Softwood is the predominant form of land plant biomass in the Northern hemisphere, and is among the most recalcitrant biomass resources to bioprocess technologies. The white rot fungus Phanerochaete carnosa has been isolated almost exclusively from softwoods, while most other known white-rot species, including Phanerochaete chrysosporium, were mainly isolated from hardwoods. Accordingly, it is anticipated that P. carnosa encodes a distinct set of enzymes and proteins that promote softwood decomposition. To elucidate the genetic basis of softwood bioconversion by P. carnosa, its genome was sequenced and transcriptomes were evaluated after growth on wood compared to liquid medium. Results indicate that P. carnosa differs from P. chrysosporium in the number and expression levels of genes that encode lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP), two enzymes that modify lignin present in wood. P. carnosa has more genes for MnP with higher expression levels than LiP, while the reverse has been observed for P. chrysosporium. The abundances of transcripts predicted to encode lignocellulose-modifying enzymes were then measured over the course of P. carnosa cultivation on four wood species. Profiles were consistent with decay of lignin before carbohydrates. Transcripts encoding MnP were highly abundant, and those encoding MnP and LiP featured significant substrate-dependent response. Since differences in modes of lignin degradation catalyzed by MnP and LiP could affect the ability of each to degrade lignin from different types of wood, their activity on various hardwoods and softwoods were tested. Results suggest that MnP degrades softwood lignin more effectively than hardwood lignin, consistent with high levels of this enzyme in P. carnosa.

The present study investigated the expression profiles of nine genes involved in immune defense of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei and their responses to oral administration of beta-1,3-glucan. The nine immune related genes were beta-glucan binding protein-high density lipoprotein (BGBP-HDL), lipopolysaccharide/beta-glucan binding protein (LGBP), hemocyanin, prophenoloxidase (proPO), transglutaminase (TGase), penaeidin-3 (PEN-3), crustin, cytosolic manganese superoxide dismutase (cMnSOD), and lysozyme. A series of experiments were carried out in the study including: (1) cDNA cloning and characterization of proPO and LGBP; (2) tissue mRNA expressions of the nine genes in adult shrimp; (3) expression and localization of the nine genes during larval and postlarval ontogenic development; (4) the effects of dietary beta-1,3-glucan on the expression of the nine genes. The cDNA cloning study showed that the proPO cDNA contains an open reading frame of 2061 bp and encodes a 686 amino-acid peptide. The protein sequence of the proPO has a similarity of 85% with those of Penaeus monodon and P. semisulcatus and has an identity of between 58 and 77% with other crustaceans. Northern blot analysis revealed that proPO was constitutively expressed mainly in hemocytes. Its transcripts were observed in hemocytes and many other tissues when detected with RT-PCR. The results of in situ hybridizations showed that the hemocytes that infiltrated in tissues were responsible for the positive signals. The LGBP cDNA contains an open reading frame of 1104 bp and encodes a 367 amino-acid protein with a 17 a. a. signal peptide. The protein sequence of the LGBP has a similarity of 97% with LGBP of L. stylirostris, >90% identity with BGBP of P. monodon and LGBP of Fenneropenaeus chinensis and has an identity of between 63 and 86% with other crustaceans. Northern blot analysis revealed that LGBP was constitutively expressed mainly in hepatopancreas. The results of in situ hybridizations showed that the hepatopancreatic F cells might be the major cell type for LGBP production. Using the complete cDNAs of proPO and LGBP and partial fragments of the other seven genes, their tissue expressions were analyzed by conventional RT-PCR, quantitative real time PCR (qPCR) and in situ hybridization. The results demonstrated that BGBP-HDL, LGBP and hemocyanin were mainly expressed in the hepatopancreas and their expressions levels were about 10 to 30% those of

The biogeographic distribution of organisms is determined by physiological characteristics that enable a population to persist in a specific location. Global climate change effects are anticipated to increase the physiological stress experienced by organisms. Consequently, it is important to understand physiological responses to environmental stress and the mechanisms used by animals to cope with variable conditions. I investigated the physiological response to environmental stress in two species of mussel from New Zealand, Perna canaliculus and Mytilus galloprovincialis, using quantitative PCR and ecological field experiments. A series of laboratory and field experiments were done to manipulate stress levels and the expression levels of three heat shock protein genes (hsp24, hsp70, hsp90) were measured. A transcription regulatory gene (elf2) and a cell cycle regulatory gene (tis11d) were also measured. The dynamics of stress response gene expression in response to acute stress and gene expression changes in the natural population due to varying forms of environmental stress were tested. Between-zone translocations of different sized M. galloprovincialis and P. canaliculus were done at two sites in both east and west regions of the South Island of New Zealand. Site was found to be the most important factor in stress response. Apparent low food and high exposure stress interacted to create the particularly elevated stress response at the Timaru site. The adaptive ability of mussels transplanted between sites with varying environmental conditions was also tested. Results suggest that acclimation may be limited under stressful conditions. Furthermore, I found that P. canaliculus, the predominantly low-zone species, had a lower stress response than M. galloprovincialis, which was contradictory to predictions. The investigations described in this thesis suggest that interactive effects of abiotic stress and food limitations are particularly challenging for animals. With the severity of climate change scenarios predicted, changes in water quality and aerial and seawater temperature suggest mussel populations are likely to be negatively affected in the future. This work also illustrates the great potential to utilise molecular techniques for analysis of physiological processes of non-model organisms in a real-world setting.

