Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-12T18:59:12Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Mestrado_Breno_Moacir_Farias_de_Albuquerque.pdf: 1983241 bytes, checksum: 2527dfa8747683b92433fbcc2a3e2bfc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T18:59:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_Mestrado_Breno_Moacir_Farias_de_Albuquerque.pdf: 1983241 bytes, checksum: 2527dfa8747683b92433fbcc2a3e2bfc (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / O Papilomavírus bovino (BPV) é o agente etiológico da papilomatose bovina. Esta apresenta lesões que normalmente são benignas e tendem a regredir, porém podem progredir a uma neoplasia. Muitas metodologias utilizadas para detecção de BPV se mostram inespecíficas e apresentam reações cruzadas com outros organismos relacionados. No entanto, a reação quantitativa em tempo real em cadeia da polimerase (qPCR) é uma ferramenta de destaque na detecção, tipificação e quantificação de nucleotídeos e vem sendo utilizada na clínica para avaliar carga viral. O objetivo do trabalho foi desenvolver um novo protocolo de detecção, tipificação e quantificação de BPV através da qPCR. Foram desenhados cinco pares de primers, que possuem como alvo uma região conservada do genoma viral (gene L1) de diferentes BPVs. A seletividade dos primers foi testada in vitro e DNA extraído de células MDBK não infectadas foram utilizados como controle negativo. A técnica de qPCR permitiu detectar, tipificar e quantificar material viral dos BPVs 1, 2, 4, 5 e 6. O limiar relativo da detecção foi de 4fg de DNA, em torno de 30-40 cópias de DNA/μL. Dos cinco pares de primers produzidos, quatro apresentaram mesmo perfil térmico durante a qPCR (qPCRBPV2, 4, 5 e 6), permitindo em um único procedimento detectar e tipificar os quatro tipos virais. A distinção das amostras foi realizada através da análise de melting que permitiu tipificá-las. Através da metodologia desenvolvida foi observado que em lesões cutâneas de bovinos infectados com BPV a carga viral não se mostrou inferior a 1000 cópias/μL, enquanto que a técnica permite quantificar até um limiar de 40 copias de DNA/μl. Este trabalho possui relevância para validação de qPCR como diagnóstico da papilomatose bovina e particular importância quando aplicado em estudos da infecção pelo BPV e no monitoramento por veterinários da eficácia das futuras vacinas.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T14:58:09Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Thays Almeida.pdf: 1586385 bytes, checksum: 532dc98dd16a7bf1c4fdc0f60eb9fb91 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T14:58:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Thays Almeida.pdf: 1586385 bytes, checksum: 532dc98dd16a7bf1c4fdc0f60eb9fb91 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / CAPES; CNPq / As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias e, no Brasil, a Leishmania (V.) braziliensis é a espécie de maior incidência para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Em todas as suas formas clínicas, a resposta imune é dependente de células T, por isso, torna-se importante compreender os mecanismos imunológicos responsáveis pela formação, progressão e cura da doença. O presente estudo teve como objetivo identificar, através da técnica PCR quantitativa em tempo real (qPCR), o perfil de expressão de mRNA para IFN- , TNF- , TGF- , IL-10 e IL-4 e da enzima iNOS em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com LTA após estimulação com os antígenos solúvel e insolúvel de L.(V.) braziliensis. Associou-se o perfil de expressão desses mediadores ao tamanho, tempo e número de lesões, além da resposta a intradermorreação de Montenegro (IDRM). Células de 27 pacientes e 6 controles foram incubadas por 24 horas na presença do mitógeno fitohemaglutinina (PHA) ou dos antígenos solúvel (AgSol) e insolúvel (AgIns) de L. (V.) braziliensis. A expressão de mRNA para as citocinas e para a iNOS foi avaliada por qPCR e as análises dos resultados foram feitas através do método Ct comparativo e pelos testes não-paramétricos Wilcoxon e Mann-Whitney. Em relação ao AgSol, foi verificada diferença significava da expressão de IFN- e TNF- em pacientes quando comparados aos controles. Quanto ao AgIns, houve expressão significativa das citocinas IFN- , TNF- e IL-4 em pacientes quando comparados aos controles. As citocinas IL-10 e TGF- foram expressas frente a todos os estímulos utilizados, não apresentando diferença significativa entre e intragrupos. Não houve expressão de iNOS com nenhum dos estímulos utilizados. Comparando os antígenos de L.