Diversos são os fatores que estão envolvidos no controle da maturação oocitária e na qualidade e competência do oócito. A melatonina (MEL) é um hormônio que apresenta diversas funções, como atividade antioxidante e antiapoptótica, além de influenciar diferentes vias de sinalização celular. Ainda há poucos estudos sobre o papel da MEL na maturação de oócitos e o camundongo, por sua rápida reprodução e menor custo de manutenção, é um excelente modelo amplamente utilizado para estudos in vitro e, particularmente in vivo. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da MEL sobre a maturação in vivo e in vitro e sua possível ação como protetor celular (antioxidante e/ou antiapoptótico) de complexos cumulus-oócitos (CCOs) murinos. No experimento 1, os animais receberam injeções de MEL nas concentrações de 0 (controle), 10 e 20 mg/kg/i.p./dia por 4 dias. Os CCOs foram maturados in vivo e recuperados 17 horas após a última injeção. No experimento 2, os animais receberam MEL nas mesmas dosagens do experimento anterior, porém por 3 dias. Os CCOs foram coletados 24 horas após a última injeção e maturados in vitro com hormônio folículo estimulante (0,5 µg/mL; FSH). No experimento 3, os CCOs foram maturados in vitro na presença de três diferentes doses de MEL (10-9, 10-6 e 10-3 M) ou em FSH (controle FSH). Por fim, no experimento 4, a melhor concentração de MEL (10-9 M) eleita no experimento 3, foi utilizada sozinha ou em associação com peróxido de hidrogênio (300µM; H2O2). Os CCOs foram maturados como no experimento anterior. Para os quatro experimentos foram avaliados a taxa de maturação mediante a extrusão do primeiro corpúsculo polar (1º CP) e a expressão de genes relacionados à apoptose (Bax e Bcl2l1) e enzimas antioxidantes (Gpx1, Sod1 e Sod2) por qPCR-RT tanto para as células do cumulus (CC), quanto para os oócitos (OO). No experimento 1, o tratamento com 20 mg/kg de MEL apresentou maior taxa de maturação in vivo de 80,3%, seguido do controle (69,4%) e 10 mg/kg de melatonina (62,4%; P>0,05). Para a expressão gênica não houve efeito de nenhum tratamento (P>0,05). No experimento 2, a taxa de maturação variou de 39 a 53,2% entre os tratamentos (P>0,05). Em CC, a expressão gênica foi diminuída de Bcl2l1 e aumentada de Gpx1 tratados com 20 mg/kg de MEL (P<0,05). Já para OO, somente houve aumento da expressão de Gpx1 para ambos os tratamentos com MEL (P<0,05). No experimento 3, a taxa de maturação foi de 48,9%, 53,7%, 56% e 57,3% para 10-3, 10-6, 10-9 M de MEL e FSH, respectivamente (P>0,05). As concentrações de 10-9 e 10-6 M de MEL aumentaram a expressão dos genes Gpx1 e Sod1 em CC (P<0,05). Em OO, somente houve aumento da expressão gênica de Bax na concentração de 10-6 M de MEL (P<0,05). No último experimento, não houve diferença significativa quanto à taxa de maturação, variando de 51,8% para o tratamento com H2O2 a 60% para o controle FSH (P>0,05). Em CC, Gpx1 e Sod1 tiveram suas expressões aumentadas em todos os tratamentos (P<0,05). De maneira contrária, o gene Bcl2l1 teve sua expressão diminuída (P<0,05). Com base nestes dados, conclui-se que a MEL aplicada in vivo não foi capaz de melhorar a taxa de maturação in vivo e in vitro, porém, em condições in vitro induziu a progressão da meiose em oócitos murinos. Além disso, em condições in vitro, genes antioxidantes como Gpx1 e Sod1 foram mais expressos em CC do que em OO em resposta ao tratamento com MEL, indicando a indução de um possível efeito protetor frente à condições de cultivo in vitro. / Many factors are involved in the control of oocyte maturation and developmental competence. Melatonin (MEL) is a hormone showing varied functions including antioxidant and antiapoptotic activities, besides influencing many cell signaling pathways. There are few studies on the role of MEL in oocyte maturation and the mouse, due to its quick reproduction and lower maintencance cost, is an interesting model widely used for in vitro and particularly in vivo studies. The aim of this work was to study the effects of MEL on in vivo and in vitro maturation and its cytoprotective action (antioxidant/antiapoptotic) in murine cumulus-oocyte complexes (CCOs). In experiment one, mice received MEL injections at concentrations of 0 (control), 10 and 20 mg/kg/i.p./day for 4 days. CCOs were in vivo matured and recovered 17 hours after the last injection. In experiment 2, the animals received MEL in the same dosages of the previous experiment, but for 3 days. CCOs were collected 24 hours after the last injection and in vitro matured with follicle stimulating hormone (FSH). In experiment 3, CCOs were in vitro matured with three MEL concentrations (10-9, 10-6 e 10-3 M) or FSH (FSH control). Finally, in the fourth experiment, the best concentration of MEL (10-9 M) selected in experiment 3 was used alone or in association with hydrogen peroxide (300 µM; H2O2). CCOs were matured as in the previous experiment. For all four experiments maturation rates were evaluated by extrusion of the first polar body and the expression of genes related to apoptosis (Bax and Bcl2l1) and antioxidant enzymes (Gpx1, Sod1 and Sod2) by qPCR-RT both cumulus cells (CC), and for the oocytes (OO) were assessed as well. In experiment 1, treatment with 20 mg/kg MEL showed a higher rate of in vivo maturation of 80.3%, followed by the control (69.4%) and 10 mg/kg MEL (62.4%; P>0.05). No effect for gene expression treatments (P>0.05) was observed. In experiment 2, maturation rate ranged from 39 to 53.2% between treatments (P>0.05). In CC, the gene expression was reduced for Bcl2l1 and enhanced for Gpx1 in animals treated with 20 mg/kg MEL (P<0.05). For OO, only Gpx1 expression was increased for both MEL treatments (P<0.05). In experiment 3, the maturation rates were 48.9, 53.7, 56 e 57.3% for MEL 10-3, 10-6, 10-9 M and FSH, respectively (P>0.05). MEL concentrations of 10-6 and 10-9 M increased expression of Gpx1 and Sod1 genes in CC (P<0.05). For OO, only Bax increased the gene expression in 10-6 M MEL concentration (P<0.05). In the last experiment, there was no significant difference in maturation rate, ranging from 51.8 for H2O2 to 60% for FSH control (P>0.05). Gpx1 and Sod1 genes had their expression increased in all the treatments in CC (P<0.05). For Bcl2l1 gene, the expression was decreased in CC as well (P<0.05). Based on these data, we conclude that MEL treatment in vivo was unable to promote maturation rate in vivo and in vitro, but under in vitro conditions it induced meiosis progression in murine oocytes. In addition, Gpx1 and Sod1 antioxidant genes were more expressed in CC than OO in response to MEL treatments in vitro indicating induction of a possible protective effect against in vitro culture conditions.

