Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Stoffwechselmodellierungsprojektes von Escherichia coli K-12. Grundlage dieses Projektes ist ein neuartiges Konzept, welches das zelluläre System in funktionelle Einheiten einteilt. Eine wichtige Einheit stellt die Nahrungssuche dar, die alle Gene und Genprodukte, die im Zusammenhang mit dem Kohlenstoff-Katabolismus, der Glykolyse/Glukoneogenese und der Energiegewinnung stehen, beinhaltet. Die Definition von funktionellen Einheiten erfolgt nach drei Kriterien: Gemeinsames physiologische Ziel Gemeinsame genetische Einheit Gemeinsames Signaltransduktionsnetzwerk. Eine besondere Stellung innerhalb der funktionellen Einheit Nahrungssuche nimmt das PEP zu Pyruvat Verhältnis ein. Es verbindet die Glykolyse/Glukoneogenese mit den PTSs und dem TCA-Zyklus. Die Zelle hat die Möglichkeit über dieses Verhältnis die katabolischen Aktivitäten zu messen und diese Informationen in einen intrazellulären Spiegel des Alarmons cAMP umzusetzen, durch den die Zelle der katabolischen Situation angemessen reagieren kann. Das Verhältnis von PEP zu Pyruvat wurde im Zuge dieser Arbeit weitergehend untersucht: 1) Das Verhältnis sollte von außen durch die Zugabe von Pyruvat verändert und die Reaktion auf die Phosphotransferasesysteme anhand des Phosphorylierungszustandes der PTS-Komponente EIIACrr verfolgt werden. 2) Das Verhältnis von PEP zu Pyruvat wird direkt durch die Enzyme EI, PEP-Synthase und Pyruvat-Kinase A und F eingestellt. Die Glykolyse/Glukoneogenese Enzyme wurden anhand ihrer Genexpression genauer Untersucht.

Universiẗat, Diss., 2000--Kiel.

Die Regulation des Kohlenstoffkatabolismus erfolgt in Escherichia coli wesentlich über den Einfluss der intrazellulären cAMP-Konzentration auf die Expression der Gene des crpA-Modulon. cAMP wird durch die Adenylatzyklase CyaA synthetisiert, die wiederum durch phosphoryliertes IIACrr aktiviert wird. Im Rahmen eines Stoffwechselmodellierungsprojektes sollten durch die Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und des Phosphorylierungszustands von IIACrr zwei entscheidende Parameter dieses Regulationsnetzwerkes untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein System zur reproduzierbaren, direkten Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration in E. coli etabliert. Zur in vivo Bestimmung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurden zwei verschiedene durch cAMP·CrpA regulierte Promotoren mit den Reportergenen für ß-Galaktosidase oder Aequorin (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert und in drei verschiedenen Messkonstrukten untersucht. Die Zugabe von Pyruvat zu gehungerten Zellen führte zu einer Desphosphorylierung von IIACrr. Der so direkt gezeigte Einfluss des PEP/Pyruvat Verhältnisses auf das Phosphorylierungsgleichgewicht von IIACrr zeigt einen Mechanismus, über den PTS-unabhängige Substrate den Phosphorylierungszustand von IIACrr verändern und somit die Aktivität der Adenylatzyklase beeinflussen können. Bei der Untersuchung zur zellulären Lokalisation der Adenylatzyklase in E. coli mit Hilfe einer CyaA-Aequorin-Fusion wurde nach Überexpression des Fusionsproteins eine lokale Anhäufung der Fluoreszenz an den Zellpolen beobachtet. Da bei geringerer Expression der Fusion kein Fluoreszenzsignal mehr erfasst werden konnte, war eine endgültige Lokalisierung der Adenylatzklase mit dieser Methode nicht möglich.

Background: Tumor cells are highly dependent on glucose even in the presence of oxygen. This concept called the Warburg effect is a hallmark of cancer and strategies are considered to therapeutically exploit the phenomenon such as ketogenic diets. The success of such strategies is dependent on a profound understanding of tumor cell metabolism. With new techniques it is now possible to thoroughly analyze the metabolic responses to the withdrawal of substrates and their substitution by others. In the present study we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to analyze how glioblastoma brain tumor cells respond metabolically when glucose is withdrawn and substituted by pyruvate. Methods: Glioblastoma brain tumor cells were cultivated in medium with high (25 mM), medium (11 mM) or low (5.5 mM) glucose concentration or with pyruvate (5 mM). After 24 h GC-MS metabolite profiling was performed. Results: The abundances of most metabolites were dependent on the supply of glucose in tendency but not in a linear manner indicating saturation at high glucose. Noteworthy, a high level of sorbitol production and release was observed at high concentrations of glucose and high release of alanine, aspartate and citrate were observed when glucose was substituted by pyruvate. Intermediates of the TCA cycle were present under all nutritional conditions and evidence was found that cells may perform gluconeogenesis from pyruvate. Conclusions: Our experiments reveal a high plasticity of glioblastoma cells to changes in nutritional supply which has to be taken into account in clinical trials in which specific diets are considered for therapy.

