O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-09T12:55:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-09T12:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 9379467 bytes, checksum: 3d00842f5ce615ad92103a3787053deb (MD5) Previous issue date: 2018-06-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a excreção de creatinina para validação da coleta spot de urina, bem como as excreções de derivados de purinas (DP) e compostos nitrogenados (CN) e suas relações com a creatinina em novilhas Nelore suplementadas a pasto (Capítulo 1); objetivou-se também avaliar a recuperação da creatinina em função do tempo e de diferentes temperaturas de armazenamento (Capítulo 2). O experimento referente ao Capítulo 1, foi conduzido no setor de gado de corte da Universidade Federal de Viçosa/MG, utilizando-se cinco novilhas Nelore com peso corporal (PC) médio de 400 ± 15kg, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os cinco tratamentos experimentais se basearam na suplementação proteico-energética (concentrado com 22% de proteína bruta na matéria seca (MS), fornecido às12h), baseada no PC (0, 3, 6, 9 e 12 g/kg PC (PC0, PC3, PC6, PC9 e PC12, respectivamente)). Os animais receberam sal mineral ad libitum. Cada período experimental teve duração de 16 dias, sendo 12 de adaptação à dieta e quatro de coleta. A coleta total de urina e amostral de fezes, foi realizada em três dias, nos horários das 0h00-4h00, 4h00-8h00, 8h00-12h00, 12h00-16h00, 16h00-20h00 e 20h00-24h00. A coleta de spot de urina, foi realizada a cada 4 horas, assim como as coletas de líquido ruminal e sangue nos horários das 0, 4, 8, 12, 16, 20 horas. Para a coleta total de urina, utilizou-se sonda de Folley no26, acoplada a mangueira de polietileno que conduziu a urina até uma bolsa coletora de urina por sistema fechado, que foi esvaziada a cada quatro horas. A amostragem da urina coletada foi realizada a cada 4 horas, nos mesmos horários descritos para a coleta de sangue, medindo- se o volume e retirando-se duas amostras, uma diluída com solução H2SO4 0,036N e outra não diluída. Para determinação da excreção fecal, utilizou-se o dióxido de titânio, fornecido na quantidade total diária de 15g, entre os dias 8o e 16o de cada período. Para estimativa do consumo de pasto, utilizou-se a fibra indigestível em detergente neutro (FDNi) como indicador interno. Realizou-se coleta de pasto pela técnica do quadrado para determinação da MS potencialmente digestível (MSpd) no terceiro dia de cada período experimental. Nos dias 13o e 16o de cada período, realizou-se simulação de pastejo para estimar a composição do pasto ingerido. Nas amostras de urina foram determinadas as concentrações de creatinina, nitrogênio total urinário (NU), ureia (NUreia), ácido úrico (AU) e alantoína (AL). Para análise estatística utilizou-se o programa estatístico Proc Mixed do SAS 9.4. A avaliação da adequação da melhor forma de coleta de urina foi realizada utilizando a raiz quadrada do quadrado médio do erro da predição (QMEP) entre as amostras de urina obtidas por meio da coleta spot. O experimento, referente ao Capítulo 2, foi realizado no Departamento de Zootecnia da UFV. Foram utilizadas urina de vinte e cinco animais, dez provenientes da raça Nelore e quinze da raça Holandesa. As urinas (10 de Nelore e 10 de Holandês) foram diluídas em solução de H2SO4 0,036N, fracionadas e conservadas em temperatura ambiente, resfriadas (4oC) e congeladas (-20oC e a -40oC), analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 dias). Imediatamente após a coleta, a urina foi diluída e seu pH corrigido para valor inferior a 3, e a urina foi analisada, dando origem ao valor de creatinina, resultado utilizado como valor de referência da concentração de creatinina na amostra. Este valor referência, foi utilizado como divisor dos valores de creatinina obtidos nos dias da análise, por amostra, obtendo-se o valor de creatinina relativa, o que permite a observação do aumento ou diminuição da concentração de creatinina ao longo do tempo. Para avaliar a conversão de creatina em creatinina na urina de bovinos, utilizou-se urina proveniente de cinco bovinos da raça Holandesa. Estas urinas também foram diluídas e tiveram seu pH corrigido para valor inferior a 3. Para avaliar o efeito da adição de creatina na urina, adicionou-se solução de creatina (concentrações de 20, 40 e 60 mg/dL) nos eppendorf contendo urina diluída. Estas urinas foram analisadas em diferentes dias após a coleta (1, 3, 7, 15, 30 e 45 dias), sendo armazenadas nas mesmas temperaturas descritas anteriormente. No capítulo 1 observou-se efeito linear positivo (P=0,001) sobre o consumo de MS total devido ao aumento nas quantidades de suplemento fornecido aos animais, porém observou-se efeito quadrático (P=0,018) sobre a ingestão de MS proveniente do pasto. A ingestão de N diferiu entre os tratamentos (P<0,05), causado pelo aumentou na ingestão de suplemento, o que possibilitou aumento (P=0,001) na ingestão de CN. O fornecimento de suplementação possibilitou efeito sobre a concentração de N amoniacal ruminal (P<0,05). A concentração de N uréico no soro (NUS) foi afetada (P<0,05) pelo fornecimento de concentrado no período de 24 horas, porém o tratamento PC0 não apresentou variação na concentração de NUS (P>0,05), em função da ausência de suplementação. A excreção de creatinina diária foi de 23,01 ± 0,19 (22,82 – 23,2) mg/kgPC. As excreções de AL, AU e DP, em mmol, foram influenciadas linearmente pelos tratamentos (P=0,002; P=0,004; P=0,003, respectivamente). A síntese de nitrogênio microbiano (NM) foi influenciada, assim como as excreções de DP, linearmente (P=0,001) pelos tratamentos. As relações entre AL, AU e DP com a creatinina, não foram influenciadas pelos dias de coleta, períodos de coleta, tratamentos e suas interações (P>0,05), apresentando média de relações de 1,36 para AL:creatinina, 0,121 para AU:creatinina e 1,48 para PD:creatinina. Além do efeito de tratamento sobre a excreção de NU e NUrea, a excreção de CN na urina foi influenciada (P<0,05) também pelos períodos de coleta. As relações NU:creatinina e NUreia:creatinina na urina não apresentaram efeito (P>0,05) de tratamento, dias e períodos de coleta. A avaliação comparativa da excreção de creatinina observada nas amostras obtidas a partir da coleta total de urina, a cada 4 horas por 3 dias, com as amostras spot de urina obtidas em momentos pontuais (às 12, 16, 20, 0, 4 e 8 horas), demonstrou não haver diferença (P>0,05) entre as duas formas de coleta estudadas. A observação das relações AL:creatinina e AU:creatinina, nos métodos de coleta avaliados neste estudo, possibilitou a observação de que não houve variação (P>0,05) entre as amostras obtidas na forma de coleta total ou spot de urina. Na análise das relações NU:creatinina e NUreia:creatinina, observou-se que os horários das amostras obtidas às 4, 8, 12, 16 e 20 horas, foram similares (P>0,05) independentemente do método de amostragem. Entretanto, no horário da meia noite (amostragem 20h00-24h00, coleta total/0 hora, coleta spot de urina), observou-se variação na excreção de NU (inclinação, P=0,03) e de NUreia (inclinação, P=0,01; e intercepto, P=0,03), indicando que coletas spot de urina realizadas neste horário, não representariam a excreção de CN ao longo do período de 24 horas. Conclui- se que a excreção de creatinina é constante em 24h e estima adequadamente o volume urinário em bovinos mantidos em pastejo; e que uma única amostra spot de urina obtida no pasto, em qualquer horário do dia, pode ser usada para estimar a excreção de derivados de purinas. Para a estimativa da excreção de CN na