Softwood is the predominant form of land plant biomass in the Northern hemisphere, and is among the most recalcitrant biomass resources to bioprocess technologies. The white rot fungus Phanerochaete carnosa has been isolated almost exclusively from softwoods, while most other known white-rot species, including Phanerochaete chrysosporium, were mainly isolated from hardwoods. Accordingly, it is anticipated that P. carnosa encodes a distinct set of enzymes and proteins that promote softwood decomposition. To elucidate the genetic basis of softwood bioconversion by P. carnosa, its genome was sequenced and transcriptomes were evaluated after growth on wood compared to liquid medium. Results indicate that P. carnosa differs from P. chrysosporium in the number and expression levels of genes that encode lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP), two enzymes that modify lignin present in wood. P. carnosa has more genes for MnP with higher expression levels than LiP, while the reverse has been observed for P. chrysosporium. The abundances of transcripts predicted to encode lignocellulose-modifying enzymes were then measured over the course of P. carnosa cultivation on four wood species. Profiles were consistent with decay of lignin before carbohydrates. Transcripts encoding MnP were highly abundant, and those encoding MnP and LiP featured significant substrate-dependent response. Since differences in modes of lignin degradation catalyzed by MnP and LiP could affect the ability of each to degrade lignin from different types of wood, their activity on various hardwoods and softwoods were tested. Results suggest that MnP degrades softwood lignin more effectively than hardwood lignin, consistent with high levels of this enzyme in P. carnosa.

Os cofatores de ferro-enxofre [Fe-S] estão entre os mais versáteis e antigos cofatores enzimáticos encontrados na natureza. As células têm explorado as propriedades eletrônicas e estruturais destes cofatores inorgânicos para uma ampla variedade de atividades incluindo a transferência de elétrons, a catálise e a ativação de substratos. Um grande número de proteínas está envolvido na biogênese dos cofatores [Fe-S], e este processo pode ser dividido em três etapas principais: (i) formação do enxofre elementar, (ii) montagem do cofator [Fe-S], e (iii) inserção do cofator em apoproteínas. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a biossíntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Devido a esse fato, foi realizada uma análise transcricional dos genes codificados pelo sistema ISC de biossíntese de cofatores [Fe-S] NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis por meio de PCR quantitativa (RT-qPCR), após plântulas desta espécie serem submetidas ao tratamento de frio. O gene NFS1 teve sua expressão reprimida nas primeiras 48 horas de tratamento, porém, após esse período observa-se um aumento da expressão gênica em relação à condição controle. O genes ISU1 e ISA1 apresentaram maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, diminuindo drasticamente logo após este período. Foi verificado um aumento na quantidade relativa de Fe e S nos nas plântulas submetidas ao tratamento de frio, indicando um possível aumento na quantidade de cofatores [Fe-S] requeridos para o reestabelecimento da homeostase celular. As bactérias, por sua vez, desenvolveram pelo menos três sistemas de biossíntese, altamente conservados, que estão envolvidos na formação dos cofatores [Fe-S], sendo estes NIF, ISC e SUF. Em muitas proteobactérias, a regulação da produção de cofatores [Fe-S] pelos sistemas ISC e SUF é controlada por uma única proteína, IscR, pertencente à família de reguladores Rrf2. A proteína IscR possui um domínio de ligação ao DNA na região N-terminal e um segundo domínio de ligação de cofatores com três resíduos de cisteínas (Cys) altamente conservados. A ligação de um cofator do tipo [2Fe-2S] reprime a transcrição do seu próprio promotor in vitro. O genoma de Azotobacter vinelandii não inclui um sistema SUF completo e, portanto, permite o estudo dos efeitos da regulação de IscR não relacionada a SUF. No presente trabalho, objetivamos analisar a expressão do operon isc em linhagens selvagens e mutantes para IscR de A. vinelandii por meio das técnicas de sequenciamento do transcritoma e RT-qPCR. As substituições das Cys92, Cys104, His107 e a deleção de 120 pb da região codificadora do segundo domínio de IscR levaram à indução de um aumento da expressão de todo o operon isc. Notou-se também uma diferença fenotípica clara no tamanho das colônias portadoras das substituições de Cys e His, sendo estas menores em