Succinat und ihre Derivate werden in vielfältiger Weise in den Bereichen Tenside, Lebensmittel, Pharmazeutika und Polymere angewendet. Aufgrund der derzeit kostenintensiven petrochemischen Synthese ist die aerobe nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica für die biotechnologische Succinatsynthese von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential dieser Hefe für eine industrielle Succinatproduktion unter Betrachtung des Einflusses der enzymatischen Aktivitäten von Succinyl-CoA Synthetase und Pyruvat-Carboxylase auf die Succinatsynthese untersucht. Es wurde eine Steigerung der Succinatausbeute um 40 % durch die Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 7-8 gemeinsam mit der Deletion des Gens der β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase im genetisch veränderten Y. lipolytica Stamm H222-AK10 (mcPYC Δscs2) erzielt. Unter Verwendung von Glycerol als C-Quelle wurde eine Erhöhung der Succinatbildung der Transformande H222 AK10 im Vergleich zum Wildtyp von 5,1 ± 0,7 g/l auf 8,7 ± 1,6 g/l nachgewiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute dieses Hefestammes verdoppelte sich von 11,9 ± 1,3 mg/l*h auf 21,9 ± 2,5 mg/l*h. Eine Erhöhung der Sekretion organischer Säuren gelang hingegen nicht durch den alleinigen Verlust der Succinyl-CoA Synthetase Aktivität in den Stämmen H222-AK4 (scs1::URA3), H222-AK8 (scs2:.URA3) und H222-AK9 (scs1::URA3 Δscs2) oder durch die alleinige Aktivitätserhöhung der Pyruvat-Carboxylase in H222-AK1 (mcPYC). Des Weiteren wurde ein Y. lipolytica Stamm erzeugt, der durch die Überexpression der für die Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene SCS1 und SCS2 charakterisiert ist. Die Transformande H222 AK2 (mcSCS1 mcSCS2) bildete unter den gleichen Kultivierungsbedingungen durchschnittlich 2 g/l weniger Succinat als der Wildtyp (5,1 ± 0,7 g/l). Auch die zusätzliche Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 4 in der Transformande H222 AK3 (mcPYC mcSCS1 mcSCS2) konnte den negativen Effekt der erhöhten Gen-Dosen von SCS1 und SCS2 auf die Succinatsynthese nicht aufheben. Dementsprechend wurden für H222-AK3 eine Succinatausbeute von 3,1 ± 0,3 g/l bestimmt.

No description available.

Background: Tumor cells are highly dependent on glucose even in the presence of oxygen. This concept called the Warburg effect is a hallmark of cancer and strategies are considered to therapeutically exploit the phenomenon such as ketogenic diets. The success of such strategies is dependent on a profound understanding of tumor cell metabolism. With new techniques it is now possible to thoroughly analyze the metabolic responses to the withdrawal of substrates and their substitution by others. In the present study we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to analyze how glioblastoma brain tumor cells respond metabolically when glucose is withdrawn and substituted by pyruvate. Methods: Glioblastoma brain tumor cells were cultivated in medium with high (25 mM), medium (11 mM) or low (5.5 mM) glucose concentration or with pyruvate (5 mM). After 24 h GC-MS metabolite profiling was performed. Results: The abundances of most metabolites were dependent on the supply of glucose in tendency but not in a linear manner indicating saturation at high glucose. Noteworthy, a high level of sorbitol production and release was observed at high concentrations of glucose and high release of alanine, aspartate and citrate were observed when glucose was substituted by pyruvate. Intermediates of the TCA cycle were present under all nutritional conditions and evidence was found that cells may perform gluconeogenesis from pyruvate. Conclusions: Our experiments reveal a high plasticity of glioblastoma cells to changes in nutritional supply which has to be taken into account in clinical trials in which specific diets are considered for therapy.

