Vena contracta width (VCW) and effective regurgitant orifice area (EROA) are well established methods for evaluating mitral regurgitation using transesophageal echocardiography (TEE). For color-flow Doppler (CF) measurements Nyquist limit of 50–60 cm/s is recommended. Aim of the study was to investigate the effectiveness of a baseline shift of the Nyquist limit for these measurements. After a comprehensive 2-dimensional (2D) TEE examination, the mitral regurgitation jet was acquired with a Nyquist limit of 50 cm/s (NL50) along with a baseline shift to 37.5 cm/s (NL37.5) using CF. Moreover a real time 3-dimensional (RT 3D) color complete volume dataset was stored with a Nyquist limit of 50 cm/s (NL50) and 37.5 cm/s (NL37.5). Vena contracta width (VCW) as well as Proximal Isovelocity Surface Area (PISA) derived EROA were measured based on 2D TEE and compared to RT 3D echo measurements for vena contracta area (VCA) using planimetry method. Correlation between VCA 3D NL50 and VCW NL50 was 0.29 (p<0.05) compared to 0.6 (p<0.05) using NL37.5. Correlation between VCA 3D NL50 and EROA 2D NL50 was 0.46 (p<0.05) vs. 0.6 (p<0.05) EROA 2D NL37.5. Correlation between VCA 3D NL37.5 and VCW NL50 was 0.45 (p<0.05) compared to 0.65 (p<0.05) using VCW NL37.5. Correlation between VCA 3D NL37.5 and EROA 2D NL50 was 0.41 (p<0.05) vs. 0.53 (p<0.05) using EROA 2D NL37.5. Baseline shift of the NL to 37.5 cm/s improves the correlation for VCW and EROA when compared to RT 3D NL50 planimetry of the vena contracta area. Baseline shift in RT 3D to a NL of 37.5 cm/s shows similar results like NL50.

Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit Der postmortale Nukleinsäureabbau verläuft unterschiedlich: während DNA im Allgemeinen als stabil angesehen wird und erst mit Einsetzen von Fäulniserscheinungen stärkerer Degradation unterliegt, wird RNA mit dem Sistieren der Kreislauftätigkeit relativ rasch abgebaut. Eine Reihe von Studien hat aber gezeigt, dass RNA in bestimmten Geweben eine höhere Stabilität besitzt als ursprünglich angenommen. Dies könnte Bedeutung für die molekulare Medizinforschung besitzen, die auf Genexpressionsstudien in postmortalem Gewebe angewiesen ist. Außerdem könnte eine Quantifizierung der RNA-Degradation z.B. durch Real-time-PCR zur Eingrenzung der Leichenliegezeit genutzt werden. In dieser Studie wurde ein quantitativer Vergleich verschiedener sog. Haushaltsgene (u.a. GAPDH, ß-Actin, FASN) in Gehirngewebe mit einer Leichenliegezeit zwischen 0 und 96 Stunden und unter alternativen Ansätzen zur reversen Transkription (oligo-(dT)-Primer mit und ohne sog. Anker, Random Hexamer Primer) durchgeführt. Zunächst erfolgten systematische Untersuchungen zur Effektivität der RNA-Isolierung, reversen Transkription und der PCR im Hinblick auf eine möglichst präzise Quantifizierung. Es zeigte sich, dass die Resultate der Real-time-PCR ein Maß für die ursprünglich in der Probe vorhandene mRNA-Menge darstellen. Weiterhin stellte sich heraus, dass eine deutliche und evtl. auch zur Liegezeitbestimmung nutzbare RNA-Degradation erst nach 24h einsetzt. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Random- und oligo-(dT)-priming der reversen Transkription war dabei nicht festzustellen. Diese Ergebnisse belegen zum einen, dass RNA im frühen postmortalen Intervall relativ stabil ist und als Substrat für quantitative Untersuchungen dienen kann, zum anderen, dass ein zeitabhängiger Abbau besteht, der eine Eingrenzung der Leichenliegezeit z.B. mittels Grenzwerten in ein frühes und mittleres Postmortalintervall zulässt. / Quantification of the postmortem RNA-status in human brain by means of real-time-PCR: A contribution to the determination of the postmortem interval The postmortem degradation of nucleic acid proceeds differently: whereas DNA is generally considered as stable and is only