relação à linhagem selvagem. As substituições das Cys98 e Cys111, ou ainda a dupla substituição Cys98/111 não levaram a alteração da expressão do operon. A ligação ou não do cofator [Fe-S] é, portanto, responsável pela regulação do operon isc em A. vinelandii, bem como, de outros operons codificadores de proteínas envolvidas em cadeias tranportadoras de elétrons. / The iron-sulfur clusters [Fe-S] are among the oldest and most versatile enzyme cofactors found in nature. The cells have explored the structural and electronic properties of these inorganic clusters for a wide variety of activities including electron transfer, catalysis and activation of substrates. A large number of proteins is involved in the biogenesis of the [Fe-S] clusters, and this process can be divided into three main steps: (i) formation of elemental sulfur, (ii) assembly of the [Fe-S] cluster and (iii) insertion into apoproteins. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S protein, and in these organisms the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors affect the development of plants, among them, the low temperature is a limiting factor to productivity and geographical distribution of plants, including Eucalyptus grandis, a specie with great economic importance. Due to this fact, we performed a transcriptional analysis by quantitative PCR (RT-qPCR) of the genes encoded by the E. grandis [Fe-S] cluster ISC system NFS1, ISA1 and ISU1 after seedlings were submitted to the chilling treatment. The NFS1 gene expression is repressed in the first 48 hours of treatment, but after this period there was an increase in gene expression relating to the control condition. The genes ISU1 and ISA1 showed higher gene expression in the first two hours of treatment, followed by a sharp decrease. There was an increase in the relative amount of Fe and S in the seedlings subjected to cold treatment, indicating a possible increase in the amount of [Fe-S] clusters, required for the reestablishment of cellular homeostasis. Bacteria have developed at least three synthesis systems, highly conserved, which are involved in the formation of Fe-S proteins, NIF, ISC and SUF. In many proteobacteria, the regulation of clusters production by ISC and SUF is controlled by a single protein, IscR, belonging to the Rrf2 regulators family. The protein IscR has a DNA binding site at the N-terminal domain and second cofactors binding domain with three cysteine residues (Cys) highly conserved. The binding of a [2Fe-2S] cluster represses the transcription of its own promoter in vitro. The genome of Azotobacter vinelandii does not include a full SUF system and thus permits the study of the effects of IscR regulation unrelated to SUF. In this study, the aim was to analyze the expression of isc operon in wild type and mutant strains of A. vinelandii IscR by the techniques of the transcriptome sequencing and qRT-PCR. The replacement of Cys92, Cys104, His107 and a deletion of 120 bp region encoding the second IscR domain led to an increased expression of the whole isc operon. It also showed a clear phenotypic difference in colonies size in the strains carrying the substitutions of His and Cys, it was smaller compared to the wild type strain. The replacement of Cys98 and Cys111, or the double substitution Cys98/111 not led to an altered operon expression. The [Fe-S] cluster binding or not, is therefore responsible for the regulation of the isc operon in A. vinelandii as well as of other operons encoding proteins involved in electron tranport chains.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-17Bitstream added on 2014-06-13T18:56:06Z : No. of bitstreams: 1 davolos_cc_me_jabo.pdf: 358910 bytes, checksum: 020446e7d045944b95dfcb371b8ab71e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bacillus thuringiensis é entomopatogênica muito utilizada no controle de insetos-praga e a predição de sua atividade tóxica é realizada por PCR na identificação de genes cry. Assim sendo, este trabalho objetivou elaborar novos oligonucleotídeos iniciadores para a detecção das subclasses cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca, cry1Ea e cry1Fa, estudar o potencial de controle de 31 isolados de B. thuringiensis à duas populações de Spodoptera frugiperda por meio de bioensaios e analisar a taxa de expressão dos genes presentes nos isolados por qPCR em tempo real. Um par de oligonucleotídeo iniciador foi elaborado para cada subclasse e dentre os isolados testados 6,5% e 48,5% apresentaram os genes cry1Ab e cry1Ac, respectivamente, nenhum dos isolados apresentou os genes cry1Ca, cry1Ea e cry1Fa. Dentre os 31 isolados, 13 