urina são necessárias duas amostras spot de urina, uma quatro horas antes e outra quatro após a suplementação, em bovinos em pastejo. Os principais resultados do capítulo 2 foram que, a recuperação da creatinina foi constante (P>0,05) até o décimo quinto dia de armazenamento, independente da temperatura utilizada. A partir do 30o dia de armazenamento houve efeito de tempo e/ou temperatura (P<0,05) na recuperação de creatinina na urina de bovinos. As amostras armazenadas em temperatura ambiente e a 4oC apresentaram aumento na concentração da creatinina relativa com o passar dos dias (P<0,05). As amostras congeladas (-20oC e a -40oC) mantiveram a recuperação constante (P>0,05). A adição de creatina na urina causou aumento (P<0,05) nas concentrações de creatinina nas amostras armazenadas a temperatura ambiente e em refrigeração, a partir de 30 dias de armazenamento. Nas amostras armazenadas em temperaturas de congelamento, não houve alteração na concentração de creatinina (P>0,05). Amostras de urina podem ser armazenadas em qualquer temperatura estudada até quinze dias após a coleta para determinação da concentração de creatinina. Amostras que necessitem tempos de armazenamentos superiores a quinze dias devem ser congeladas a -20oC ou -40oC. / Aimed to evaluate the creatinine excretion to validate the urine spot sampling technique, as well as the excretions of purine derivatives (PD) and nitrogen compounds (NC) and their relationship with creatinine in Nelore heifers supplemented on pasture (Chapter 1); Were also aimed evaluate the recovery of creatinine as a function of time and different storage temperatures (Chapter 2). The experiment related to Chapter 1 were conducted in the beef cattle department of the Federal University of Viçosa/MG, using five Nelore heifers with mean body weight (BW) of 400 ± 15 kg, distributed in 5x5 Latin square. The five experimental treatments were based on protein-energy supplementation (concentrate with 22% crude protein in dry matter (DM) bases) offered based on BW (0, 3, 6, 9 and 12 g/kg BW (BW0, BW3, BW6, BW9 and BW12, respectively)). Each experimental period had a duration of 16 days, 12d to diet adaptation and four to sampling of urine, feces, blood and ruminal fluid. The total collection of urine and spot of feces sample was performed in three days, from 0:00-4:00, 4:00-8:00, 8:00-12:00, 12:00-16:00, 16:00- 20:00 and 20:00-24:00. Sampling spot of urine was performed for 24 hours, as well as the collection of ruminal fluid and blood at the times of 0, 4, 8, 12, 16, 20 hours. For total urine collection, a Folley no26 probe was used, coupled with a polyethylene hose that carried the urine to a closed urine collection bag, which was emptied every four hours. Sampling of the urine was performed every 4 hours, at the same times as described for blood sampling, by measuring the volume and taking two samples, one diluted with 0.036N H2SO4 and one undiluted. To determine fecal excretion, titanium dioxide, supplied in the total daily amount of 15 g, was used between days 8th and 16th of each period. In order to estimate pasture consumption, indigestible neutral detergent fiber (iNDF) was used as the internal marker. Pasture was collected by the square technique to determine the potentially digestible DM (pdDM) on the third day of each experimental period. On the 13th and 16th days of each period, manual grazing simulation was performed to estimate the composition of the pasture. In the urine samples, the concentrations of creatinine, total urinary nitrogen (UN), urea (UreaN), uric acid (UA) and allantoin (AL) were determined. Statistical analysis was performed using SAS's 9.4 Proc Mixed statistical software. The evaluation of the adequacy of the best form of urine collection was performed using the square root of the mean square of the prediction error (MSPE) among the urine samples obtained through spot sampling. The experiment, referring to Chapter 2, was carried out at the Animal Science Department of the UFV. Urine of twenty-five animals, ten from the Nelore and fifteen from the Holstein, were used. Urine samples (10 from Nelore and 10 from Holstein) were diluted in 0.036N H2SO4, fractionated and stored at room temperature, cooled (4°C) and frozen (-20°C and -40°C), being analyzed different days after sampling (1, 3, 7, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 days). Immediately after sampling, the urine was diluted, and its pH corrected to less than 3, and the urine was analyzed, giving a result used as a reference value of the creatinine concentration in the sample. This reference value was used as a divider of the creatinine values obtained on the days of the analysis, per sample, obtaining the relative creatinine value, which allows the observation of increase or decrease in creatinine concentration over time. To evaluate the conversion of creatine to creatinine in the urine of cattle, urine from five Holstein cows was used. These urines were also diluted and had their pH corrected below 3. To evaluate the effect of adding creatine to the urine, creatine solution (concentrations of 20, 40 and 60 mg/dL) was added to eppendorf containing diluted urine. These urines were analyzed on different days after sampling (1, 3, 7, 15, 30 and 45 days), being stored at the same temperatures described previously. In Chapter 1, a positive linear effect (P=0.001) was observed on the total DM intake due to the increase in the amount of supplementation provided to the animals. However, a quadratic effect (P=0.018) was observed on DM intake from pasture. Intake of N differed among treatments (P<0.05), caused by increased supplement intake, which allowed an increase (P=0.001) on the intake of N NC. The supply of supplementation influenced the ruminal ammoniacal N concentration (P<0.05). Serum urea N concentration (SUN) was affected (P<0.05) by the supply of concentrate in the 24-hour period, once the BW0 treatment did not show a variation in the SUN (P>0.05), as a function absence of supplementation. The creatinine excretion daily was 23.01 ± 0.19 (22.82 - 23.2) mg/kgBW. Excretions of AL, UA and PD, in mmol, were influenced by treatments (P=0.002, P=0.004, P=0.003, respectively). Microbial N synthesis (NM) was influenced, as well as the excretions of PD (P=0.001) by the treatments. The ratios between AL, UA and PD with creatinine were not influenced by collection days, collection periods, treatments and their interactions (P>0.05), with an average ratios of 1.36 for AL:creatinine, 0.121 for UA:creatinine and 1.48 for PD:creatinine. In addition to the treatment effect on UN and UreaN excretion, urine excretion of NC was also influenced (P<0.05) by collection periods. The UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios showed no treatment effect (P>0.05), days and collection periods. The comparative evaluation of creatinine excretion observed in the samples obtained from the total collection of urine, sampling every 4 hours per 3 days, with the urine spot samples obtained at punctual moments (at 12, 16, 20, 0, 4 and 8 hours), showed no difference (P>0.05) between the two techniques of sampling. The observation of AL:creatinine and UA:creatinine of the two methods evaluated in this study allowed the observation that there was no variation (P>0.05) between the samples obtained in the form of total collection or urine spot. The analysis of the UN:creatinine and UreaN:creatinine ratios, it was observed that the sample times obtained at 4, 8, 12, 16 and 20 hours were similar (P>0.05) regardless of the sampling method. However, at midnight (sampling 20h00-24h00, total