Succinat und ihre Derivate werden in vielfältiger Weise in den Bereichen Tenside, Lebensmittel, Pharmazeutika und Polymere angewendet. Aufgrund der derzeit kostenintensiven petrochemischen Synthese ist die aerobe nicht-konventionelle Hefe Yarrowia (Y.) lipolytica für die biotechnologische Succinatsynthese von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Potential dieser Hefe für eine industrielle Succinatproduktion unter Betrachtung des Einflusses der enzymatischen Aktivitäten von Succinyl-CoA Synthetase und Pyruvat-Carboxylase auf die Succinatsynthese untersucht. Es wurde eine Steigerung der Succinatausbeute um 40 % durch die Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 7-8 gemeinsam mit der Deletion des Gens der β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase im genetisch veränderten Y. lipolytica Stamm H222-AK10 (mcPYC Δscs2) erzielt. Unter Verwendung von Glycerol als C-Quelle wurde eine Erhöhung der Succinatbildung der Transformande H222 AK10 im Vergleich zum Wildtyp von 5,1 ± 0,7 g/l auf 8,7 ± 1,6 g/l nachgewiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute dieses Hefestammes verdoppelte sich von 11,9 ± 1,3 mg/l*h auf 21,9 ± 2,5 mg/l*h. Eine Erhöhung der Sekretion organischer Säuren gelang hingegen nicht durch den alleinigen Verlust der Succinyl-CoA Synthetase Aktivität in den Stämmen H222-AK4 (scs1::URA3), H222-AK8 (scs2:.URA3) und H222-AK9 (scs1::URA3 Δscs2) oder durch die alleinige Aktivitätserhöhung der Pyruvat-Carboxylase in H222-AK1 (mcPYC). Des Weiteren wurde ein Y. lipolytica Stamm erzeugt, der durch die Überexpression der für die Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene SCS1 und SCS2 charakterisiert ist. Die Transformande H222 AK2 (mcSCS1 mcSCS2) bildete unter den gleichen Kultivierungsbedingungen durchschnittlich 2 g/l weniger Succinat als der Wildtyp (5,1 ± 0,7 g/l). Auch die zusätzliche Erhöhung der Pyruvat-Carboxylase Aktivität um den Faktor 4 in der Transformande H222 AK3 (mcPYC mcSCS1 mcSCS2) konnte den negativen Effekt der erhöhten Gen-Dosen von SCS1 und SCS2 auf die Succinatsynthese nicht aufheben. Dementsprechend wurden für H222-AK3 eine Succinatausbeute von 3,1 ± 0,3 g/l bestimmt.:Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis VI Tabellenverzeichnis IX Abkürzungsverzeichnis XI 1. Einleitung 1 1.1. Bernsteinsäure, Succinat 1 1.2. Succinat als Zwischenprodukt des Tricarbonsäurezyklus 3 1.2.1. Die Enzyme des TCC in Saccharomyces cerevisiae 5 1.2.2. Succinatbildung im TCC durch die Succinyl-CoA Synthetase 6 1.2.3. Pyruvat-Carboxylase 7 1.3. Succinat als Endprodukt des Glyoxylatzyklus 9 1.4. Biotechnologische Herstellung von Succinat 10 1.4.1. Succinatproduktion mit Actinobacillus succinogenes und Anaerobiospirillum succiniproducens 11 1.4.2. Succinatproduktion mit Corynebacterium glutamicum 12 1.4.3. Succinatproduktion mit Escherichia coli 12 1.4.4. Yarrowia lipolytica als potentieller Succinatproduzent 15 1.5. Yarrowia lipolytica 15 1.6. Zielstellung 18 2. Material und Methoden 20 2.1. Geräte 20 2.2. Chemikalien, Biochemikalien und Nukleinsäuren 21 2.2.1. Feinchemikalien 21 2.2.2. Enzyme 22 2.2.3. Verbrauchsmaterialien und Kitsysteme 23 2.3. Verwendete Plasmide 23 2.4. Konstruierte Plasmide 24 2.5. Oligonukleotide 25 2.6. Mikroorganismen 26 2.6.1. Escherichia coli 26 2.6.2. Yarrowia lipolytica 27 2.7. Kultivierung 27 2.7.1. Kultivierung von Escherichia coli 27 2.7.2. Kultivierung von Yarrowia lipolytica 28 2.8. Gentechnische Methoden 29 2.8.1. Genomische DNA-Isolierung 29 2.8.2. Agarose-Gelelektrophorese 29 2.8.3. Polymerase Kettenreaktion 30 2.8.4. Verdau der DNA mit Restriktionsendonukleasen 31 2.8.5. DNA-Aufreinigung 31 2.8.6. Plasmidisolierung aus Escherichia coli 31 2.8.7. Dephosphorylierung 31 2.8.8. Ligation 32 2.8.9. Transformation elektrokompetenter Escherichia coli Zellen 32 2.9. Plasmidkonstruktion 33 2.9.1. Konstruktion der Expressionskassette für die Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 33 2.9.2. Konstruktion der Expressionskassetten für die Überexpression der Gene der α- und β-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 34 2.9.3. Konstruktion der Deletionskassette des für die