apresentaram mortalidade acima de 75% para as larvas da população de campo e apenas nove para a população de laboratório, mostrando que os isolados controlaram com maior eficiência as larvas da população de campo. A presença dos genes cry1Ab e cry1Ac conjuntamente foi associada à elevado potencial de controle às larvas da população de campo e baixo às larvas da população de laboratório. A expressão do gene cry1Ab, não foi constatada em nenhum dos isolados nas condições analisadas e, para o gene cry1Ac, todos os isolados apresentaram taxa de expressão. Os resultados de expressão foram associados ao potencial de controle das larvas de S. frugiperda das populações testadas, sendo que os elevados níveis de expressão do gene cry1Ac foram associados diretamente a elevado potencial de controle da população de laboratório. / Bacillus thuringiensis is entomopathogenic used for insect control and the prediction of the toxic activity is performed by PCR on the identification of cry genes. Thus, the aim of this research was develop news primers for detection the subclasses cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca, cry1Ea and cry1Fa, study the potential control of 31 isolates of B. thuringiensis against two Spodoptera frugiperda populations by bioassays and analyze the rate of gene expression present on the isolates by real-time qPCR. A pair of primer was prepared for each subclass, the genes cry1Ab and cry1Ac were found in 6.5% and 48.5% of the isolates, respectively, and the genes cry1Ca, cry1Ea and cry1Fa were not detected on the isolates. Among the 31 isolates, 13 showed over 75% mortality for the larvae of field population and only nine isolates to the laboratory population, showing that the isolates controlled more efficiently the larvae of the field population. The presence of cry1Ab and cry1Ac genes were correlated to high levels of insecticidal activity for the larvae of field population and low levels control to the laboratory population. The expression of cry1Ab was not found in any of the isolates analyzed and the rates expression of cry1Ac gene was detected in all isolates. The results of gene expression were associated with the potential control to S. frugiperda, and the high levels of cry1Ac gene expression were linked directly to high levels of insecticidal activity for the laboratory population.

Resumo: Bacillus thuringiensis é entomopatogênica muito utilizada no controle de insetos-praga e a predição de sua atividade tóxica é realizada por PCR na identificação de genes cry. Assim sendo, este trabalho objetivou elaborar novos oligonucleotídeos iniciadores para a detecção das subclasses cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca, cry1Ea e cry1Fa, estudar o potencial de controle de 31 isolados de B. thuringiensis à duas populações de Spodoptera frugiperda por meio de bioensaios e analisar a taxa de expressão dos genes presentes nos isolados por qPCR em tempo real. Um par de oligonucleotídeo iniciador foi elaborado para cada subclasse e dentre os isolados testados 6,5% e 48,5% apresentaram os genes cry1Ab e cry1Ac, respectivamente, nenhum dos isolados apresentou os genes cry1Ca, cry1Ea e cry1Fa. Dentre os 31 isolados, 13 apresentaram mortalidade acima de 75% para as larvas da população de campo e apenas nove para a população de laboratório, mostrando que os isolados controlaram com maior eficiência as larvas da população de campo. A presença dos genes cry1Ab e cry1Ac conjuntamente foi associada à elevado potencial de controle às larvas da população de campo e baixo às larvas da população de laboratório. A expressão do gene cry1Ab, não foi constatada em nenhum dos isolados nas condições analisadas e, para o gene cry1Ac, todos os isolados apresentaram taxa de expressão. Os resultados de expressão foram associados ao potencial de controle das larvas de S. frugiperda das populações testadas, sendo que os elevados níveis de expressão do gene cry1Ac foram associados diretamente a elevado potencial de controle da população de laboratório. / Abstract: Bacillus thuringiensis is entomopathogenic used for insect control and the prediction of the toxic activity is performed by PCR on the identification of cry genes. Thus, the aim of this research was develop news primers for detection the subclasses cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca, cry1Ea and cry1Fa, study the potential control of 31 isolates of B. thuringiensis against two Spodoptera frugiperda populations by bioassays and analyze the rate of gene expression present on the isolates by real-time qPCR. A pair of primer was prepared for each subclass, the genes cry1Ab and cry1Ac