collection/0h, urine spot collection), there was variation in the excretion of UN (slope, P=0.03) and UreiaN (slope, P=0.01, and intercept, P=0.03), indicating that urine spot collections performed at this time would not represent NC excretion over the 24-hour period. Concluded that creatinine excretion is constant in 24 hours and adequately estimates the urinary volume in beef cattle kept in pasture; and that a single urine spot sample obtained in the pasture, at any time of the day, can be used to estimate the purine derivatives excretion. However, two urine spot samples, one obtained four hours before and other four hours after supplementation, are required for the estimation of excretion of CN in urine in grazing cattle. The main results of Chapter 2 were that the creatinine recovery was constant (P>0.05) until the 15th day of storage, regardless of the temperature used. From the 30th day of storage there was a time and/or temperature effect (P<0.05) on the recovery of creatinine in bovine urine. Samples stored at room temperature and at 4oC showed an increase in relative creatinine concentration with the passage of days (P<0.05). Frozen samples (-20oC and -40oC) maintained the constant recovery (P>0.05). The addition of creatine in the urine caused an increase (P<0.05) on creatinine recovery in the samples stored at room temperature and in refrigeration, after 30 days of storage. In samples stored at freezing temperatures, there was no change in creatinine recovery (P>0.05). Urine samples can be stored at any temperature evaluated to 15 days after collection for determination of creatinine concentration. Samples requiring storage times greater than 15 days should be frozen at - 20°C or -40°C.

Chronic exercise has been recommended as a strategy for preventing several diseases associated with lifestyle such as heart disease, hypertension, osteoporosis and type II diabetes. Although regular physical exercise has benefits for health, all sports practitioners, and even sedentary people, have already feel delayed onset muscle soreness (DOMS) once, characterized by discomfort in skeletal muscle. As the most DOMS generator, acute eccentric exercise induce fatigue, strength reduction and performance impairment. Despite some researches demonstrating reactive oxygen species (ROS) in this context, there are few information about purine degradation as well as transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) on DOMS development. In this context, animals performed a downhill running test (eccentric exercise) on treadmill until exhaustion for histologic evaluation, mechanical allodynea, strength force test and biochemical analysis. The results showed an increase in mechanical allodynea and ADP, AMP, uric acid and TRPV1 immunoreactivity levels. In conclusion, the results support the contribution of ROS and the participation of purine and TRPV1 on delayed onset muscle soreness. / O exercício físico crônico tem sido recomendado como estratégia para a prevenção de diversas doenças associadas ao estilo de vida, como doenças cardíacas, hipertensão, osteoporose e diabetes tipo 2. Embora o exercício físico regular traga benefícios para a saúde, todos os praticantes de atividade física e esporte e, até mesmo indivíduos sedentários, já experimentaram alguma vez na vida um episódio de dor muscular tardia (DMT), caracterizada pela sensação de desconforto na musculatura esquelética. Como grande gerador de DMT, destaca-se o exercício excêntrico agudo que induz fadiga, redução de força e perda de desempenho. Apesar de diversos estudos demonstrando a participação das espécies reativas de oxigênio neste quadro, pouco se sabe sobre a participação da degradação das purinas bem como a participação dos receptores de potencial transitório vaniloide 1 (TRPV1) no desenvolvimento da dor muscular tardia. Para tanto, os ratos wistar machos realizaram teste de downhill em esteira (exercício excêntrico) até a exaustão. Após foram analisados os danos histológicos nos músculos gastrocnêmio e sóleo, Outro set de animais após a exaustão foram avaliados nos testes de alodinea mecanica na pata traseira direita, teste funcional de força nas pastas dianteiras e análises bioquímicas no músculo gastrocnêmio. Os resultados demonstram aumento na alodinea, na carbonilação protéica, nos níves de ADP, AMP, ácido úrico, além de elevar os níveis de immureatividade do receptor TRPV1 e atividade da xantina oxidase. Esses dados apontam uma possível contribuição das espécies reativas de oxigênio, da degradação de purinas e dos receptores TRPV1 na dor muscular tardia.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-11T13:26:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 720072 bytes, checksum: 73894af23151735a1fe50ae100a09e5a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T13:26:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 720072 bytes, checksum: 73894af23151735a1fe50ae100a09e5a (MD5) Previous issue date: 2003-02-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho teve os seguintes objetivos: (1) comparar os indicadores fibra em detergente ácido indigestível com o óxido crômico na determinação da digestibilidade aparente total, ruminal, intestinal total e nos intestinos delgado e grosso, da matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB), extrato etéreo (EE), carboidratos totais (CHO), fibra em detergente neutro (FDN) e carboidratos não fibrosos (CNF), comparar os métodos tradicional e da autoclave de determinação da FDN e avaliar o efeito da correção da FDN para cinzas e proteína sobre a digestibilidade total da FDN e dos CNF, em dois experimentos; (2) determinar o tempo necessário para o período de adaptação às dietas com uréia e avaliar o efeito de quatro níveis de uréia na ração: 0; 0,65; 1,3 e 1,95% na MS, e o efeito de dois níveis de proteína bruta na ração: 12 e 15%, sobre os consumos e digestibilidades aparentes totais e parciais da MS, MO, PB, EE, CHO, FDN, CNF e consumo de nutrientes digestíveis totais (NDT), em novilhos de quatro grupos genéticos: Holandês, 1⁄2 sangue Holandês-Guzerá, 1⁄2 sangue Holandês-Gir e Zebu; (3) avaliar o efeito de quatro níveis de uréia e dois teores de PB da ração, sobre o balanço de compostos nitrogenados e a estimativa da produção de proteína microbiana por meio dos derivados de purinas na urina em novilhos de quatro grupos genéticos e (4) avaliar o efeito de quatro níveis de uréia e dos dois teores de PB da ração, sobre o pH e amônia ruminais, concentração plasmática de uréia, excreção fracional de uréia e excreções de uréia e creatinina; e avaliar as perdas urinárias endógenas, por meio da excreção de creatinina em novilhos de quatro grupos genéticos. Foram conduzidos dois experimentos com novilhos de quatro grupos genéticos: Holandês, 1⁄2 sangue Holandês-Guzerá, 1⁄2 sangue Holandês-Gir e Zebu, castrados e fistulados no rúmen e no abomaso, sendo que somente os animais zebuínos foram fistulados no íleo terminal. No primeiro, 16 novilhos foram alimentados com 50% de feno de capim Tifton-85 com 3,77% PB e concentrado, essa dieta continha 12% PB, com níveis crescentes de uréia (0; 0,65; 1,3 e 1,95% na base da MS total). Os animais foram distribuídos em quatro quadrados latinos (grupos genéticos) 4x4, sendo quatro animais, quatro períodos experimentais e quatro tratamentos (rações). No segundo, 12 novilhos foram submetidos a dietas, com dois teores de PB: 12 e 15%, a base de feno de capim Tifton-85 (60%), com 11,13% PB e concentrado. Os animais foram distribuídos em um esquema fatorial 2x4, sendo dois níveis de proteína, e quatro grupos genéticos, num delineamento inteiramente