subject to stronger degradation with the beginning of putrefaction, RNA degrades very fast when the circulation is suspended. A series of studies, however, has shown that RNA has a greater stability in certain tissues than originally expected. This could be important for molecular medical research which is dependent on gene expression studies using postmortem tissue. Furthermore, the quantification of RNA-degradation by means of real-time-PCR could be used for the limitation of the postmortem interval. In this study, a quantitative comparison has been made between different so-called housekeeping-genes (e.g. GAPDH, ß-Actin, FASN) in human brain and a postmortem interval between 0 and 96 hours. Different alternative approaches have been used for the reverse transcription (oligo-(dT)-Primer with and without Anker, Random Hexamer Primer). At first, systematic examinations concerning the effectiveness of RNA isolation, reverse transcription and PCR have been undertaken with regard to a preferably exact quantification. It turned out that the results of the real-time-PCR represent a measure for the mRNA amount originally present in the specimen. Moreover, it emerged that a clear RNA degradation, which could possibly be used for the determination of the postmortem interval, begins after 24 hours. An important difference between random and oligo-(dT) priming of the reverse transcription could not be stated. These results demonstrate, on the one hand, that RNA is relatively stable during the early postmortem interval so that it can serve as substrate for quantitative examinations. On the other hand, it is shown that a time-dependent degradation exists which allows a limitation of the postmortem interval into an early and middle postmortem interval by means of threshold values for example.

Die kontrastmittel- gestützte Late Enhancement- MRT ermöglicht die Darstellung myokardialer Veränderungen wie z.B. Ödem, Nekrose oder Fibrose. Ziel dieser Arbeit war es die semiautomatische Late Enhancement- Quantifizierung im Programm VPT 3.0 mit der manuellen Late Enhancement- Quantifizierung im Viewing- Programm zu vergleichen. Es wurden Late Enhancement- MRT- Datensätze von Patienten mit ischämischen (Myokardinfarkt) bzw. nicht- ischämischen Kardiomyopathien (Morbus Fabry, Morbus Hodgkin, Aortenklappenstenose) analysiert. Die Quantifizierung des Late Enhancement- Signals erfolgte manuell im Viewing- Programm und semiautomatisch unter Anwendung von VPT 3.0. Der Vergleich der Ergebnisse aus der manuellen Analyse und der semiautomatischen Analyse der Daten von Patienten nach Myokardinfarkt, mit kardialer Beteiligung bei Morbus Fabry und bei Z.n. anteriorer Mantelfeldbestrahlung bei Morbus Hodgkin, zeigte eine hohe Übereinstimmung sowie eine gute Korrelation der Werte beider Methoden. Eine valide Late Enhancement- Quantifizierung bei Patienten mit Aortenklappenstenose war sowohl in der manuellen, wie auch in der semiautomatischen Methode nicht möglich. Dies ist unter anderem auf das kleinfleckige, diffus flächige Verteilungsmuster im Rahmen der hier auftretenden konzentrischen Hypertrophie zurückzuführen. Des Weiteren konnte eine geringe Intraobservervariabilität aufgezeigt werden. Das semiautomatische Programm VPT3.0 ermöglicht eine genaue, mit der manuellen Methode gut korrelierende, Quantifizierung von Late Enhancement bei ischämischen und nicht- ischämischen Kardiomyopathien. Davon ausgenommen ist die Aortenstenose. / Contrast agent-based late enhancement mri allows the depiction of myocardial changes e.g. edema, fibrosis or necrosis. The purpose of this thesis was to compare semi- automatic quantification of late enhancement using VPT3.0 with manual quantification using viewing- program. Late enhancement mri data of patients with ischemic (myocardial infarction) and non-ischemic cardiomyopathy (fabry's disease, hodgkin's lymphoma and aortic stenosis) were analyzed. The quantification of late enhancement signal was accomplished manually using viewing program and semi-automatically using VPT 3.0. The comparison of the results from the analysis of patients‘ data suffering from myocardial infarction, cardiac involvement in fabry’s disease and after anterior mantle field irradiation for hodgkin’s lymphoma, showed high correlation for both methods. A valid quantification of late enhancement in patients with aortic stenosis was not possible in most cases. This can, in part, be attributed to the blotchy and patchy pattern of the fibrotic changes appearing due to concentric hypertrophy. Additionally, a low intraobserver variability was demonstrated. The semi- automatic program VPT 3.0 provides an accurate, with the manual technique well- correlated method of quantifying late enhancement in ischemic and nonischemic cardiomyopathies, excluding aortic stenosis.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Sensors zur gleichzeitigen Bestimmung von Spannungsintensitätsfaktoren (K-Faktoren) und der Risslage. Im Gegensatz zum Stand der Technik werden zwei Aufgaben zur Charakterisierung der Risse (Detektierung von Risslage und Größe und Quantifizierung des Beanspruchungszustandes an der Rissspitze) mit Hilfe nur eines Sensors ermöglicht. Es wurde effiziente, kostengünstige und leicht zu applizierende Technik zur experimentellen bruchmechanischen Beanspruchungsanalyse entwickelt. Eine Struktur mit Riss wird großflächig mit einer piezoelektrischen Polyvinylidenfluorid-Folie (PVDF-Folie) beklebt und eine ausreichende Anzahl von Elektroden befindet sich im Bereich des möglichen/vorhandenen Risses. Die an den Elektroden abgegriffenen elektrischen Potentiale bzw. Ladungen sind ein Maß für die Verzerrungen an der Oberfläche des Bauteils und ermöglichen die Berechnung der bruchmechanischen Größen am Riss. Dabei beschränkte man sich auf die Anwendung des Sensorkonzeptes im Rahmen der Scheiben- und Plattentheorie.

Die Nanotechnologie spielt eine Schlüsselrolle bei der technologischen Entwicklung. Jedoch stellen Nanopartikel ein potentielles Gesundheitsrisiko dar. Durch ihre große Oberfläche zeigen Nanopartikel eine hohe Reaktivität und die geringe Größe trägt zu einer erhöhten Beweglichkeit und Bioverfügbarkeit bei. Beispielsweise können Nanopartikel Entzündungen auslösen oder die Produktion von freien Radikalen fördern. Insbesondere Lungenepithelzellen stellen die wichtigste Barriere zur Aufnahme von industriell relevanten Nanopartikeln im Alltag dar, denn durch ihre geringe Größe können Nanopartikel bis in einzelne Alveolen vordringen und in die Blutbahn gelangen. Aus diesen Gründen ist es notwendig das Risikopotential, was von Nanopartikeln ausgeht zu bewerten. In dieser Dissertation wurden die Metalloxid-Nanopartikel Al2O3, TiO2, Fe2O3, ZnO und CeO2 in einzelnen Lungenzellen erstmals mit Hilfe der Ionenstrahlmikroskopie quantifiziert. Darüber hinaus erfolgte die Quantifizierung von ausgewählten Metalloxid-Nanopartikeln in gedehnten primären Typ 2 Pneumozyten sowie in den Alveolen des Lungengewebes. Außerdem wurden Gold und Silber als Markierungspartikel eingesetzt, um die Aufnahme der organischen Nanopartikel Graphen zu untersuchen. Die Ionenstrahlmikroskopie ist eine hochempfindliche Methode, welche durch die charakteristische Röntgenstrahlung den zellulären Elementgehalt innerhalb einer Zelle visualisieren kann. Dies ist, je nach Element, bis zu einer unteren Konzentrationsgrenze von 5 – 20 ppm möglich. Die Ionenstrahlmikroskopie erlaubt, im Vergleich zur Elektronenstrahlmikroanalyse, biologische Proben bis zu einer Tiefe von ca. 80 µm zu untersuchen. Durch das zelluläre Rückstreusignal konnte bei Kulturzellen entschieden werden, ob die Nanopartikel internalisiert wurden