A alimentação diferencial durante o desenvolvimento das abelhas Apis mellifera desencadeia respostas endógenas em vias de sinalização e sistema endócrino, que promovem o desenvolvimento de fenótipos alternativos nas castas femininas. Rainhas e operárias diferem em sua fisiologia, morfologia, longevidade, função na colônia, comportamento, e principalmente, na ativação do sistema reprodutivo. Em relação aos ovários, resultados prévios baseados em ensaios de microarranjos revelaram um conjunto de genes como diferencialmente expressos (DEGs) em larvas de rainhas e operárias. Esse trabalho teve como objetivo analisar os padrões de expressão desses DEGs em mais detalhe em ovários larvais de rainhas e operárias. Com esse objetivo, foram selecionados 18 DEGs para validação por RTqPCR. Estas análises foram realizadas em ovários dissecados de rainhas e operárias em quatro estágios larvais que representam fases críticas no desenvolvimento ovariano (L4, L5F1, L5F2 e L5F3). Dentre os 18 DEGs candidatos, 11 foram confirmados como de fato diferencialmente expressos. Entre esses, quatro genes que codificam enzimas: short chain dehydrogenase reductase (GB54419), 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), SCPEP1-like gene (GB11273) e glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902), exibiram um pico de expressão em L5F1 em ovários de operárias. Dentre os dois genes relacionados à estocagem ou transporte de proteínas, o gene apolipoprotein III (GB20117) encontrou-se mais expresso em operárias enquanto que hexamerin 70b (GB10869) se mostrou superexpresso em ovários de rainhas. Os genes relacionados à tradução de mRNA e vias de sinalização: elongation factor 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) e mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) estavam significativamente superexpressos em ovários de rainhas. O gene OCLP-1 (GB19297), que possui uma função hipotética como inibidor de cistina foi encontrado como superexpresso em ovários de operárias. A fim de avaliar a modulação desses genes por hormônio juvenil, foi realizado o tratamento in vivo de larvas de operárias com aplicação tópica do hormônio. Após seis horas de tratamento, os ovários foram dissecados e as amostras analisadas por RT-qPCR. Dos onze DEGs testados para resposta a HJ, seis se mostraram significativamente modulados pelo hormônio Dois genes, short chain dehydrogenase reductase e heat shock protein 90, que também respondem a ecdisona, são up-regulados por HJ, enquanto os genes OCLP-1, hexamerin 70b, 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase e apolipoprotein III eram downregulados. A expressão diferencial desses genes que codificam enzimas, proteínas de transporte/estocagem e fatores de vias de sinalização, indica que estes genes são importantes no desenvolvimento casta-especifíco dos ovários, uma vez que sua expressão está fortemente modulada durante os estágios em que ocorre a morte celular programada em ovários de operárias. / Differential feeding during larval development of the honey bee (Apis mellifera) triggers endogenous responses in signaling pathways and the endocrine system which promote the development of alternative phenotypes in the female castes. Queens and workers differ in physiology, morphology, longevity, function in the colony, behavior, and, especially so, the activation of the reproductive system. Concerning the ovaries, previous results based on microarray assays revealed a set of differentially expressed genes (DEGs) in queen and worker larvae.This project now aimed to further analyze the expression patterns of DEGs in the ovaries of larval workers and queens. From the microarray assays we selected a set of 18 DEGs for validation by qPCR. These analyses were performed on ovaries dissected from queens and workers of four larval stages representing critical phases of ovary development (L4, L5F1, L5F2, L5F3). Among the 18 DEG candidates, 11 were confirmed as differentially expressed. Four genes that code for enzymes: a short chain dehydrogenase reductase (GB54419), a 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (GB18737), an SCPEP1-like gene (GB11273) and glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GB50902) exhibited an expression peak at L5F1 in worker ovaries. Among the two genes encoding storage or transport proteins, apolipoprotein III (GB20117) was more expressed in workers and hexamerin 70b (GB10869) was overexpressed in queen ovaries. Among the genes related to mRNA translation and signaling pathways: elongation fator 1? (GB52028), heat shock protein 60 (GB18969), heat shock protein 90 (GB40976) and a mitogen-activated protein kinase 3 (GB41845) were found significantly overexpressed in queen ovaries. The gene OCLP-1 (GB19297), which has a hypothetical function as an inhibitor cystine knot peptide, was found higher expressed in worker ovaries. So as to evaluate the modulation of these genes by juvenile hormone, an in vivo treatment of workers larvae was performed with cuticular application of the hormone. After six hours of treatment, the ovaries were dissected and the samples analyzed by RTqPCR. Of the eleven DEGs tested for response to JH, six were significantly modulated by the hormone. Two genes, short chain dehydrogenase reductase and heat shock protein 90, which also respond to ecdysone, were up-regulated by JH, while OCLP-1 hexamerin 70b, 15- hydroxyprostaglandin dehydrogenase and apolipoprotein III were down-regulated.The differential expression of these genes encoding enzymes, storage/transport and signaling pathway proteins indicates that they are important in caste-specific ovary development, as their expression is strongly modulated during stages when programmed cell death takes place.