casualizado, com três repetições. Além da correção da FDN para cinzas e proteína (FDNcp) nos alimentos, esse procedimento foi efetuado nas amostras de sobras e fezes, para efeito comparativo, em ambos experimentos. Para o primeiro experimento, o período experimental inicial teve a duração de 19 dias, sendo 13 dias de adaptação à dieta e 6 dias para as coletas de fezes e digestas de abomaso e íleo. A fibra em detergente ácido indigestível (FDAi) foi usada como indicador para estimar as digestibilidades. As amostras de urina foram obtidas a partir de coletas em 24 horas, no 3o dia do período de coletas de fezes. As amostras de urina também foram obtidas a partir da coleta de urina spot, quando os animais urinaram espontaneamente, no penúltimo dia do período de adaptação às dietas. O indicador microbiano utilizado para quantificar os microrganismos foi as bases purinas. Na urina foram realizadas as análises dos derivados de purinas, alantoína e ácido úrico. Foi feita comparação entre a produção microbiana usando as bases purinas no abomaso com os derivados de purinas na urina; entre as determinações da produção microbiana pelos derivados de purinas com duas equações distintas ou com as bases purinas no abomaso; e a comparação entre a estimativa da produção urinária, dos derivados de purinas e da produção microbiana através da coleta de urina spot com a coleta total de urina em 24 horas. As coletas de líquido ruminal, para determinação do pH e das concentrações de N-NH 3 , foram realizadas antes do fornecimento da dieta e 2, 4, 6 e 8 horas após. Durante a coleta de urina em 24 horas, cerca de 4 horas após a alimentação, foi coletado o sangue, e após centrifugação, obtido o plasma. Nas amostras de urina e plasma, foram determinadas as concentrações de uréia e creatinina. Para o segundo experimento, o período experimental teve a duração de 16 dias, sendo 10 dias de adaptação à dieta e 6 dias para as coletas de fezes e digestas de abomaso e íleo, sendo a FDAi também utilizada como indicador para estimar as digestibilidades. A coleta de urina realizada em 24 horas, foi feita após o período de coleta de fezes. Assim como para o primeiro experimento, foi feita comparação entre a produção microbiana usando as bases purinas no abomaso com os derivados de purinas na urina; entre as determinações da produção microbiana pelos derivados de purinas com duas equações distintas ou com as bases purinas no abomaso. As coletas de líquido ruminal, para determinação do pH e das concentrações de N-NH 3 e a coleta de sangue, foram feitas como no primeiro experimento. As digestibilidades totais e parciais da MS, MO, PB, EE, CHO, FDN e CNF não diferiram (P>0,05) comparando-se os indicadores, nos experimentos. Os teores de FDN das amostras não diferiram (P>0,05) entre as metodologias tradicional e da autoclave, assim, as demais análises de FDN foram feitas por este último método. A digestibilidade total da FDN e dos CNF, comparando-se a utilização da FDN sem correção com a FDNcp nos alimentos, fezes e sobras para ambos estudos, diferiram entre si (P<0,05). Como as médias para o consumo de MS, para cada nível de uréia utilizado, desde o 1° até o 12° dia do período de adaptação, não diferiram (P>0,05) da média padrão (do 13° dia), o período de adaptação das dietas dos períodos experimentais subsequentes foi reduzido para 10 dias. Houve interação de grupos genéticos e níveis de uréia na ração para o consumo de MS em %PV. As digestibilidades ruminais da MS e MO que apresentaram maiores valores, foram as dos animais mestiços. As digestões ruminais e intestinais totais dos carboidratos, sejam CHO, FDN ou CNF, não diferiram entre os grupos genéticos (P>0,05). As digestões ruminais e intestinais totais da MS, MO e dos nutrientes, não foram influenciadas pela adição de uréia na dieta (P>0,05). Para o segundo experimento, o consumo de MS (Kg/dia) foi superior para os Holandeses, intermediário para os dois grupos de mestiços, contudo, os animais 1⁄2 Holandês-Guzerá consumiram mais que os 1⁄2 Holandês-Gir, que foram superiores em relação aos zebuínos. As ingestões de MS e dos nutrientes, em Kg/dia ou em % PV, não diferiram para as dietas contendo 12 ou 15% de PB (P>0,05), com exceção do consumo de PB que foi superior para a dieta com 15% de PB. A digestão total, ruminal e intestinal total da MS não diferiu entre os grupos genéticos, e teores de PB (P>0,05). Tanto para o pH, como para a amônia ruminal, apenas para o horário que antecedeu a alimentação, os níveis de proteína não diferiram entre si (P>0,05), o que não ocorreu para os demais tempos de coleta (P<0,05). As concentrações de amônia ruminal foram superiores para o maior nível de proteína bruta da ração (P<0,05). A excreção fracional de uréia não diferiu entre os animais e conteúdo de proteína da dieta (P>0,05). A concentração plasmática e a excreção urinária de uréia não diferiu entre os grupos genéticos (P>0,05) e foi superior para o teor de 15% de PB da dieta. Recomenda-se a utilização da FDAi como indicador na determinação da digestibilidade aparente total e parcial. Sugere-se o uso do método da autoclave para determinação da FDN. Recomenda-se não corrigir a FDN nos alimentos somente. A correção da FDN para cinzas e proteína subestima a digestibilidade da FDN e superestima a dos CNF, sugerindo que a digestibilidade da FDN seja multiplicada por 1,042 e a dos CNF seja multiplicada por 0,96. Para o primeiro experimento, recomenda-se redução no período de adaptação para 7 dias, o que resulta em economia de tempo e gasto com alimentação. O consumo, em Kg/dia, foi maior para os animais do grupo genético Holandês, seguido pelos mestiços e Zebu. A digestibilidade total da MS não foi influenciada pelos grupos genéticos nem pelos níveis de uréia nas rações. De uma maneira geral, os locais de digestão não foram alterados pelo tipo de animal (taurino, zebuíno e seus mestiços) e pela inclusão de uréia na ração. Os animais zebuínos apresentaram ingestão, excreção e balanço de compostos nitrogenados inferior aos demais grupos genéticos. A retenção de compostos nitrogenados apresentou redução com a utilização de uréia na dieta. A produção e as eficiências microbianas mostraram-se superiores para os animais Holandeses, intermediárias para os mestiços e inferiores para os zebuínos. A coleta de urina spot consiste em metodologia rápida e eficaz na estimativa da excreção urinária dos derivados de purinas e da produção de compostos nitrogenados microbianos. O pH ruminal apresentou o mesmo comportamento para os grupos genéticos e foi influenciado positivamente pela inclusão de uréia na dieta. As concentrações de amônia ruminal foram influenciadas positivamente pelos níveis de uréia na ração para os animais Holandeses e mestiços. A concentração plasmática de N-uréia aumentou linearmente em função da adição de uréia na ração. Para o segundo experimento, o consumo foi maior para os animais Holandeses, seguidos pelos mestiços e Zebu. O consumo de matéria seca não foi influenciado pelos teores de proteína bruta da ração. De maneira geral, as digestões totais e parciais dos nutrientes não foram afetadas pelos grupos genéticos nem pelos níveis de proteína bruta da dieta. O balanço de compostos nitrogenados não foi alterado pelos teores de proteína bruta da dieta. As eficiências microbianas não foram influenciadas nem pelo grupo genético dos animais nem pelo conteúdo protéico da ração. O pH ruminal apresentou comportamento linear decrescente em função dos tempos de coleta para ambos os níveis de proteína bruta. As concentrações de amônia ruminal mostraram comportamento quadrático em função dos tempos de coleta, com