oder auf der Zelloberfläche assoziiert sind. Da biologische Proben eine relativ geringe Dichte und Dicke aufweisen, ist die Signalausbeute und damit die Messzeit ein limitierender Faktor bei der ionenstrahlanalytischen Quantifizierung des Elementgehalts. Durch das Aufziehen der Probe auf einen Aluminiumrahmen, konnte der Abstand zwischen Röntgendetektor und Probe reduziert werden, was zu einer höheren Signalausbeute führte und damit eine schnellere Analyse der Präparate ermöglichte. Die Art und Weise der Probenpräparation kann einen Einfluss auf den zellulären Elementgehalt haben, indem Ionen aus dem Medium an die Zellaußenseite binden oder durch die Waschlösung ein Verlust von intrazellulär lokalisierten organischen und anorganischen Molekülen entsteht. Durch den Vergleich zwischen einer ionenfreien Polyethylenglycol-Lösung mit dem üblicherweise verwendeten Waschpuffer konnte gezeigt werden, dass sich bei der Verwendung des Waschpuffers der zelluläre Elementgehalt von Kalium, Kalzium und insbesondere Chlor erhöht. Allerdings bleiben Phosphor und Schwefel als wichtige zelluläre Strukturelemente und die biologisch relevanten Spurenelemente Eisen und Zink davon unbeeinflusst. Die ionenstrahlmikroskopische Analyse von Lungengewebe erfordert eine Einbettung der Präparate. Dabei erwies sich DePeX, was als Material routinemäßig zur Einbettung verwendet wird, als ungeeignet, da eine inhomogene Zink-Kontamination vorhanden war, welche eine intrazelluläre Zink-Messung verhinderte. Durch die Entwicklung eines neuen zinkfreien Einbettmaterials auf Limonen-Basis, konnte jetzt auch die Zinkkonzentration in Alveolen gemessen werden. Im biologischen Millieu können Proteine und Ionen auf der Oberfläche der Nanopartikel adsorbieren und dadurch deren Aufnahme in die Zelle beeinflussen. Deshalb wurde die zelluläre Aufnahme in Abhängigkeit der Proteinhülle (Korona) bei in vitro Bedingungen untersucht. Tragen die Partikel eine Korona, ist bei allen untersuchten Metalloxid-Nanopartikeln eine geringere zelluläre Konzentration zu beobachten und gleichzeitig sind weniger Nanopartikel auf der Zelloberfläche adsorbiert. Die Aufnahme von CeO2 und ZnO wurde näher untersucht, da ZnO als einziger untersuchter Nanopartikel einen deutlichen toxischen Effekt hervorruft und CeO2 durch die hohe Ausbeute des Rückstreusignals und die starke zelluläre Aufnahme zum näheren Studium der Aufnahme besonders geeignet ist. Es wurde beobachtet, dass CeO2 und ZnO im extrazellulären Raum mit Phosphat und Kalzium aus dem Kulturmedium kolokalisiert sind. Da Kalziumphosphat als Transfektionsagenz bekannt ist, kann diese Modifikation der Partikeloberfläche die Aufnahme der Partikel begünstigen. Im Vergleich zu CeO2, ist bei ZnO auf Grund der erhöhten Toxizität keine Sättigung der zellulären Konzentration zu erkennen. Daneben lässt die die Halbierung der zellulären CeO2-Konzentration nach 72 Stunden Applikationszeit darauf schließen, dass die Zellen in der Lage sind die Nanopartikel durch Exozytose wieder abzugeben. Mit Hilfe von Inhibitoren wurde der Aufnahmemechanismus von CeO2-NP untersucht. Dabei zeigte sich, dass CeO2 Nanopartikel durch Caveolae- bzw. Clathrin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose aufgenommen werden. Die Internalisierung von CeO2 und ZnO Nanopartikeln wurde mit Hilfe des zellulären Protonen-Rückstreusignals untersucht. Internalisierte Nanopartikel liefern im Vergleich zu extrazellulär assoziierten Nanopartikeln ein Rückstreusignal bei niedrigeren Energien, da die zurückgestreuten Protonen durch die Passage des Zellmaterials zusätzlich Energie verlieren. Bei diesen Untersuchungen wurde festgestellt dass, ZnO und CeO2-Nanopartikel ohne Proteinhülle häufiger an der Zelloberfläche lokalisiert sind und zu einer höheren zellulären Konzentration führen. Sowohl im Lungengewebe als auch bei