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-03-28T12:27:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fernando_Bandeira.pdf: 1564177 bytes, checksum: 8d086e34d835408a590bd8a69d5aa73a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-03-28T20:58:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fernando_Bandeira.pdf: 1564177 bytes, checksum: 8d086e34d835408a590bd8a69d5aa73a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T20:58:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fernando_Bandeira.pdf: 1564177 bytes, checksum: 8d086e34d835408a590bd8a69d5aa73a (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / Sem bolsa / A mastite bovina é um problema sanitário mundial, com medidas de tratamento e prevenção insatisfatórias. Paralelamente, vem crescendo o interesse no uso de própolis como alternativa para tratamento das mastites, sendo ainda, objeto de estudos com finalidade de uso como adjuvante. Até o momento, porém, não foi descrito seu uso em vacinas para controle da mastite bovina. A importância do gênero Staphylococcus como agente da enfermidade é bem documentada, crescendo a necessidade de identificação da espécie do agente etiológico. A pesquisa identificou 12,6% de estafilococos coagulase positiva em mastites subclínicas na região sul do Brasil, sendo que S. aureus estando presente em 17,6% dos animais pesquisados. Dentre os isolados coagulase positiva, a frequência de S. aureus foi de 85,7%, a de S. intermedius foi de 8,5% e de S. hyicus foi 5,8%. A bactéria S. aureus utiliza vários fatores de patogenicidade para causar a infecção no hospedeiro. Foi pesquisado em bases de dados, as informações recentes sobre os principais produtos expressos e forma de atuação. Descreveu-se os principais mecanismos ligados a penetração do micro-organismo na glândula mamária, os processos que medeiam a formação do biofilme e suas estratégias de sobrevivência as respostas do hospedeiro, resultando em processos que muitas vezes tornam-se crônicos. Finalmente, é desejável a utilização de uma vacina eficiente para colaborar no controle da mastite, e dessa forma foi proposta a utilização de uma bacterina contendo extrato hidro-alcoólico de própolis verde na formulação. Comparou-se o seu efeito com uma formulação sem adição de própolis, vacina comercial e PBS esterilizado, em um trabalho conduzido em 63 bovinos. De forma semelhante, com os mesmos grupos de tratamento, mas com a adição de um grupo que recebeu apenas o extrato hidroalcoólico de própolis verde, foi conduzida uma pesquisa em 30 camundongos BALB/c. A pesquisa de anticorpos IgG em bovinos, demonstrou que tanto o tratamento contendo extrato hidroalcóolico de própolis verde quanto a bacterina sem própolis apresentaram resultados semelhantes, superiores aos tratamentos utilizando a vacina comercial e PBS, sendo que nos mesmos tratamentos, foi observada uma resposta com característica humoral inicialmente, tendendo a celular ao longo do experimento. Nos bovinos, a expressão relativa de RNAm para INF-γ, IL-2 e CXCR5 foi elevada para o grupo que recebeu a bacterina contendo extrato hidroalcoólico de própolis verde. Os resultados do teste de ELISA em camundongos, foram semelhantes aos encontrados para os bovinos. O grupo que recebeu apenas o extrato hidroalcoólico de própolis verde sem nenhuma combinação bacteriana, demonstrou resposta com predominância de IgG1 ao longo da pesquisa, semelhante aos grupos de vacina comercial e PBS. No modelo murino, a vacina comercial apresentou índices maiores de expressão de RNAm para as citocinas pesquisadas em esplenócitos. Os resultados obtidos sugerem que a bacterina contendo extrato hidroalcoólico de própolis verde apresenta potencial para atuar como ferramenta no controle da mastite bovina. / Bovine mastitis is a global health problem and many scientific advances have occurred, but the treatment and prevention of disease with existing techniques do not present satisfactory results. Similarly, there is growing interest in the use of propolis as an alternative for treatment of mastitis, also being the object of studies in order to use as an adjuvant, although so far it has not been described their use in vaccines for the control of bovine mastitis. The importance of Staphylococcus gender as disease agent is well documented, growing need for species identification of the etiologic agent. In a survey of coagulase-positive staphylococci in subclinical mastitis in southern Brazil, was finding its presence in 12.6% of cases with S. aureus was present in 17.6% of animal researched. Among the considered coagulase positive S. aureus is 85.7%, 8.5%, were S. intermedius and 5.8% were identified as S. hyicus. For the S. aureus penetrate, multiply and keep the host uses multiple pathogenic factors. Was researched in the literature to-date information on the main mechanisms expressed by the bacteria and how they operate, alone or integrated to ensure the penetration of micro-organism in the mammary gland, the processes that mediate the formation of biofilms and their coping strategies the host responses, their internalization in the cells and its continuation mechanisms, resulting in processes that often become chronic. To assist in the control of mastitis, is desirable the use of an effective vaccine and thus has been proposed the use of a bacterin containing hydroalcoholic extract of green propolis in the formulation is desirable, being compared to a similar bacterin without propolis, commercial vaccine and sterile PBS on a work carried out on 63 bovines. Similarly, with the same treatment groups and the addition of a group that received only the hydroalcoholic extract of propolis, a study was conducted on 30 BALB/c mice. The research of IgG antibodies in bovines showed that both treatment containing hydroalcoholic extract of propolis as the bacterin without propolis showed similar results and superior to commercial and PBS treatments, and the same treatment, we observed initially characteristic a humoral response with tending to cellular during throughout the experiment. In bovines, the relative expression of mRNA for INF-γ, IL-2 and CXCR5 was raised to the group receiving bacterin containing hidroalcoholic extract of green propolis. The ELISA results were similar to those of bovine in BALB/c still with the group that received only the the alcoholic extract of propolis without any bacterial combination, behaving similarly commercial and PBS, and the response was predominantly IgG1 to during the research. In the murine model, the commercial vaccine showed higher levels of mRNA expression for the studied cytokines. The results indicate that the bacterin containing alcoholic extract of propolis has the potential to act as a tool in the control of bovine mastitis in the target especie, requiring minor adjustments and a job to prove the efficiency in a challenge.