(V.) braziliensis utilizados, foi observado maior expressão de IFN- e TNF- frente ao antígeno insolúvel do parasita. A partir desses dados, podemos sugerir que ambas frações antigênicas do parasita são capazes de induzir uma resposta imune específica em pacientes com LTA ativa. Além disso, os dados obtidos nesse estudo sugerem a existência de um perfil de resposta imune Th1 para o antígeno solúvel e um perfil de resposta imune Th1 e Th2 considerando o antígeno insolúvel do parasita. A expressão gênica significativa para as citocinas TNF- e IFN- , sugere que os pacientes tenham montado uma eficiente resposta imune contra o parasita e a presença da citocina IL-10 que eles estariam promovendo um mecanismo imunorregulatório sobre a forte resposta imune inflamatória exercida pelas citocinas Th1. Dentre os antígenos utilizados, pode-se sugerir que, devido a sua composição, o antígeno insolúvel seja mais imunogênico que o antígeno solúvel e que, por isso, essa molécula antigênica seja uma possível candidata a vacina e alvos para a imunoterapia. A ausência de expressão da iNOS pode ter sido devido a presença de TGF- , que estaria regulando negativamente a produção de NO e consequentemente de iNOS. Além disso, pode estar havendo um mecanismo auto-regulatório para evitar produção em excesso de NO. A existência do perfil Th1 e Th2 pode ser explicado pelo estágio de desenvolvimento da doença. Assim, pelo fato de a LTA apresentar uma resposta Th1 multifacetada torna-se necessário estudos complementares para verificar o papel de outros tipos celulares e citocinas na progressão e cura da doença.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:01:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3041_1.pdf: 4993752 bytes, checksum: bdcdb8274aa595e73c271ff840fec84d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O cultivo de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é de grande importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol, sendo o déficit hídrico um dos principais fatores limitantes do crescimento e produtividade desta cultura. A crescente demanda por biocombustíveis tem exigido o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar geneticamente melhoradas e mais eficientes no uso da água. A partir de dados SAGE de cana-de-açúcar previamente anotados, oriundos de bibliotecas de amostras de colmo de plantas cultivadas em campo, e contrastantes para época chuvosa ou seca, foram identificados in silico transcritos potencialmente associados a respostas ao estresse hídrico. Destes, vinte e um genes (incluídos três genes de referência) foram selecionados para análise de expressão gênica e validação via transcrição reversa seguida de PCR em temporeal (RT-qPCR) utilizando duas variedades de cana-de-açúcar contrastantes à resposta ao estresse hídrico, RB92579 (tolerante) e RB72454 (sensível). Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação sob dois tratamentos hídricos diferentes (seco e irrigado). Para cada gene, três réplicas biológicas foram executadas, sendo cada RT-qPCR realizada em triplicata. A especificidade e ausência de contaminação foram avaliadas pela curva de dissociação das PCRs e controles negativos, respectivamente. Para a normalização e processamento dos dados de RT-qPCR, foram utilizados três genes de referência sendo estes analisados quanto a estabilidade utilizando o software geNorm. Da coleção de 46.536 tags distintas analisadas em SAGE, 45,0% mostraram-se inibidas pela seca, 6,3% induzidos pela seca, e 48,7% não apresentaram variação de ratio significativa (0,5 < ratio < 2,0). Dos 21 transcritos selecionados para validação experimental como potencialmente responsivos ao estresse hídrico somente 15 e 12 genes foram monitorados via RT-qPCR em folha e raiz respectivamente. Essas análises resultaram que 2/3 dos genes estudados (Dhyn_98, ERD4, Sip, Dgt, MARK, Pox, Hd-zip, Hsp70, PPlase e DnaK) foram diferencialmente expressos sob seca (p<0,05), sendo que 40% e 33,3% deles apresentaram, nas variedades tolerante e sensível, respectivamente, a mesma tendência de expressão que aquela já descrita via SAGE para a espécie. Além disso, em função dos resultados de RT-qPCR, dois genes mais associados com a resposta de tolerância à seca foram selecionados para futura determinação de suas sequências nucleotídicas completas e construções gênicas. Os genes identificados para tolerância a seca poderão ser utilizados não só nos programas de melhoramento das principais culturas de importância econômica, mas também poderão ajudar a entender as redes gênicas envolvidas na tolerância das plantas ao estresse hídrico

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3634_1.pdf: 1182297 bytes, checksum: 555f62e24f992ab833cb18ef506968ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A levedura Dekkera bruxellensis foi identificada como principal contaminante dos processos de fermentação alcoólica em destilarias do Brasil, do Canadá e dos EUA. Contagens elevadas desta levedura podem resultar em diminuição da produtividade etanólica, com conseqüente prejuízo econômico. Recentemente, esta levedura teve seu genoma parcialmente seqüenciado e foram identificadas seqüências correspondentes a genes do metabolismo do nitrato. A presença de tais genes indica que D. bruxellensis possa usufruir deste composto como fonte de nitrogênio, ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, durante o processo fermentativo. Como estas leveduras competem no ambiente industrial, a presença de nitrato poderia ser