valores máximos de 13,67 e 20,87 mg N-NH 3 /dL, para os níveis de 12 e 15% de PB da ração, respectivamente. Para ambos experimentos, a estimativa da produção de compostos nitrogenados microbianos pode ser feita a partir da excreção dos derivados de purinas na urina, e sugere-se que a excreção urinária dos derivados de purinas seja determinada utilizando a equação de Orellana Boero et al. (2001). A excreção de creatinina não foi influenciada pelos grupos genéticos nem pelos níveis de uréia ou de proteína bruta na dieta, e apresentou valores médios de 27,76 e 27,78 mg/Kg PV, respectivamente para o primeiro e segundo experimentos. Sugere-se que as perdas urinárias endógenas de compostos nitrogenados pode ser estimada a partir da excreção de creatinina. / This work was carried out to: (1) compare the markers indigestible acid detergent fiber and chromium oxide to determine the total, ruminal and total intestinal apparent digestibility and in the small and large intestines, of dry matter (DM), organic matter (OM), crude protein (CP), ether extract (EE), total carbohydrates (CHO), neutral detergent fiber (NDF) and non fiber carbohydrates (NFC), compare two methods (traditional and autoclave) that determine NDF content and evaluate the effect of NDF corrected for ashes and protein on the NDF and NFC total digestibility, in two experiments; (2) determine the time necessary to animals to adapt to the diets with urea and evaluate the effect of four dietary urea levels (0, 0.65, 1.3 and 1.95% in DM) and of two dietary protein levels (12 and 15%) on the intake and total and partial apparent digestibility of DM, OM, CP, EE, CHO, NDF, NFC and total digestible nutrients intake (TDN), in steers of four genetic groups: Holstein, 1⁄2 Holstein-Guzera, 1⁄2 Holstein-Gir and Zebu; (3) evaluate the effect of four dietary urea levels and of two dietary protein levels on the nitrogen compounds balance and the microbial protein production by the urinary purine derivatives in steers of four genetic groups; and (4) evaluate the effect of four dietary urea levels and of two dietary protein levels on the ruminal pH and ammonia, urea xvplasma concentration, urea fractional excretion and urea and creatinine excretions, and evaluate the endogenous urinary losses by the creatinine excretion in steers of four genetic groups. Two experiments were carried out with steers of four genetic groups: Holstein, 1⁄2 Holstein-Guzera, 1⁄2 Holstein-Gir and Zebu; castrated and fistulated in the rumen and abomasum, and only Zebu were fistulated in the terminal ileum. In the first experiment, 16 steers were fed diet with 50% Tifton-85 bermudagrass hay with 3.77% CP and concentrate, these diets were composed of 12% CP, with increasing urea levels (0, 0.65, 1.3 and 1.95% in total DM basis). The animals were assigned to four 4x4 latin squares (genetic groups), being four animals, four experimental periods and four treatments (rations). In the second experiment, 12 steers were fed diets with two CP contents (12 and 15%), with 50% Tifton-85 bermudagrass hay (60%), 11.13% CP and concentrate. The animals were assigned to a 2x4 factorial scheme (genetic groups), being two crude protein levels and four genetic groups, in a completely randomized design, with three replicates. Besides the NDF correction for ash and protein (NDFap) in the feedstuffs, this methodology was applied in the orts and feces samples, in both experiments. The first initial experimental period lasted 19 days, 13 days for adaptation and 6 days for collections of feces and abomasum and ileum digesta. The indigestible acid detergent fiber (FDAi) was used as marker to estimate the digestibility. The urine samples were obtained from 24-h collection, at the 3 rd day of feces collections, and also from spot urine collection, when the animals spontaneously urinated, at the next to the last day of adaptation period. The purine base method was used as microbial marker to determine the microorganisms. In the urine, the analyses of purine derivatives, allantoin and uric acid were performed. A comparison among the: microbial production using the purine bases in the abomasum and urinary purine derivatives; determination of microbial production by purine derivatives using two different equations or purine base method in the abomasum; and estimate of urinary estimate of purine derivatives and microbial production by means of spot urine collection and by 24-h total urine collection, was performed. The ruminal liquid collections, to determine pH and N-NH 3 concentrations, were performed before feeding and 2, 4, 6 and 8 hours post feeding. During the 24-h urine collection, 4 hours after feeding, blood was collected and, after centrifugation, plasma was xviobtained. In the urine and plasma samples, the urea and creatinine concentrations were determined. In the second experimental period lasted 16 days, 10 days for adaptation and 6 days for collections of feces and abomasum and ileum digesta, and ADFi was also used as marker to estimate the digestibility. The 24-h urine collection was performed after the feces collection. As in the first experiment, comparison among the: microbial production using the purine bases in the abomasum and urinary purine derivatives; determination of microbial production by purine derivatives using two different equations or purine base method in the abomasum, was performed. The ruminal liquid collections, to determine pH, N-NH 3 concentrations and blood collection, were performed in the first experiment. Total and partial digestibility of DM, OM, CP, EE, CHO, NDF e NFC showed no significant (P>.05) effect when the markers were compared in both experiments. NDF contents of samples showed no significant (P>.05) effect among the methodologies (traditional and autoclave; so, the other NDF analyses were performed by the last method). NDF and NFC total digestibility, by comparing NDF without correction and NDFap in the feedstuffs, feces and orts for both studies, showed difference (P<0.05). As means for DM intake, at each urea levels, from 1 st to 12 th day of adaptation period, did not differ (P>.05) from the standard mean (13 th day), the adaptation period of the subsequent experimental periods was reduced by 10 days. There was interaction among the genetic groups and the dietary urea levels for DM intake in %LW. Crossbred animals showed the highest values of DM and OM ruminal digestibility. There was no significant effect (P>.05) of the ruminal and total intestinal digestion of CHO, NDF or NFC, among the genetic groups. Ruminal and total intestinal digestion of DM, OM and nutrients were not affected (P>0.05) by the increasing dietary urea levels. In the second experiment, Holstein showed higher DM intake (kg/day), intermediary values for both crossbred groups however, 1⁄2 Holstein-Guzera showed higher intake than 1⁄2 Holstein-Gir, that were superior than Zebu. DM and nutrients intake, in kg/day or % LW, showed no difference (P>0.05), for the diets with 12 or 15% CP, except for CP intake, that was higher for the diet with 15% CP. Total, ruminal and total intestinal DM intake showed no difference (P>0.05) among the genetic groups and CP contents. Protein levels showed no significant effect (P>0.05) for pH and ruminal ammonia only before feeding, but significant effect xvii(P<0.05) was observed for the other collection times. Ruminal ammonia concentration showed higher values (P<0.05) for the highest dietary crude protein levels. Urea fractional excretion did not differ (P>0.05) among animals and dietary protein content. Plasma concentration and urinary urea excretion did not differ (P>0.05) among the genetic groups and showed higher values for the diet with 15% CP. It is recommended to use ADFi as marker to determine the digestibility and also to use the autoclave methodology to determine NDF and not to correct NDF. It is recommended not to correct NDF content only in the feedstuffs. The NDF correction for ash and protein underestimated NDF digestibility and overestimated NFC digestibility, suggesting that the NDF digestibility could be multiplied by 1.042 and the NFC digestibility could be multiplied by 0.96. For the first experiment, it is recommended reduction on the adaptation period by 7 days, that results in economy of time and feeding costs. Holstein showed the highest intake values (kg/day), followed by the crossbred and Zebu. Total DM digestibility was affected nor by the genetic group, neither by the dietary crude protein levels. Digestion compartments were not affected by the genetic group (Taurus, Zebu and its crossbred) and by the increasing dietary urea levels. Zebu showed smaller values of intake, excretion and nitrogen compounds balance than the other genetic groups. Nitrogen compounds retention showed reduction as dietary urea levels increased. Holstein showed higher values of microbial production and efficiency, the crossbred groups, intermediary values and Zebu, smaller values. The spot urine collection is a fast and efficient methodology to estimate the excretion of urinary purine derivatives and the microbial nitrogen compounds production. Ruminal pH showed the same behavior among the genetic groups and significant effect as the dietary urea levels increased. The ruminal ammonia concentrations were affected by the increasing dietary urea levels for the Holstein and crossbred. N-urea plasma concentration linearly increased as the dietary urea levels increased. In the second experiment, Holstein showed higher intake values, followed by crossbred and Zebu. Dry matter intake was not affected by the dietary urea levels. Total and partial nutrients digestibility were affected nor by the genetic group, neither by the dietary crude protein levels. Nitrogen compounds balance was not affected by the dietary crude protein levels. Microbial efficiency was affected nor by the genetic groups, xviiineither by the dietary crude protein levels. Ruminal pH Ruminal pH showed decreasing linear behavior, according to the collection times for both crude protein levels. The ruminal ammonia concentration showed quadratic answer, according to the collection times, with maximum values of 13.67 and 20.87 mg N-NH 3 /dL, for the levels of 12 and 15% CP in the diet, respectively. For both experiments, the estimate of microbial nitrogen compounds production can be obtained from the excretion of urinary purine derivatives. It is recommended to determine the excretion of urinary purine derivatives by using the Orellana Boero et al. (2001) equation. Creatinine excretion was affected nor by the genetic group, neither by the increasing dietary urea levels and showed average values of 27.76 and 27.78 mg/kg LW, respectively, for the first and second experiment. It is recommended that endogenous urinary losses of nitrogen compounds can be estimated from the creatinine excretion.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo / La producción de cerdos en Chile ha aumentado significativamente en los últimos años, lo que ha traído como consecuencia la generación de grandes volúmenes de purines. Lo anterior ha causado un problema ambiental debido a que se hace necesaria una disposición final de dichos purines, los cuales contienen entre otros elementos concentraciones altas de nitrógeno (N), siendo la aplicación de purines a los suelos uno de los destinos más usados. Por esto es necesario conocer el efecto de la aplicación de purines de cerdo en la dinámica del N en el suelo, particularmente en suelos de textura gruesa que son más susceptibles de sufrir pérdidas de N por lixiviación. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la aplicación de purín de cerdo en el ciclo del N en un suelo de textura gruesa bajo cultivo de maíz para silo. Se estableció un ensayo de campo que consideró dos tratamientos: un cultivo de maíz para silo que recibió en total 359 kg N ha -1 a través de purines de cerdos aplicado mediante riego por pivote central (SCE); y un tratamiento control sin aplicación de purines de cerdo y sin manejos agronómicos (SSE). Se monitorearon las concentraciones de nitrato (N-NO 3 ), amonio (N-NH 4 ) y el contenido de agua del suelo a 3 profundidades: 25 cm, 50 cm y 100 cm; en 9 fechas durante el período de cultivo (Octubre 2011- Enero 2012). También se midió la lixiviación de N a los 100 cm, la mineralización neta de N, y la relación C/N en el suelo al inicio y final del estudio. Al final del estudio se cosecharon plantas de maíz para calcular la extracción de N por el maíz para silo. Usando estas variables se estableció un balance de N que incluyó: i) la adición de N a través del purín, ii) la mineralización neta de N, iii) la absorción de N por el cultivo, iv) la lixiviación de N vi) y estimaciones de las pérdidas gaseosas de N. Según los resultados del monitoreo bajo las condiciones estudiadas, el efecto de la aplicación de purín de cerdo mediante riego por pivote central en un suelo de textura gruesa bajo cultivo de maíz para silo no presentó un riesgo de contaminación de N hacia las napas subterráneas. La aplicación de purines de cerdo fue efectiva en promover la mineralización neta de N en SCE, existiendo diferencias significativas (p<0,05) con SSE. Los contenidos de N-NO 3 fueron significativamente (p<0,05) mayores solo a los 25 cm de profundidad en SCE en comparación con el sitio testigo (SSE); mientras que en los niveles de N-NH 4 se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre los tratamientos solamente en las últimas tres fechas de muestreo. Los contenidos de carbono orgánico (CO) y el N total en el suelo presentaron diferencias significativas (p<0,05) entre los tratamientos, sin embargo no se reflejó en la relación C/N. En SCE la salida principal de N desde el suelo correspondió a la absorción por el cultivo. No se identificó riego de contaminación de N hacia las napas subterráneas, lo que reflejó adecuados métodos y dosis de aplicación de purines de cerdo. / Swine production in Chile has been increased significantly in recent years, generating large volumes of pig slurry. This has caused an environmental concern about the safe disposal of these slurries, which contain among other elements, high concentrations of nitrogen (N) being the application of manure to soils one of the most used practices. Therefore it is necessary to know the effect of pig slurry application on N dynamics in the soil, particularly in coarse-textured soils that are more prone to N leaching losses. The aim of this study was to evaluate the effect of pig slurry application on N cycling in coarse-textured soil cultivated with silage maize. It was established a field experiment that considered two treatments: silage maize that received 359 kg N ha 1- of the pig slurry by central pivot irrigation (SCE) and a control without application of pig slurry and agricultural management (SSE). Concentrations of nitrate (N-NO 3 ), ammonium (N-NH 4 ) and the water content of the soil were monitored in three depth: 25 cm, 50 cm, 100 cm; in 9 occasions during the study period (October 2011 - January 2012). The leaching of N at 100 cm depth, net N mineralization, and the soil C/N ratio were also measured. At the end of the study maize plants were harvested to calculate the N uptake by the crop. Using