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-06-14T12:50:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_leticia_neutzling_rickes.pdf: 1993198 bytes, checksum: 613414279ef93ce417b50eba90eee46c (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-14T20:55:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_leticia_neutzling_rickes.pdf: 1993198 bytes, checksum: 613414279ef93ce417b50eba90eee46c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T20:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_leticia_neutzling_rickes.pdf: 1993198 bytes, checksum: 613414279ef93ce417b50eba90eee46c (MD5) Previous issue date: 2015-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A fruticultura é um importante componente do agronegócio brasileiro, assumindo destaque cada vez maior no Rio do Grande do Sul, principalmente na região Sul deste Estado. Esta região se destaca por ser a maior detentora da produção de pêssegos do Brasil, porém ainda apresenta a menor produtividade média dos pomares, quando comparado a outros Estados. Isso se deve principalmente pelas condições edafoclimáticas da região, onde há presença de solos com horizonte „A‟ pouco profundo e com problema de drenagem, que dependendo do período do ano, podem sofrer situações de déficit hídrico em períodos críticos para a cultura, prejudicando o desenvolvimento e a produtividade da mesma. A restrição hídrica afeta diretamente o metabolismo das plantas, como por exemplo, a diminuição da taxa assimilatória líquida, o fechamento estomático, a utilização e partição de carboidratos e em nível molecular, a expressão de genes relacionados ao déficit hídrico. Desta forma, este trabalho visou caracterizar respostas diferenciais à nível fisiológico e molecular em plantas do gênero Prunus persica enxertadas sobre diferentes portaenxertos submetidas ao déficit hídrico, a fim de auxiliar na escolha de genótipos mais tolerantes à essa condição hídrica. O trabalho foi dividido em três experimentos, no primeiro, foram avaliados os parâmetros das trocas gasosas da cultivar copa Chimarrita enxertada sobre cinco diferentes portaenxertos (Tsukuba 1, Tsukuba 2, Tsukuba 3, Aldrighi 1 e Seleção UFPel 0402) submetidos ao déficit hídrico, com esquema fatorial: 2 x 8, sendo duas condições hídricas (controle e déficit hídrico) e oito dias de avaliação (0, 1º, 2º, 3º, 4º, 6º, 7º e 9º, sendo os dois últimos, período de recuperação: 24h e 72h, respectivamente). As diferentes combinações de portaenxertos com a cultivar copa Chimarrita, demonstraram comportamento fisiológico diferencial para a tolerância inicial ao déficit hídrico. A combinação „Chimarrita‟/Adrighi 1‟ apresentou-se com uma maior de tolerância inicial ao déficit hídrico. A redução da taxa assimilatória líquida perante o déficit hídrico não está relacionada principalmente à limitação estomática, sugerindo-se que ocorrem também limitações não estomáticas. No segundo experimento, objetivou-se analisar genes normalizadores para estudos de expressão gênica através da técnica de RT-qPCR em folhas de „Chimarrita‟, enxertadas sobre „Aldrighi 1‟ e „Tsukuba 2‟ submetidos ao déficit hídrico por um período de nove dias. Não houve influência das diferentes combinações „Chimarrita‟/portaenxertos para expressão dos genes normalizadores nas condições impostas do presente estudo, sendo os genes TUA e CYP2 considerados os mais adequados mediante as condições impostas. Por outro lado, os genes Ef-1α e ACT foram os menos indicados para as mesmas condições. No terceiro experimento, objetivou-se verificar através da técnica de RT-qPCR a expressão de sete genes-chave envolvidos no processo de resposta ao déficit hídrico em folhas de pessegueiro cultivar copa „Chimarrita‟ enxertadas sobre os portaenxertos „Aldrighi 1‟ e „Tsukuba 2‟. Os resultados demonstraram que houve indução de resposta diferencial da combinação „Chimarrita‟/portaenxertos em relação à expressão dos genes envolvidos no metabolismo do ajustamento osmótico, tais como, SDH, SIP1 GTL e P5SC. O gene S6PDH, apresentou expressão bastante pronunciada e similar para ambas as combinações copa/portaenxertos no quarto dia de estresse, evidenciando a participação e importância do sorbitol no ajustamento osmótico para uma possível tolerância ao déficit hídrico. No entanto, expressão dos genes relacionados ao metabolismo de sorbitol e de prolina, podem ser utilizados como marcadores moleculares para tolerância ao déficit hídrico em portaenxertos de Prunus persica. / Fruit growing is an important component of Brazilian agribusiness, assuming increasing prominence in the Rio Grande do Sul, mainly in the southern region of this state.This region stands out as the largest holder of the production of peaches in Brazil, but also has the lowest average productivity of the orchards when compared to other states. This is mainly the soil and climatic conditions of the region, where there is presence of soils with horizon 'A' superficial and with drainage problem, which depending on the time of year, may suffer water