um fator diferencial na adaptação de D. bruxellensis, visto que esta fonte pode estar presente no caldo de cana proveniente do processo de adubação da cana de açúcar. Assim, os objetivos deste trabalho foram analisar o perfil de expressão dos genes da via metabólica do nitrato de D. bruxellensis em meios laboratoriais e verificar se esta levedura expressa estes genes em caldo de cana industrial utilizando a técnica de PCR quantitativa (qPCR). As células de D. bruxellensis foram cultivadas em meios sintéticos contendo glicose como fonte de carbono na presença de amônia, de nitrato ou ambas as fontes. As células foram coletadas em pontos específicos para extração do RNA, síntese de cDNA e analise por qPCR utilizando o método 2-&#916;&#916;Ct para quantificação da expressão gênica. Como controle endógeno foi empregado o gene EFA1. Todos os quatro genes estudados apresentaram indução de sua expressão na presença de nitrato e foram sujeitos à repressão catabólica do nitrogênio quando a amônia estava presente no meio. Adicionalmente, a presença e o consumo de nitrato no caldo de cana foram investigados. Neste substrato, os genes apresentaram perfil de expressão diferente do observado nos meios YNB. O nitrato foi detectado no caldo de cana e seu consumo ao longo do tempo foi determinado. Este estudo comprova que os genes da assimilação do nitrato em D. bruxellensis são induzidos em presença deste composto e reprimidos na presença de amônia. As células de D. bruxellensis expressaram estes genes no caldo de cana. Entretanto, maiores estudos acerca da regulação da expressão dos genes desta via metabólica ainda são necessários para correlacionar esta expressão com a adaptação de D. bruxellensis no meio de fermentação alcoólica

Polymerase Chain Reaction (PCR) has a wide range of applications and usages in many disciplines of science. Some PCR failure can be attributed to the presence of inhibitors in the sample. Thirteen commonly encountered PCR inhibitors in forensic DNA analysis are investigated throughout this review. These inhibitors are humic substances, humin, humic acids, fulvic acids, hematin, hemoglobin, Immunoglobulin G, tannic acid, calcium, collagen, melanin, bile salts, and urea. PCR inhibitors either affect the amplification, known as amplification inhibitors, the fluorescent component, known as detection inhibitors, or a single inhibitor can produce effects through both mechanisms. In reviewing the current literature, three main methods to remove or mitigate PCR inhibition were identified; with the addition of an additive, using specialty coated magnetic beads, or using a spin column. This review discusses the advantages and disadvantages of each method and the success of each in regards to some of the inhibitors of interest.

Absolute quantitative PCR (qPCR) is a method that determines the concentration of DNA in a sample. Accurate, and reproducible quantification is required during forensic DNA processing since the results determine the volume of sample used during STR genotyping. If too little DNA is utilized allelic dropout can occur; if too much DNA is used an increase in the number of artifacts can result. In either case, sub-optimal DNA input-masses can lead to the misinterpretation of the evidentiary profile, by increasing the probability of drop in and/or drop out. Generally, the qPCR method used during forensic DNA processing employs a set of standards, which are run with the questioned samples and used to generate a standard curve. These data are then used to establish a linear equation that is subsequently utilized to estimate the concentration of DNA in the unknown sample. However, standard curves have been shown to be prone to systematic and random error effects that impact the accuracy of the concentration estimate. This study examines two alternative methods to determine the DNA concentration for unknown samples, and compares them to the currently accepted protocol of running new dilutions/standards with every assay. The two alternative methods are: 1) using a validated standard curve, and 2) using linear regression of efficiency. To examine the feasibility of using these two methods for forensic purposes, two samples were quantified, using qPCR, in quadruplicate over the course of three years and concentrations were calculated using all three methods. Effects that time, kit lot, and instrument calibration had on the concentrations was examined for both total human and Y-DNA. Specifically, methods were compared by examining variances in concentration over the three- year period, and contrasting these results with the variances obtained within runs. The method which resulted in the smallest changes in concentration over time was regarded as the most stable. Results show that of the three methods, the use of a validated curve resulted in less variation of DNA concentration between multiple runs. Further, the factor that had the largest impact on concentration variance was the calibration of the instrument. Based on these results, recommendations are provided.