α-Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gens 35 2.9.4. Konstruktion der Deletionskassette des für die β-Untereinheit der Succinyl CoA Synthetase kodierenden Gens 36 2.9.5. Sequenzierung konstruierter Plasmide 36 2.10. Transformation von Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1. Transformation von Yarrowia lipolytica mittels der LiAc-Methode 37 2.10.1.1. Herstellung chemisch kompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 37 2.10.1.2. Transformation chemisch kompetenter Hefezellen 37 2.10.2. Herstellung elektrokompetenter Yarrowia lipolytica Zellen 38 2.10.3. Elektrotransformation von Yarrowia lipolytica 38 2.11. Southern Blot 39 2.11.1. Transfer der DNA auf eine Nylonmembran 39 2.11.2. Sondenherstellung 39 2.11.3. Immunologische Detektion 40 2.11.4. Strippen der Southern Blot Membran 40 2.12. Biochemische Methoden 41 2.12.1. Ernte und Aufschluss der Hefezellen 41 2.12.2. Aktivitätsbestimmung der Citrat-Synthase 41 2.12.3. Aktivitätsbestimmung der Aconitase 41 2.12.4. Aktivitätsbestimmung der NADP-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.5. Aktivitätsbestimmung der NAD-abhängige Isocitrat-Dehydrogenase 42 2.12.6. Aktivitätsbestimmung der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase 43 2.12.7. Aktivitätsbestimmung der Succinyl-CoA Synthetase 43 2.12.8. Enzymatische Mitochondrienpräparation 46 2.12.9. Aktivitätsbestimmung der Succinat-Dehydrogenase 47 2.12.10. Aktivitätsbestimmung der Fumarase 47 2.12.11. Aktivitätsbestimmung der Malat-Dehydrogenase 48 2.12.12. Aktivitätsbestimmung der Isocitrat-Lyase 48 2.12.13. Aktivitätsbestimmung der Pyruvat-Carboxylase 48 2.12.14. Proteinbestimmung 49 2.13. Mikroskopische Bestimmung der Zellmorphologie 49 2.14. Kultivierung 49 2.14.1. Bestimmung der optischen Dichte 50 2.14.2. Animpfen der Hauptkultur 50 2.14.3. Succinatproduktionsmedium 50 2.14.4. Kultivierung unter Thiaminlimitation 51 2.14.5. Kultivierung unter Stickstofflimitation 52 2.14.6. Bestimmung organischer Säuren mittels Ionenchromatographie 52 2.15. Bioinformatik 53 3. Ergebnisse 54 3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 54 3.2. Überexpression der Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 58 3.2.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 61 3.2.2. Bestimmung der spezifischen Aktivität weiterer Enzyme 61 3.3. Überexpression der für die Pyruvat-Carboxylase und Succinyl-CoA Synthetase kodierenden Gene 63 3.3.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten der Enzyme des TCC und der PYC sowie der ICL 66 3.4. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 68 3.4.1. Bestimmung der Succinyl-CoA Synthetase Enzymaktivität 72 3.4.2. Bestimmung weiterer spezifischer Enzymaktivitäten 73 3.5. Überexpression des Gens der Pyruvat-Carboxylase gemeinsam mit der Deletion des Gens für die β Untereinheit der Succinyl-CoA Synthetase 74 3.5.1. Bestimmung der spezifischen Aktivitäten von Enzymen des TCC, sowie der PYC und ICL 76 3.6. Morphologische Veränderungen der Transformanden 78 3.7. Produktion organischer Säuren im Succinatproduktionsmedium 80 3.9.1 Bestimmung der PYC-, ICL- und SDH-Aktivitäten während der Kultivierung im Succinatproduktionsmedium 87 3.8. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 90 3.9. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 96 4. Diskussion 100 4.1. Auswahl einer geeigneten C-Quelle für die Succinatproduktion 101 4.2. Reduktion der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 102 4.3. Genetische Veränderungen, für die kein Einfluss auf die Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica nachgewiesen wurde 106 4.3.1. Überexpression des Pyruvat-Carboxylase kodierenden Gens 107 4.3.2. Deletion der Succinyl-CoA Synthetase Gene 108 4.4. Erhöhung der Succinatproduktion von Yarrowia lipolytica 112 4.5. Auswirkungen auf die Produktion anderer organischer Säuren 119 4.5.1. α-Ketoglutarat-, Pyruvat- und Fumaratproduktion unter Thiaminlimitation 119 4.5.2. Citrat- und Isocitratproduktion unter Stickstofflimitation 121 4.6. Morphologische Veränderungen 122 4.6.1. Koloniemorphologie 122 4.6.2. Zellmorphologie 124 Literaturverzeichnis 126

No description available.