stress situations at critical periods for culture, impairing development and productivity of the same. Water restriction intake directly affects the metabolism of plants, such as the decrease in net assimilation rate, stomatal closure, use and carbohydrates partition and molecular level the expression of genes related to drought. Therefore, this study aimed to characterize differential responses to physiological and molecular level in the genus Prunus persica plants, grafted on different rootstocks subjected to water stress in order support choose the most tolerant to this condition water. The work was divided into three experiments, the first evaluated the parameters of gas exchange of the cultivar cup Chimarrita grafted on five different rootstocks (Tsukuba 1, Tsukuba 2, Tsukuba 3, Aldrighi 1 and Seleção UFPel 0402) submitted to water deficit, with factorial design: 2 x 8, two water conditions (control and water deficit ) and eight days of evaluations (0, 1, 2, 3, 4, 6, 7 and 9, the latter two, recovery time: 24 hours and 72 hours respectively). The different combinations of rootstocks with the cultivar cup Chimarrita demonstrated physiological performance differential for initial tolerance to water deficit. The combination 'Chimarrita'/Aldrighi 1 'presented with an initial greater tolerance to water deficit. The reduced net assimilation rate before the water deficit is not related mainly to stomatal limitation, suggesting that also occur not stomatal limitations. The second experiment aimed to analyze normalizing genes for gene expression studies by RT- qPCR technique in leaves 'Chimarrita' grafted on 'Aldrighi 1' and 'Tsukuba 2' and subjected to water stress for a period of nine days. There was no influence of different combinations 'Chimarrita'/rootstocks for normalizing gene expression of the imposed conditions of this study, and the TUA and CYP2 genes considered best suited by the conditions imposed. However, the EF-1α gene and the ACT less suitable for the same conditions. In the third experiment aimed to verify through RT- qPCR technique the expression of seven key genes involved in the response process to water deficit in peach leaves cultivar cup 'Chimarrita' grafted on rootstocks „Aldrighi 1' and „Tsukuba 2'. The results showed induction differential response of the combination 'Chimarrita'/rootstocks compared to the expression of genes involved in the metabolism of the osmotic adjustment, such as SDH, SIP1, GTL and P5SC. The S6PDH gene, presented quite pronounced and similar expression for both compounds canopy/rootstocks on the fourth day of stress, suggesting a participation and importance of sorbitol in osmotic adjustment for possible tolerance to water deficit. However, expression of genes related to the metabolism of sorbitol and proline, can be used as molecular markers for tolerance to water deficit in rootstocks of Prunus persica.

Diversos são os fatores que estão envolvidos no controle da maturação oocitária e na qualidade e competência do oócito. A melatonina (MEL) é um hormônio que apresenta diversas funções, como atividade antioxidante e antiapoptótica, além de influenciar diferentes vias de sinalização celular. Ainda há poucos estudos sobre o papel da MEL na maturação de oócitos e o camundongo, por sua rápida reprodução e menor custo de manutenção, é um excelente modelo amplamente utilizado para estudos in vitro e, particularmente in vivo. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da MEL sobre a maturação in vivo e in vitro e sua possível ação como protetor celular (antioxidante e/ou antiapoptótico) de complexos cumulus-oócitos (CCOs) murinos. No experimento 1, os animais receberam injeções de MEL nas concentrações de 0 (controle), 10 e 20 mg/kg/i.p./dia por 4 dias. Os CCOs foram maturados in vivo e recuperados 17 horas após a última injeção. No experimento 2, os animais receberam MEL nas mesmas dosagens do experimento anterior, porém por 3 dias. Os CCOs foram coletados 24 horas após a última injeção e maturados in vitro com hormônio folículo estimulante (0,5 µg/mL; FSH). No experimento 3, os CCOs foram maturados in vitro na presença de três diferentes doses de MEL (10-9, 10-6 e 10-3 M) ou em FSH (controle FSH). Por fim, no experimento 4, a melhor concentração de MEL (10-9 M) eleita no experimento 3, foi utilizada sozinha ou em associação com peróxido de hidrogênio (300µM; H2O2). Os CCOs foram maturados como no experimento anterior. Para os quatro experimentos foram avaliados a taxa de maturação mediante a extrusão do primeiro corpúsculo polar (1º CP) e a expressão de genes relacionados à apoptose (Bax e Bcl2l1) e enzimas antioxidantes (Gpx1, Sod1 e Sod2) por qPCR-RT tanto para as células do cumulus (CC), quanto para os oócitos (OO). No experimento 1, o tratamento com 20 mg/kg de MEL apresentou maior taxa de maturação in vivo de 80,3%, seguido do controle (69,4%) e 10 mg/kg de melatonina (62,4%; P>0,05). Para a expressão gênica não houve efeito de nenhum tratamento (P>0,05). No experimento 2, a taxa de maturação variou de 39 a 53,2% entre os tratamentos (P>0,05). Em CC, a expressão gênica foi diminuída de Bcl2l1 e aumentada de Gpx1 tratados com 20 mg/kg de MEL (P<0,05). Já para OO, somente houve aumento da expressão de Gpx1 para ambos os tratamentos com MEL (P<0,05). No experimento 3, a taxa de maturação foi de 48,9%, 53,7%, 56% e 57,3% para 10-3, 10-6, 10-9 M de MEL e FSH, respectivamente (P>0,05). As concentrações de 10-9 e 10-6 M de MEL aumentaram a expressão dos genes Gpx1 e Sod1 em CC (P<0,05). Em OO, somente houve aumento da expressão gênica de Bax na concentração de 10-6 M de MEL (P<0,05). No último experimento, não houve diferença significativa quanto à taxa de maturação, variando de 51,8% para o tratamento com H2O2 a 60% para o controle FSH (P>0,05). Em CC, Gpx1 e Sod1 tiveram suas expressões aumentadas em todos os tratamentos (P<0,05). De