The genus Caliciopsis contains several representatives of the ascomycetous fungi which produce cankers on conifers. They comprise an interesting group with respect to morphology, physiology, and host response but have received relatively little attention in the past. The biology of this fungus is not totally elucidated. This study is focused on the description of seasonal spore dispersal of Caliciopsis pinea Peck and its relation to meteorological conditions which is needed for more precise and effective control of the disease. For this experiment the plantation of Pinus radiata in Carcheri (Lastra a Signa, Florence, Italy) was chosen. This plantation had symptoms of infection. A rotating arm spore trap and a weather station were installed here to obtain data from May to November 2016. Air samples were evaluated by qPCR with a very low detection limit. It has been found that spore traps are suitable for capturing the spore of this pathogen even with a very low incidence of inoculum in the air. Results show the presence of C. pinea inoculum throughout the entire sampling period with the highest peak in October. There is also a significant influence of precipitation on spore production. This work can help to better understand the life cycle of this pathogen. It can also contribute to enhance the control of this fungus and the protection of hosts.

Climate change and thermal stress poses a problem for sustainable agriculture. Research in the adaptation and acclimation of plants to the elevated temperature is therefore one of the current scientific issues. Plants are exposed to different ambient temperatures during their life. The response to adverse temperatures includes a number of signalling pathways affecting development and growth processes in plants. Coordination of develomental processes under elevated temperature and other external factors is primarily controlled by plant hormones. Here effect of cytokinins on plant morphology, growth kinetics, gene expression and quanification in combination with increased temperature was observed. By determination of the hypocotyl growth during increased temperature, cytokinins were found to play important role in this process. Cytokinins were found to inhibit temperature induced hypocotyl growth and inversly seedlings treated with higher temperatutre showed decreased level of cytokinins which was confirmed on the level of marker gene expression and determination of levels of cytokinins.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The accelerated growth of algal blooms in water bodies has caused the increased occurrence of taste and odor (T&O) episodes worldwide. Even though T&O compounds have not been associated with adverse health effects, their presence can have extensive socio-economic impacts in contaminated waters. Eagle Creek Reservoir, a eutrophic water body, which supplies about 80% of Indianapolis drinking water, experiences frequent and sometimes severe odorous outbreaks. The terpenoid bacterial metabolites, 2-methylisoborneol (2-MIB) and geosmin, have been identified as the main compounds contributing to those T&O problems, which occur seasonally when the reservoir receives most of its water and nutrient loads from discharge events. In this study, ECR’s microbial community composition was assessed by a 16S next generation sequencing approach, confirming the presence of the major bacterial phyla of Cyanobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes, which are commonly found in freshwater environments. The relative abundance of Cyanobacteria, which are regarded as the main T&O producers in freshwater, followed the fluctuation of 2-MIB and geosmin concentrations closely. Mapping sequence analysis of a metagenomic dataset, successfully recovered the genes responsible for the synthesis of geosmin and 2-MIB, demonstrating the microbial ability for odorous compound production in ECR. Quantification of the geoA and MIBS genes in Cyanobacteria was achieved by the development and application of qPCR assays on water samples collected from the reservoir. A statistically significant positive correlation was found between MIBS gene quantity and MIB concentration for all sampling locations, implying that this assay could potentially be used as a tool for the early prediction of upcoming T&O episodes. The geoA gene detection assay, did not correlate well with geosmin concentrations, suggesting that even though the gene might be present, this does not necessarily mean that it is metabolically active.

Corn (Zea mays) is frequently infected by a soil fungal pathogen Aspergillus flavus. The fungus produces aflatoxins, which cause liver cancer. Maize inbred lines that are resistant to infection by A. flavus have been developed, and these inbred lines provide excellent models for studying molecular mechanisms of maize resistance to the fungus. MicroRNA-like RNAs (milRNAs) recently identified in A. flavus had been found to be correlated with aflatoxin production conditions, suggesting that the milRNAs might play a role in the regulation of aflatoxin production. In this research, small RNAs were isolated from kernels of maize (resistant Mp719 and susceptible Va35) inoculated with A. flavus NRRL 3357 (aflatoxigenic) and NRRL 21882 (nonaflatoxigenic) and then subjected to RNA sequencing. Sequencing had identified 69 A. flavus milRNAs and 691 Z. mays miRNAs. The differential expression of some maize miRNAs revealed their potential role in response to inoculation, A. flavus growth, and aflatoxin production.