were found in 6.5% and 48.5% of the isolates, respectively, and the genes cry1Ca, cry1Ea and cry1Fa were not detected on the isolates. Among the 31 isolates, 13 showed over 75% mortality for the larvae of field population and only nine isolates to the laboratory population, showing that the isolates controlled more efficiently the larvae of the field population. The presence of cry1Ab and cry1Ac genes were correlated to high levels of insecticidal activity for the larvae of field population and low levels control to the laboratory population. The expression of cry1Ab was not found in any of the isolates analyzed and the rates expression of cry1Ac gene was detected in all isolates. The results of gene expression were associated with the potential control to S. frugiperda, and the high levels of cry1Ac gene expression were linked directly to high levels of insecticidal activity for the laboratory population. / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Banca: Celso Omoto / Mestre

Os cofatores de ferro-enxofre [Fe-S] estão entre os mais versáteis e antigos cofatores enzimáticos encontrados na natureza. As células têm explorado as propriedades eletrônicas e estruturais destes cofatores inorgânicos para uma ampla variedade de atividades incluindo a transferência de elétrons, a catálise e a ativação de substratos. Um grande número de proteínas está envolvido na biogênese dos cofatores [Fe-S], e este processo pode ser dividido em três etapas principais: (i) formação do enxofre elementar, (ii) montagem do cofator [Fe-S], e (iii) inserção do cofator em apoproteínas. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a biossíntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Devido a esse fato, foi realizada uma análise transcricional dos genes codificados pelo sistema ISC de biossíntese de cofatores [Fe-S] NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis por meio de PCR quantitativa (RT-qPCR), após plântulas desta espécie serem submetidas ao tratamento de frio. O gene NFS1 teve sua expressão reprimida nas primeiras 48 horas de tratamento, porém, após esse período observa-se um aumento da expressão gênica em relação à condição controle. O genes ISU1 e ISA1 apresentaram maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, diminuindo drasticamente logo após este período. Foi verificado um aumento na quantidade relativa de Fe e S nos nas plântulas submetidas ao tratamento de frio, indicando um possível aumento na quantidade de cofatores [Fe-S] requeridos para o reestabelecimento da homeostase celular. As bactérias, por sua vez, desenvolveram pelo menos três sistemas de biossíntese, altamente conservados, que estão envolvidos na formação dos cofatores [Fe-S], sendo estes NIF, ISC e SUF. Em muitas proteobactérias, a regulação da produção de cofatores [Fe-S] pelos sistemas ISC e SUF é controlada por uma única proteína, IscR, pertencente à família de reguladores Rrf2. A proteína IscR possui um domínio de ligação ao DNA na região N-terminal e um segundo domínio de ligação de cofatores com três resíduos de cisteínas (Cys) altamente conservados. A ligação de um cofator do tipo [2Fe-2S] reprime a transcrição do seu próprio promotor in vitro. O genoma de Azotobacter vinelandii não inclui um sistema SUF completo e, portanto, permite o estudo dos efeitos da regulação de IscR não relacionada a SUF. No presente trabalho, objetivamos analisar a expressão do operon isc em linhagens selvagens e mutantes para IscR de A. vinelandii por meio das técnicas de sequenciamento do transcritoma e RT-qPCR. As substituições das Cys92, Cys104, His107 e a deleção de 120 pb da região codificadora do segundo domínio de IscR levaram à indução de um aumento da expressão de todo o operon isc. Notou-se também uma diferença fenotípica clara no tamanho das colônias portadoras das substituições de Cys e His, sendo estas menores em relação à linhagem selvagem. As substituições das Cys98 e Cys111, ou ainda a dupla substituição Cys98/111 não levaram a alteração da expressão do operon. A ligação ou não do cofator [Fe-S] é, portanto, responsável pela regulação do operon isc em A. vinelandii, bem como, de outros operons codificadores de proteínas envolvidas em cadeias tranportadoras de elétrons. / The iron-sulfur clusters [Fe-S] are among the oldest and most versatile enzyme cofactors found in nature. The cells have explored the structural and electronic properties of these inorganic clusters for a wide variety of activities including electron transfer, catalysis and activation of substrates. A large number of proteins is involved in the biogenesis of the [Fe-S] clusters, and this process can be divided into three main steps: (i) formation of elemental sulfur, (ii) assembly of the [Fe-S] cluster and (iii) insertion into apoproteins. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S protein, and in these organisms the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors affect the development of plants, among them, the low temperature is a limiting factor to productivity and geographical distribution of plants, including Eucalyptus grandis, a specie with great economic importance. Due to this fact, we performed a transcriptional analysis by quantitative PCR (RT-qPCR) of the genes encoded by the E. grandis [Fe-S] cluster ISC system NFS1, ISA1 and ISU1 after seedlings were submitted to the chilling treatment. The NFS1 gene expression is repressed in the first 48 hours of treatment, but after this period there was an increase in gene expression relating to the control condition. The genes ISU1 and ISA1 showed higher gene expression in the first two hours of treatment, followed by a sharp decrease. There was an increase in the relative amount of Fe and S in the seedlings subjected to cold treatment, indicating a possible increase in the amount of [Fe-S] clusters, required for the reestablishment of cellular homeostasis. Bacteria have developed at least three synthesis systems, highly conserved, which are involved in the formation of Fe-S proteins, NIF, ISC and SUF. In many proteobacteria, the regulation of clusters production by ISC and SUF is controlled by a single protein, IscR, belonging to the Rrf2 regulators family. The protein IscR has a DNA binding site at the N-terminal domain and second cofactors binding domain with three cysteine residues (Cys) highly conserved. The binding of a [2Fe-2S] cluster represses the transcription of its own promoter in vitro. The genome of Azotobacter vinelandii does not include a full SUF system and thus permits the study of the effects of IscR regulation unrelated to SUF. In this study, the aim was to analyze the expression of isc operon in wild type and mutant strains of A. vinelandii IscR by the techniques of the transcriptome sequencing and qRT-PCR. The replacement of Cys92, Cys104, His107 and a deletion of 120 bp region encoding the second IscR domain led to an increased expression of the whole isc operon. It also showed a clear phenotypic difference in colonies size in the strains carrying the substitutions of His and Cys, it was smaller compared to the wild type strain. The replacement of Cys98 and Cys111, or the double substitution Cys98/111 not led to an altered operon expression. The [Fe-S] cluster binding or not, is therefore responsible for the regulation of the isc operon in A. vinelandii as well as of other operons encoding proteins involved in electron tranport chains.

Os cofatores de ferro-enxofre [Fe-S] estão entre os mais versáteis e antigos cofatores enzimáticos encontrados na natureza. As células têm explorado as propriedades eletrônicas e estruturais destes cofatores inorgânicos para uma ampla variedade de atividades incluindo a transferência de elétrons, a catálise e a ativação de substratos. Um grande número de proteínas está envolvido na biogênese dos cofatores [Fe-S], e este processo pode ser dividido em três etapas principais: (i) formação do enxofre elementar, (ii) montagem do cofator [Fe-S], e (iii) inserção do cofator em apoproteínas. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a biossíntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Devido a esse fato, foi realizada uma análise transcricional dos genes codificados pelo sistema ISC de biossíntese de cofatores [Fe-S] NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis por meio de PCR quantitativa (RT-qPCR), após plântulas desta espécie serem submetidas ao tratamento de frio. O gene NFS1 teve sua expressão reprimida nas primeiras 48 horas de tratamento, porém, após esse período observa-se um aumento da expressão gênica em relação à condição controle. O genes ISU1 e ISA1 apresentaram maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, diminuindo drasticamente logo após este período. Foi verificado um aumento na quantidade relativa de Fe e S nos nas plântulas submetidas ao tratamento de frio, indicando um possível aumento na quantidade de cofatores [Fe-S] requeridos para o reestabelecimento da homeostase celular. As bactérias, por sua vez, desenvolveram pelo menos três sistemas de biossíntese, altamente conservados, que estão envolvidos na formação dos cofatores [Fe-S], sendo estes NIF, ISC e SUF. Em muitas proteobactérias, a regulação da produção de cofatores [Fe-S] pelos sistemas ISC e SUF é controlada por uma única