maneira contrária, o gene Bcl2l1 teve sua expressão diminuída (P<0,05). Com base nestes dados, conclui-se que a MEL aplicada in vivo não foi capaz de melhorar a taxa de maturação in vivo e in vitro, porém, em condições in vitro induziu a progressão da meiose em oócitos murinos. Além disso, em condições in vitro, genes antioxidantes como Gpx1 e Sod1 foram mais expressos em CC do que em OO em resposta ao tratamento com MEL, indicando a indução de um possível efeito protetor frente à condições de cultivo in vitro. / Many factors are involved in the control of oocyte maturation and developmental competence. Melatonin (MEL) is a hormone showing varied functions including antioxidant and antiapoptotic activities, besides influencing many cell signaling pathways. There are few studies on the role of MEL in oocyte maturation and the mouse, due to its quick reproduction and lower maintencance cost, is an interesting model widely used for in vitro and particularly in vivo studies. The aim of this work was to study the effects of MEL on in vivo and in vitro maturation and its cytoprotective action (antioxidant/antiapoptotic) in murine cumulus-oocyte complexes (CCOs). In experiment one, mice received MEL injections at concentrations of 0 (control), 10 and 20 mg/kg/i.p./day for 4 days. CCOs were in vivo matured and recovered 17 hours after the last injection. In experiment 2, the animals received MEL in the same dosages of the previous experiment, but for 3 days. CCOs were collected 24 hours after the last injection and in vitro matured with follicle stimulating hormone (FSH). In experiment 3, CCOs were in vitro matured with three MEL concentrations (10-9, 10-6 e 10-3 M) or FSH (FSH control). Finally, in the fourth experiment, the best concentration of MEL (10-9 M) selected in experiment 3 was used alone or in association with hydrogen peroxide (300 µM; H2O2). CCOs were matured as in the previous experiment. For all four experiments maturation rates were evaluated by extrusion of the first polar body and the expression of genes related to apoptosis (Bax and Bcl2l1) and antioxidant enzymes (Gpx1, Sod1 and Sod2) by qPCR-RT both cumulus cells (CC), and for the oocytes (OO) were assessed as well. In experiment 1, treatment with 20 mg/kg MEL showed a higher rate of in vivo maturation of 80.3%, followed by the control (69.4%) and 10 mg/kg MEL (62.4%; P>0.05). No effect for gene expression treatments (P>0.05) was observed. In experiment 2, maturation rate ranged from 39 to 53.2% between treatments (P>0.05). In CC, the gene expression was reduced for Bcl2l1 and enhanced for Gpx1 in animals treated with 20 mg/kg MEL (P<0.05). For OO, only Gpx1 expression was increased for both MEL treatments (P<0.05). In experiment 3, the maturation rates were 48.9, 53.7, 56 e 57.3% for MEL 10-3, 10-6, 10-9 M and FSH, respectively (P>0.05). MEL concentrations of 10-6 and 10-9 M increased expression of Gpx1 and Sod1 genes in CC (P<0.05). For OO, only Bax increased the gene expression in 10-6 M MEL concentration (P<0.05). In the last experiment, there was no significant difference in maturation rate, ranging from 51.8 for H2O2 to 60% for FSH control (P>0.05). Gpx1 and Sod1 genes had their expression increased in all the treatments in CC (P<0.05). For Bcl2l1 gene, the expression was decreased in CC as well (P<0.05). Based on these data, we conclude that MEL treatment in vivo was unable to promote maturation rate in vivo and in vitro, but under in vitro conditions it induced meiosis progression in murine oocytes. In addition, Gpx1 and Sod1 antioxidant genes were more expressed in CC than OO in response to MEL treatments in vitro indicating induction of a possible protective effect against in vitro culture conditions.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-11-10T16:06:34Z No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T16:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / The determination of fetal sex using maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test (NIPDT), offered to pregnant women, especially those with an increased risk of having children with conditions X-linked inheritance. Because it is a non-invasive technique, it presents a greater advantage over other methods of invasive prenatal diagnosis such as amniocentesis, cordocentesis and biopsy of chorionic villi. The use of cell free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma has become a promising alternative for the diagnosis of noninvasive and early sex determination. The porpuse this study is to conduct a qualitative test in pregnant women with gestational age ranging from 6 to 20 weeks using the noninvasive prenatal test for the early sex determination of fetal by the real time PCR technique. Twenty-one healthy pregnant women, over 18 years of age, single gestation and attended at the Gynecology and Obstetrics Clinic of the Unigen Laboratory belonging to the Private Health Care Network of the City of Goiânia-GO were selected. After venous blood collection, plasma was separated and frozen (-20 ° C). The material to be analyzed followed the laboratory of the company Qiagen® located in São Paulo, SP, where DNA extraction and purification were performed using fully automated equipment (QIAcube®, with the QIAamp® DNA Micro kit, using the protocol "Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples", according to the manufacturer's specifications), and then the quantitative PCR technique (Rotor-Gene® Qiagen) was run for specific Y-sequence amplification. Of the 21 pregnant women selected, two participants aborted and were excluded from the study. The results showed that, in the 19 cases analyzed, comparing the results of qPCR with fetal sex determined by ultrasonography (USG), 7/19 (36.8%) pregnancies with positive results for the Y chromosome (determining the male sex) and 11/19 (57.9%) pregnancies with a negative result for the Y chromosome (determining the female sex) and only one gestation (5.3%) presented false-negative results for males. The analysis of the concordance index, between the results of the qPCR and the USG, found a concordance of 0.89. These results confirmed a good sensitivity and specificity of the method for the gestation period studied (mean of 12 weeks), indicating that this procedure should be used in the medical routine as an auxiliary tool in cases where fetal sexing becomes necessary for health fetal and/or decreased parents anxiety. / A determinação do sexo fetal utilizando o plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN), oferecido as gestantes, principalmente para aquelas com risco aumentado de terem crianças com doenças ligadas ao sexo. Por se tratar de uma técnica não invasiva, apresenta-se com maior vantagem sobre outros métodos de diagnóstico pré-natal invasivos como a amniocentese, cordocentese e a biópsia de vilosidades coriônicas. O diagnóstico pré-natal (DPN) tem sido importante no acompanhamento de gestações com anormalidades fetais, além de permitir um planejamento mais adequado para o parto e de cuidados neonatais específicos. Dessa forma, o DPN tem sido estabelecido na prática obstétrica moderna e integra um conjunto de procedimentos para identificar uma anormalidade no feto durante a gravidez. Diversas pesquisas têm buscado a utilização de novas tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo (DPNI). O uso de DNA fetal livre (cffDNA) no plasma materno passou a ser uma alternativa promissora para diagnóstico do sexo não invasivo e precoce. O objetivo do presente trabalho é realizar um estudo qualitativo em pacientes gestantes, com idade gestacional variando de 6 a 20 semanas utilizando o teste pré-natal não invasivo para a determinação precoce do sexo fetal pela técnica de qPCR. Foram selecionadas 21 gestantes saudáveis, maiores de 18 anos e gestação única e atendidas em clínica de ginecologia e obstetrícia do Centro de Diagnóstico Clínico UNIGEN pertencente à Rede Privada de Atendimento à Saúde da Cidade de Goiânia-GO. Após a coleta de sangue venoso, houve a separação e o congelamento do plasma (-20°C). O material a ser analisado seguiu para o laboratório da empresa Qiagen® localizado em São Paulo-SP, onde foram realizadas a extração e purificação do DNA utilizando equipamento automatizado (QIAcube®, com o kit QIAamp® DNA Micro, empregando-se o protocolo “Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples”, conforme especificações do fabricante), e em seguida foi ralizada a técnica de PCR quantitativa (Rotor-Gene® Qiagen) para amplificação de sequência Y específica. Das 21 gestantes selecionadas, duas participantes abortaram, sendo dessa forma excluídas do estudo. Os resultados revelaram que dos 19 casos analisados, ao comparar os resultados da qPCR com o sexo fetal determinado pela ultrassonografia (USG), 7/19 (36,8%) gestações com resultados positivos para o cromossomo Y (determinando o sexo Masculino) e 11/19 (57,9%) gestações com resultado negativo para o cromossomo Y (determinando o sexo Feminino) e apenas uma gestação (5,3%) apresentou resultado falso-negativo para o sexo masculino. A análise do índice de concordância, entre os resultados da qPCR com a USG foi de 0,89. Esses resultados confirmaram uma boa sensibilidade e especificidade do método para o período de gestação estudado (média de 12 semanas), indicando que este procedimento deve ser utilizado na rotina médica como ferramenta auxiliar nos casos onde a sexagem fetal torna-se necessária para tratamento fetal e/ou diminuição da ansiedade dos pais.

Methods for the rapid detection and differentiation of the Burkholderia pseudomallei complex comprising B. pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis, have been the topic of recent research due to the high degree of phenotypic and genotypic similarities of these species. B. pseudomallei and B. mallei are the causative agents of melioidosis and glanders, respectively. B. pseudomallei and B. mallei are recognized by the CDC as tier 1 select agents. Although B. thailandensis is generally avirulent in mammals, this species displays very similar phenotypic characteristics to that of B. pseudomallei. Optimal identification of these species remains problematic, due to the difficulty in developing a sensitive, selective, and accurate assay. To date, no real-time, multiplex PCR assay has been developed that can detect and differentiate between B. pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis in a single tube format. Here, we describe the development of such an assay that detects and differentiates the species of the B. pseudomallei complex. A real-time quadruplex qPCR assay, Bcom, was designed to target unique genomic regions of B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, and the B. pseudomallei complex that detects and differentiates the three species. A total of 299 isolates within the B. pseudomallei complex was evaluated in this study, as well as 15 near-neighbors and other bacterial species. The results showed that this quadruplex assay was capable of detecting the respective species in a given sample at a sensitivity between 288 fg and 277 pg of genomic DNA. The B. pseudomallei- and B. pseudomallei complex-specific assays tested negative on two presumed B. pseudomallei isolates. In addition, a third presumed B. pseudomallei isolate tested negative by the B. pseudomallei-specific test, but was detected by the B. thailandensis and B. pseudomallei complex-specific assays. After cultural and biochemical characterization, 16s rRNA sequencing, and multiple loci sequencing, it is proposed that B. pseudomallei 34 is B. thailandensis 82172 (Accession No. DQ388536), B. pseudomallei Darwin 175 is Elizabethkingia meningoseptica, and B. pseudomallei 135 is a new strain of B. ubonensis 135.