these variables, a N balance was established including: i) calculated N pig slurry; ii) measured net N mineralization; iii) measured N crop uptake; IV) measured N leaching; vi) and estimated N gaseous losses. According to the monitoring results under the field site, the effect of pig slurry application by central pivot irrigation on a coarse-textured soil with silage corn crop did not present a high risk of N leaching to the subterranean water. The application of pig slurry in SCE was effective in promoting net N mineralization, with significant differences (p<0.05) with SSE. The levels of N-NO 3 at 25 cm depth were significantly (p<0,05) higher in SCE than the control site (SSE); while in the N-NH 4 levels significant differences were found (p<0.05) between treatments only in the last three sampling dates. The contents of organic carbon (CO) and total N in soil showed significant differences (p<0,05) between treatments, however, not reflected in the carbon to N ratio. In SCE the main N output from the soil corresponded to the crop N uptake. No risk of contamination of N identified, reflecting appropriate methods and application rates of pig slurry.

Resumo: As técnicas mais usadas atualmente para alterar o fluxo metabólico por uma determinada via são a deleção e/ou inserção de sequências regulatórias ou genes no cromossomo bacteriano. Estes são métodos que alteram permanentemente a via metabólica em questão, perturbando o balanço metabólico durante a fase lag de crescimento, o que muitas vezes leva a um excessivo prolongamento desta fase além de diminuir a viabilidade celular. O metabolismo de purinas em Bacillus subtilis tem grande potencial para manipulação genética e produz metabólitos com valor biotecnológico. Cinco riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE e pbuG) controlam o metabolismo de purina em B. subtilis promovendo a terminação precoce da transcrição em ligação com guanina ou adenina. O GTP gerado nesta via é utilizado na biossíntese da vitamina B2 (riboflavina), apresentando o mesmo mecanismo de regulação com riboswitch de flavina-monofosfato (ribDG). Neste estudo, um novo modelo de controle de metabolismo de purina foi construído visando o aumento reversível do fluxo de carbono pela via em B. subtilis utilizando pequenos RNAs não-codificadores sintéticos (sRNAs). Estes foram desenhados e sintetizados para interferir na regulação da expressão gênica realizada pelos riboswitches, mantendo assim a via biossintética ativa. Os riboswitches foram caracterizados por uma nova metodologia in vitro na presença dos ligantes guanina, adenina ou FMN, e nas células de B. subtilis, sendo possível constatar o papel regulador sobre o op... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The currently employed tools to redirect metabolic flux through a specific pathway are deletion and/or insertion of regulatory sequences or genes in the bacterial chromosome. These methods permanently modify the pathway perturbing the metabolic balance during the lag growth phase, which generally extends this process and also decreases cell viability. The purine metabolism in Bacillus subtilis has great potential for genetic manipulation and produces value-added biotechnological products. Five riboswitches (purE, xpt, nupG, pbuE and pbuG) control the purine metabolism in B. subtilis by promoting the premature transcription termination guided by guanine or adenine levels in the cell. The GTP generated in this pathway is used in the biosynthesis of vitamin B2 (riboflavin), which is regulated by a flavin-monophosphate riboswitch (ribDG). In this study, a new metabolism control model was developed aiming to reversibly increase the carbon flux through selected pathways employing small synthetic non-coding RNAs (sRNAs). These sRNAs were designed and synthesized to interfere with the regulation of gene expression performed by the riboswitches, thus maintaining the biosynthetic pathways active. The riboswitches were characterized by a new in vitro methodology in the presence of the ligands: guanine, adenine or FMN. The riboswitches were characterized in B. subtilis cells using the luxABCDE bioluminescence operon as reporter. Synthetic sRNAs were designed in the Ribomaker software to ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A presente tese foi elaborada em três capítulos, correspondente às seções 2, 3 e 4. No primeiro objetivou-se avaliar a associação de quitosana com grão de soja integral nas dietas sobre o consumo, fermentação ruminal, digestibilidade e metabolismo de nutrientes e seus efeitos sobre a produção de leite, perfil de ácidos graxos do leite e a eficiência produtiva de vacas em lactação. Para tal, 24 vacas multíparas da raça Holandesa, oito dessas com cânula ruminal, foram distribuídas em quadrados latinos 4×4 replicados. Os tratamentos foram obtidos por esquema fatorial 2×2 pela combinação de quitosana e grão de soja integral nas dietas. De modo geral, a associação de quitosana com grão de soja aumentou a eficiência de fermentação ruminal, reduziu as populações bacterianas ligadas à biohidrogenação e aumentou o teor de ácidos graxos insaturados na gordura do leite, mas houve significativa redução do consumo e digestibilidade dos nutrientes, da síntese de proteína microbiana e da produção de leite. No entanto, a adição de quitosana em dietas sem suplementação lipídica pode ser uma boa estratégia nutricional para aumentar a retenção de N e a eficiência alimentar de vacas em lactação, e adicionalmente, aumentar o teor de ácidos graxos insaturados e de cis-9, trans-11 CLA no leite. No segundo capítulo, o objetivo geral foi avaliar os indicadores externos Cr2O3 e TiO2 e os internos MSi, FDNi e FDAi, estes analisados em diferentes sacos de incubação in situ, a partir da acurácia, precisão e robustez das estimativas de excreção fecal em ensaio de digestão com vacas leiteiras consumindo diferentes dietas. Foram utilizadas oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de fezes com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, o Cr2O3 gerou estimativas acuradas e precisas, no entanto a recuperação fecal e a robustez foram afetadas pelo consumo de extrato etéreo das vacas. O indicador TiO2 apresentou incompleta recuperação fecal, baixa acurácia, precisão e robustez. Dentre as combinações avaliadas para os indicadores internos, a FDNi em sacos de poliéster teve completa recuperação fecal e gerou as estimativas mais acuradas, precisas e robustas. A falta de acurácia e precisão dos indicadores têm grande impacto final sobre as estimativas de digestibilidade. No terceiro capítulo, o objetivo foi avaliar o uso da creatinina como indicador do volume urinário para estimativas de excreção total de derivados de purinas como técnica de avaliação da produção microbiana ruminal em vacas leiteiras alimentadas com diferentes dietas. Também foram utilizadas as oito vacas canuladas no rúmen para a realização de coletas totais de urina com 24, 48 e 72 h de duração. De modo geral, a creatinina foi afetada pelas condições experimentais do estudo, incluindo efeito de dieta e variações conforme o período experimental e animais. Apesar da relação entre excreção observada e estimada de derivados de purinas, essa deve ser vista com cautela, em razão de que o volume urinário foi subestimado e que as estimativas não identificaram corretas diferenças entre as dietas, comprometendo as avaliações sobre a produção microbiana ruminal. / The present thesis was elaborated in three chapters, corresponding to sections 2, 3 and 4. In the first one, the aim was to evaluate the association of chitosan (C) and whole raw