proteína, IscR, pertencente à família de reguladores Rrf2. A proteína IscR possui um domínio de ligação ao DNA na região N-terminal e um segundo domínio de ligação de cofatores com três resíduos de cisteínas (Cys) altamente conservados. A ligação de um cofator do tipo [2Fe-2S] reprime a transcrição do seu próprio promotor in vitro. O genoma de Azotobacter vinelandii não inclui um sistema SUF completo e, portanto, permite o estudo dos efeitos da regulação de IscR não relacionada a SUF. No presente trabalho, objetivamos analisar a expressão do operon isc em linhagens selvagens e mutantes para IscR de A. vinelandii por meio das técnicas de sequenciamento do transcritoma e RT-qPCR. As substituições das Cys92, Cys104, His107 e a deleção de 120 pb da região codificadora do segundo domínio de IscR levaram à indução de um aumento da expressão de todo o operon isc. Notou-se também uma diferença fenotípica clara no tamanho das colônias portadoras das substituições de Cys e His, sendo estas menores em relação à linhagem selvagem. As substituições das Cys98 e Cys111, ou ainda a dupla substituição Cys98/111 não levaram a alteração da expressão do operon. A ligação ou não do cofator [Fe-S] é, portanto, responsável pela regulação do operon isc em A. vinelandii, bem como, de outros operons codificadores de proteínas envolvidas em cadeias tranportadoras de elétrons. / The iron-sulfur clusters [Fe-S] are among the oldest and most versatile enzyme cofactors found in nature. The cells have explored the structural and electronic properties of these inorganic clusters for a wide variety of activities including electron transfer, catalysis and activation of substrates. A large number of proteins is involved in the biogenesis of the [Fe-S] clusters, and this process can be divided into three main steps: (i) formation of elemental sulfur, (ii) assembly of the [Fe-S] cluster and (iii) insertion into apoproteins. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S protein, and in these organisms the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors affect the development of plants, among them, the low temperature is a limiting factor to productivity and geographical distribution of plants, including Eucalyptus grandis, a specie with great economic importance. Due to this fact, we performed a transcriptional analysis by quantitative PCR (RT-qPCR) of the genes encoded by the E. grandis [Fe-S] cluster ISC system NFS1, ISA1 and ISU1 after seedlings were submitted to the chilling treatment. The NFS1 gene expression is repressed in the first 48 hours of treatment, but after this period there was an increase in gene expression relating to the control condition. The genes ISU1 and ISA1 showed higher gene expression in the first two hours of treatment, followed by a sharp decrease. There was an increase in the relative amount of Fe and S in the seedlings subjected to cold treatment, indicating a possible increase in the amount of [Fe-S] clusters, required for the reestablishment of cellular homeostasis. Bacteria have developed at least three synthesis systems, highly conserved, which are involved in the formation of Fe-S proteins, NIF, ISC and SUF. In many proteobacteria, the regulation of clusters production by ISC and SUF is controlled by a single protein, IscR, belonging to the Rrf2 regulators family. The protein IscR has a DNA binding site at the N-terminal domain and second cofactors binding domain with three cysteine residues (Cys) highly conserved. The binding of a [2Fe-2S] cluster represses the transcription of its own promoter in vitro. The genome of Azotobacter vinelandii does not include a full SUF system and thus permits the study of the effects of IscR regulation unrelated to SUF. In this study, the aim was to analyze the expression of isc operon in wild type and mutant strains of A. vinelandii IscR by the techniques of the transcriptome sequencing and qRT-PCR. The replacement of Cys92, Cys104, His107 and a deletion of 120 bp region encoding the second IscR domain led to an increased expression of the whole isc operon. It also showed a clear phenotypic difference in colonies size in the strains carrying the substitutions of His and Cys, it was smaller compared to the wild type strain. The replacement of Cys98 and Cys111, or the double substitution Cys98/111 not led to an altered operon expression. The [Fe-S] cluster binding or not, is therefore responsible for the regulation of the isc operon in A. vinelandii as well as of other operons encoding proteins involved in electron tranport chains.