Wing polyphenism is a type of phenotypic plasticity present in several insect species whereby a genotype have the ability to develop alternative wing morphs when exposed to different environmental cues. One organism demonstrating a clear case of wing polyphenism is the water strider species, Gerris buenoi, which develop long- or short wings depending on exposure to different photoperiods (the time the organism is exposed to light during a 24 h period). The molecular mechanism behind wing polyphenism in insects in general, and in water striders in particular, is largely unknown. From a study on wing polyphenism in the Brown planthopper (Nilaparvata lugens), some candidate genes have been identified and include two insulin receptor genes and the Forkhead transcription factor (FOXO). Since these genes have been demonstrated to affect wing polyphenism in Brown planthopper (BPH) and since G. buenoi contains an additional insulin receptor homolog, the potential role of these genes in regulating wing polyphenism in G. buenoi have in this project been investigated. The functional genetic technique RNA interference (RNAi) was used to evaluate the function of the genes. This method knock down gene expression in the genes mentioned above, one at a time, to investigate if they have a function in wing polyphenism in G. buenoi. DsRNA with specific homology to each target gene was successfully produced. However, when attempting to inject the dsRNA through micro injection all injected liquid leaked out from the body cavity, and the RNAi was therefore not successful. Further optimisation of the injection protocol has to be done to be able to perform RNAi properly in the future. Thereafter, RT-qPCR was used to evaluate whether the insulin receptor genes and FOXO are differentially expressed between the two photoperiods giving rise to the different wing morphs. The differential gene expression experiment showed differences between the mRNA levels of all target genes between G. buenoi being reared in the two different photoperiods. More specific upregulation of the genes FOXO and insulin receptor 2 in short winged G. buenoi were demonstrated. Further, insulin receptor 1-like, was also demonstrated to be upregulated in the short winged morph. Results presented in this project are in line with the previously identified regulation pattern in BPH, still the results need further evaluation. Since gene expression differences were present for all candidate genes between G. buenoi reared in the different photoperiods, theses genes could still be seen as potential candidate genes in wing polyphenism in water striders.

EHV-1 is a double-stranded DNA virus whereas EAV is a positive sense, single-stranded RNA virus. Therefore, genetically, they are very different from one another. However, both these viruses are endotheliotropic and thus, infect and replicates in equine endothelial cells resulting in vasculitis. Vasculitis is central to the pathogenesis of these two viruses. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the inflammatory and innate immune responses of EECs that contribute towards the development of vasculitis following infection with EHV-1 and EAV in-vitro. Since proinflammatory cytokines and chemokines produced by endothelial cells play a significant role in the development of vasculitis, we investigated their gene expression as well as secretion. Results from this study showed that the proinflammatory response of EECs induced by EAV is relatively less when compared with the corresponding results from EHV-1 infected EECs. Furthermore, EAV elicits a lower type I interferon response in EECs when compared with EHV-1. Further investigations revealed an active role played by TLR 3 in inducing the proinflammatory response in EHV-1 infected EECs during the first 6 hours of infection but not in EAV infected EECs. Analyzing the whole transcriptome of EHV-1 and EAV infected EECs revealed a complex pattern of gene regulation and cellular pathways related to cellular immune, inflammatory and apoptotic responses. Finally, we investigated host genetic factors associated with EHV-1 induced myeloencephalopathy but found no evidence for a recessive allele influencing the development of EHM following EHV-1 infection for any genetic locus was identified. However, more complex host-pathogen interactions are possible.

La production de lavande concoure au rayonnement de la région Rhône-Alpes. Les applications de l'huile essentielle (HE) de lavande reposent sur la culture de 3 espèces (L. aangustifolia, L. latifolia et L. stoechas et d'un hybride L. x intermedia) aux chémotypes marqués. Le genre Lavandula est un modèle idéal pour comprendre la structuration et l'origine de la diversité des composés organiques volatils (COV) en particulier des terpènes. Les lavandes ont l'avantage d'avoir une aire de distribution large avec des régions bioclimatiques différentes, un nombre d'espèces limité (39) ayant des caractéristiques morphologiques et écologiques variées. Pour caractériser la diversité des COV accumulés dans les espèces du genre et envisager leur évolution, nous avons analysé (GC-MS) les COV de 29 espèces (certaines pour la première fois). Comme souvent chez les plantes, la production de COV dans les inflorescences de lavande est soumise à une régulation spatio-temporelle. L'émission différentielle de COV au cours du temps chez L. angustifolia a été relevée par les agriculteurs qui ont observé une qualité d'HE différente suivant la maturité des inflorescences au moment de la récolte. Pour modéliser ces variations et les corréler avec des étapes du développement de la plante, nous avons analysé, au niveau chimique (GC-FID) et moléculaire (qPCR), les variations temporelles des principaux COV dans les feuilles et les inflorescences (plusieurs années et cultivars). En amont de ces recherches sur les COV du genre Lavandula, différent outils de bioinformatique ont été développés. En particulier, le module " MSeasy " qui permet d'automatiser le rapatriement de données de GC-MS. Ceci constitue un pré-requis pour utiliser la lavande comme modèle d'étude des COV chez les Lamiacées