soybean (WRS) in diets, evaluating the intake, ruminal fermentation, digestibility and nutrient metabolism and its effects on milk production, milk fatty acids profile and the productive efficiency of lactating cows. Twenty four multiparous Holstein cows, eight of them fitted with ruminal cannula, were distributed in a replicated 4 × 4 Latin squares. The treatments were a combination of C and WRS diets arranged in a 2 × 2 factorial design. This association increased the efficiency of ruminal fermentation, reducing the bacterial population responsible for the biohydrogenation and increased the unsaturated fatty acids in milk. The C and WRS diets caused a significant reduction in DMI and nutrient digestibility, in microbial protein synthesis and milk yield. However, the addition of C in diets without a lipid supplementation may be a good nutritional strategy to increase the N retention and increase the food efficiency of lactating cows, and, indeed, to increase the unsaturated fatty acids content, mainly cis-9, trans-11 CLA. In the second chapter, the objective was to evaluate the external indicators Cr2O3 and TiO2 and the indigestible internal DM, NDF and ADF that were determined in in situ different incubation bags from the accuracy, precision and robustness of the fecal excretion estimates in a digestion assay with different dairy cow diets. Eight cows fitted with ruminal cannula were used to perform total fecal collection over 24, 48 and 72 hours. The Cr2O3 generated accurate estimates, however, the fecal recovery and robustness were affected by the ether extract intake. The TiO2 indicator showed incomplete fecal recovery, low accuracy, precision and robustness. Among the combinations for the internal indicators, the iNDF in polyester bags had a complete recovery and generated the most accurate and robust estimates. The lack of accuracy and precision of the indicators have a big impact on the digestibility estimates. In the third chapter, the aim was to evaluate the use of creatinine as an indicator of urinary volume. It would be possible to estimate the total excretion of purine derivatives to evaluate the ruminal microbial protein synthesis in different cow diets. Also, eight multiparous cows fitted with ruminal cannula were used to make total urine collection over 24, 48 and 72 hours. The creatinine was affected by the study experimental conditions, including dietary effect and variations according to period and animals. The relationship between observed and estimated excretion of purine derivatives should be viewed with caution, because the urinary volume was underestimated and the estimates did not identify the correct differences between diets, that could compromise the evaluations of ruminal microbial production.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-11-16T17:10:10Z No. of bitstreams: 1 LUIZA_GALINA_DIS.pdf: 1777509 bytes, checksum: 10f8e8aad062fd20340b3c276f2bc3c8 (MD5) / Rejected by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br), reason: Devolvido devido ? data de defesa cadastrada na publica??o (10/11/2017) estar diferente da data de defesa que consta na folha de aprova??o da banca (26/10/2017) do arquivo PDF. on 2017-11-22T18:24:06Z (GMT) / Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-11-23T16:44:27Z No. of bitstreams: 1 LUIZA_GALINA_DIS.pdf: 1777509 bytes, checksum: 10f8e8aad062fd20340b3c276f2bc3c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-12-01T12:15:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LUIZA_GALINA_DIS.pdf: 1777509 bytes, checksum: 10f8e8aad062fd20340b3c276f2bc3c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T12:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LUIZA_GALINA_DIS.pdf: 1777509 bytes, checksum: 10f8e8aad062fd20340b3c276f2bc3c8 (MD5) Previous issue date: 2017-10-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Adenylosuccinate lyase (ASL) belongs to aspartase/fumarase superfamily of enzymes which share a general acid-base catalytic mechanism with ?-elimination of fumarate as common product. ASL is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Cloning, expression, and a method to obtain homogeneous recombinant ASL from Leishmania braziliensis (LbASL) are described. Mass spectrometry analysis of recombinant LbASL, oligomeric state determination and multiple sequence alignment are presented. Steady-state kinetics of LbASL showed a Michaelis-Menten pattern. Isothermal titration calorimetry binding assays suggested that LbASL follows a Uni-Bi ordered kinetic mechanism, in which release of fumarate is followed by AMP to yield free enzyme. Initial velocity data for the reverse reaction and the Haldane relationship allowed calculation of an unfavorable equilibrium constant for LbASL-catalyzed chemical reaction. The activation energy and thermodynamic activation parameters were estimated. Solvent kinetic isotope effects V/K and V suggest a modest contribution of solvent proton transference during the rate-limiting step of the reaction. Proton inventory data show that the modest normal effect on V arises from a single protonic site, and the transition state fractionation factor value of 0.74 suggests participation of solvent proton transfer in transition-state vibrations perpendicular to the reaction coordinate. pH-rate profiles for kcat and kcat/KM suggested amino acid residues involved in, respectively, catalysis and substrate binding. A model of LbASL was built to provide a structural basis for the experimental data. A better understanding of the mode of action of LbASL is useful for the rational design of antileishmaniasis agents. / A enzima Adenilosuccinato liase (ASL) pertence a superfam?lia de enzimas aspartase/fumarase, as quais compartilham o mecanismo catal?tico ?cido-b?sico com ?-elimina??o de fumarato como o produto comum. A ASL est? envolvida tanto na bioss?ntese de novo quanto na via de salvamento de purinas. Aqui s?o descritos os m?todos de clonagem, express?o e obten??o da prote?na recombinante ASL de Leishmania braziliensis (LbASL) na sua forma homog?nea. An?lises da prote?na recombinante por espectrometria de massa, determina??o do estado oligom?rico e alinhamento m?ltiplo de sequ?ncias tamb?m s?o apresentados. Ensaios de cin?tica em estado estacion?rio mostraram que a LbASL segue o perfil de Michaelis-Menten. Experimentos de titula??o isot?rmica por calorimetria sugerem que a LbASL segue um mecanismo cin?tico Uni-Bi ordenado, no qual o fumarato ? liberado primeiro do s?tio ativo seguido pelo AMP. Dados de velocidade iniciais para a rea??o reversa e a rela??o de Haldane permitiram calcular uma constante de equil?brio desfavor?vel para a rea??o qu?mica catalisada pela enzima. Os par?metros de energia de ativa??o e termodin?mica tamb?m foram estimados. Os efeitos isot?picos do solvente V/K e V sugerem uma modesta contribui??o da transfer?ncia de pr?tons do solvente durante o passo limitante da rea??o. Os dados obtidos no invent?rio de pr?tons mostram um modesto efeito em V resultante de um ?nico s?tio prot?nico, e o valor de transi??o do fator de estado de fracionamento de 0,74 sugere a participa??o da transfer?ncia de pr?tons do solvente em vibra??es de estado de transi??o perpendiculares ? coordenada da rea??o. Experimentos de perfil de pH para kcat e kcat/KM sugerem os res?duos de amino?cidos envolvidos, respectivamente, na cat?lise e liga??o do substrato. A modelagem molecular para LbASL foi realizada visando prover uma base estrutural para interpreta??o dos dados experimentais. Um melhor entendimento do modo de a??o da LbASL ser? ?til para o desenho racional de agentes antileishmanioses.