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-17T20:40:40Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Camilla Martins de Oliveira - 2015.pdf: 2722272 bytes, checksum: c1b127a024727131109290202bf7f846 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-18T12:47:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Camilla Martins de Oliveira - 2015.pdf: 2722272 bytes, checksum: c1b127a024727131109290202bf7f846 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T12:47:02Z (GMT). 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The DNA extraction was made from 100 individual nematodes by the methods: CTAB, Phenol: Chloroform and commercial kit (PureLink® Genomic ADN Kit, Invitrogen). In the comparative analysis using the three methods the CTAB method and commercial kit obtained similar Ct values. The CTAB was the best method of extraction with less variation among the replications and showed higher linearity of the standard curve in comparison with the other methods tested. It was possible to quantify nematodes in the samples based on the intervals of the Ct values established from different numbers of nematodes (1, 10, 25, 100, 250, 500 and 750). This study demonstrated that qPCR technique is a sensitive and reliable alternative for the quantification of M. incognita that may help laboratories of diagnose and field survey. Twenty-six populations of the root-knot nematode (Meloidogyne spp.) from five locations of the state of Bahia, five from the state of Mato Grosso, four from the state of Goiás and one from the state of Minas Gerais, were characterized based on morphology of perineal cut, biochemical analysis through esterase profile and molecular analysis with specific primers. Identification of nematodes in the samples using the analysis of perineal cut, esterase profile and molecular analysis was possible, but with some variations in the perineal patterns and some atypical profiles of esterase. In the analyses of esterase profiles were found 69.23% of M. javanica with esterase profiles J3 and J2, and 30.77% of M. incognita with esterase profile I1. There was a higher occurrence of M. javanica in the areas cultivated with soybeans. Molecular analysis showed to be practical and accurate. / Nematoides causam perdas em plantas em todo o mundo, as quais podem ser traduzidas em muitos prejuízos econômicos. Os nematoides das galhas (Meloidogyne spp.) são os mais comuns e destrutivos dentro deste grupo de patógenos. Para conseguir implantar um método eficiente de manejo de fitonematoides há uma necessidade de identificação das espécies e quantificação precisa e confiável. O objetivo deste trabalho foi a otimização de um ensaio baseado em PCR em tempo real para detectar e quantificar M. incognita. Para isto diferentes métodos de extração de DNA e sua eficiência foram comparados. A extração de DNA foi feita a partir de 100 nematoides pelos métodos do CTAB, Fenol: Clorofórmio e KIT comercial (PureLink® Genomic DNA Kits, Invitrogen). Na análise comparativa destes três métodos de extração de DNA observou-se que o método CTAB e o utilizando o Kit comercial obtiveram igual eficiência, dados pelos valores próximos Ct (cycle threshold). O melhor método de extração foi considerado o CTAB, apresentando menor variação entre as diferentes amostras biológicas utilizadas como repetições e demonstrando maior linearidade na curva-padrão em comparação com os demais métodos testados. Foi possível estabelecer um parâmetro para a quantificação de nematoides nas amostras baseado em faixas de valores de Ct, estabelecidas a partir de diferentes números de indivíduos (1, 10, 25, 100, 250, 500 e 750). Este estudo demonstrou que a técnica de qPCR é uma alternativa sensível e confiável para a quantificação de M. incognita, para auxiliar laboratórios de diagnóstico e o monitoramento no campo desses nematoides. Vinte e seis populações do nematoide das galhas (Meloidogyne spp.), provenientes de cinco municípios do Estado da Bahia, cinco municípios do Estado do Mato Grosso, quatro municípios do Estado de Goiás e um município do Estado de Minas Gerais, foram caracterizados com base em: morfologia do corte perineal, análise bioquímica por meio de perfil de esterase e análise molecular com iniciadores específicos. Baseado nestes parâmetros foi possível a identificação das amostras, porém foram encontradas algumas variações nos padrões perineais e perfis atípicos nos perfis de esterase. Nas análises dos perfis de esterase foram encontradas 69,23% de M. javanica com perfis de esterase J3 e J2, e 30,77% de M. incognita com perfil de esterase I1. Verificou-se a maior ocorrência de M. javanica, nas áreas coletadas cultivadas com soja. A análise molecular se mostrou prática e precisa.