pour la caractérisation d'échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d'hybridation d'acides nucléiques et d'immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d'un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l'Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d'analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l'objet d'une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s'intéresse au développement d'un procédé d'immobilisation d'oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l'élaboration d'un système d'analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d'activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d'une technique d'immobilisation d'oligonucleotides in situ dans des plots d'hydrogel. La méthode de fabrication permet d'obtenir une matrice de plots d'hydrogel de 60 µm de diamètre et d'une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l'échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence.

Prédire la capacité de développement et d'implantation des embryons reste un enjeu majeur pour l’Assistance Médicale à la Procréation (AMP). L’AMP doit répondre au désir du couple d’avoir un enfant en limitant les risques encourus par la mère et l’enfant en cas de grossesse multiple. Tous les laboratoires d’AMP utilisent des critères morphologiques pour évaluer la compétence au développement des embryons en dépit de la faible valeur prédictive de cette analyse. L'interaction ovocyte-cumulus participe à l’acquisition par l'ovocyte de sa compétence au développement. Cette interaction met en jeu l’expression de gènes spécifiques dans les cellules de cumulus (CCs). Notre objectif était d'identifier des marqueurs non invasifs de la compétence ovocytaire au développement. Ainsi nous avons recherché au niveau des CCs des gènes et des protéines exprimés en fonction de l’aptitude de l’ovocyte fécondé à atteindre le stade de blastocyste. L'expression des gènes des CCs a été étudiée par puce à ADN et qPCR haut débit. Après avoir tenu compte de la variabilité des patientes, nous avons identifié les gènes RGS2, POLR3K et CUL4B comme biomarqueurs. L'expression des protéines des CCs a été étudiée par puce à protéines et après validation des anticorps ciblant les protéines d'intérêt, les protéines RGS2, POLR3K et MERTK ont été identifiées comme biomarqueurs de la compétence au développement de l'ovocyte. Ces résultats permettent d’envisager la création d’un modèle prédictif multicritère incluant la morphologie de l’embryon à J2, les gènes et protéines marqueurs. / The ability to predict the developmental and implantation ability of embryos remains a major goal in human assisted reproductive technology (ART).ART should allow couple to become parents while limiting the risks to the mother and the child in case of multiple pregnancy. ART laboratories use morphological criteria to evaluate the oocyte competence despite the poor predictive value of this analysis. The oocyte-cumulus interaction helps the oocyte to acquire its developmental competence partly through the expression of specific genes at the cumulus level. Therefore our aim was to identify at the level of cumulus cells (CCs) genes and proteins related to oocyte developmental competence as non-invasive marker. Gene expression of CCs was studied using microarray and high throughput qPCR according to the developmental competence of the oocyte (ability to reach the blastocyst stage after fertilization). While taking into account the patient variability we identified RGS2, POLR3K and CUL4B as biomarkers at RNA level. Then protein expression of CCs was studied using Reverse Phase Protein Array. After validation of the antibodies targeting the proteins of interests, RGS2, POLR3K and MERTK were identified as protein biomarkers of the developmental competence of the oocyte. These results lead us to consider a multi variables predictive model including the morphology of the embryo at J2, genes and protein markers.

Les travaux présentés dans cette thèse s’intéressent à l’immobilisation de biomolécules pour le développement d’outils d’analyse multiparamétrique pour la caractérisation d’échantillons biologiques et le diagnostic, sur un support de type biopuce couplé à une détection colorimétrique.Un premier axe de recherche concerne le développement de tests d’hybridation d’acides nucléiques et d’immunotests à haut-débit automatisés sur plaque de filtration. Cette méthode a permis la mise au point d’un test de génotypage automatisé pour le dépistage transfusionnel haut-débit (génotypage érythrocytaire étendu) en collaboration avec l’Établissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). Il permet d’analyser 96 échantillons en quatre heures, et de caractériser six génotypes par échantillon. Cet outil a fait l’objet d’une validation sur un panel de 293 donneurs.La seconde partie des travaux présentés s’intéresse au développement d’un procédé d’immobilisation d’oligonucléotides sur un polymère particulier (PolyshrinkTM) pour l’élaboration d’un système d’analyse miniaturisé. Plusieurs stratégies d’activation ont été envisagées et ont abouti à la mise au point d’une technique d’immobilisation d’oligonucleotides in situ dans des plots d’hydrogel. La méthode de fabrication permet d’obtenir une matrice de plots d’hydrogel de 60 µm de diamètre et d’une hauteur de 6 µm en moyenne. En outre, il a été démontré que les oligonucléotides immobilisés dans les plots pouvaient détecter de façon quantitative et sélective les cibles complémentaires présentes dans l’échantillon analysé en utilisant une détection par colorimétrie ou par chimiluminescence. / The work reported in this thesis focuses on biomolecules immobilization for the development of multiparametric analysis tools on a biochip coupled with a colorimetric detection, applied to the characterization of biological samples and to diagnosis.The first concern was the development of high-throughput automated hybridization tests and immunotests on a filtration plate. This method led to the elaboration of an automated platform for extended blood group genotyping in collaboration with the Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes (EFS-RA). It enables to analyze 96 samples in four hours and to characterize six genotypes per sample. Its analytical performances were validated on a panel of 293 blood donors.The second part of this work aimed to elaborate a new strategy for oligonucleotide immobilization on an innovative polymer (PolyshrinkTM) for the development of miniaturized analysis systems. Several approaches were evaluated and led to an in-situ immobilization of oligonucleotides in hydrogel dots technique. This method leads to 6 µm hydrogel dots with a diameter of 60 µm. Moreover it was demonstrated that such immobilized oligonucleotides were able to detect targets specifically and quantitatively using either a chemiluminescent or a colorimetric detection.