gedehnten primären Typ 2 Pneumozyten und kultivierten Lungenepithelzellen zeigte sich eine sehr inhomogene zelluläre Konzentrationsverteilung der Nanopartikel. Hier liegt die Stärke der Ionenstrahlmikroskopie darin, die Konzentration in einzelnen Zellen bzw. Alveolen erfassen zu können. Dadurch erlaubt es diese Methode, das Risiko abzuschätzen, was durch die Extrembelastung in einzelnen Zellen entstehen könnte. Da Lungengewebe aus Typ I und Typ II Pneumozyten besteht und Makrophagen in das Gewebe einwandern können, ist es in zukünftigen Experimenten notwendig die einzelnen Zelltypen zu markieren, um die Nanopartikel-Aufnahme im Lungengewebe mit den Ergebnissen der Zellkultur besser vergleichen zu können. Durch eine Markierung mit Gold-konjugierten Antikörpern, kann erreicht werden, die einzelnen Zelltypen mittels Ionenstrahlmikroskopie zu identifizieren. Durch verschiedene Applikationsformen bei in vitro und in vivo Untersuchungen ist die Wirkung der Nanopartikel nur schwer vergleichbar. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit das Konzept der effektiv wirksamen zellulären Dosis eingeführt. Dieses erlaubt es, der Dosis, welche tatsächlich zellulär oder im Gewebe vorhanden ist, einen toxischen Effekt der Nanopartikel zuzuordnen. Dadurch kann die effektive Dosis als wichtige Größe zum systematischen Vergleich von toxikologischen Studien auf in vitro und in vivo Basis eingesetzt werden. Die Ionenstrahlmikroskopie ist zur Zeit die einzige Methode, welche für die intrazelluläre Quantifizierung von unmarkierten Nanopartikeln auf Einzelzellebene in Frage kommt. Deshalb ist sie als zukünftige Referenzmethode für die Dosimetrie von Nanopartikeln sehr gut geeignet.

Die Arbeit hatte zum Ziel, ein In-vitro-Infektionsmodell für den protozoären Durchfallerreger Cryptosporidium parvum zu optimieren und dahingehend zu testen, ob es für eine quantitative Beurteilung der Infektiosität von Kryptosporidienoozysten eingesetzt werden kann. Die verwendeten Oozysten wurden zuvor im Zuge einer Passagierung im Kalb vermehrt, aus dem Kot isoliert, aufgereinigt und zur Infektion einer humanen ileocaecalen Adenokarzinomzelllinie (HCT-8) verwendet Die Kultivierung erfolgte über 48 Stunden in Mikrotiterplatten mit jeweils 24 Kavitäten. Die DNA infizierter Zellen und nichtinfizierter Kontrollen wurde anschließend isoliert und die parasitenspezifische DNA in der real-time PCR quantifiziert. Die gewählten Primer-Sonden-Kombinationen erlaubten eine spezifische Amplifikation der Erreger-DNA. In der Optimierung wurden das Brilliant®QPCR Core Reagent Kit, der ABsoluteTMQPCR sowie zwei verschiedene Oligonukleotidkombinationen untersucht. Durch die Klonierung einer Sequenz im Target-Gen und die Herstellung einer Titrationsreihe aus dieser klonierten DNA gelang es, den für die Vergleichbarkeit unerlässlichen homogenen Standard zu gewinnen. Der In-vitro-Vitalitätsassay wurde außerdem auf seine praktische Anwendbarkeit hin geprüft. Es wurde einerseits eine Desinfektionsmittelprüfung mit Chlorokresol (Neopredisan®135-E), andererseits ein Versuch zur thermischen Inaktivierung, beide unter Nutzung dreier verschiedener C. parvum-Chargen (LE-06-Cp-05/0, LE-07-Cp-05/2 vom Isolat A, LE-06-Cp-05/2 vom Isolat B), vollzogen. Die Überbewertung der Infektiosität der Oozysten durch die Betrachtung der Exzystierung konnte anhand der parallel zur DNA-Quantifizierung ermittelten Exzystierungsraten gezeigt werden. Die Exzystierungshemmung lag in jedem Versuch deutlich unter den in der real-time PCR berechneten Inaktivierungsraten. Je nach verwendeter Oozystencharge lieferte die Desinfektion mit 4 % Neopredisan®135-E Inaktivierungsraten, die zwischen 90 und 100 % bei einstündiger Einwirkzeit lagen. Mit steigender Dauer der Inkubation stieg erwartungsgemäß auch der Grad der Inaktivierung. Die Anwendung der 1 %igen Verdünnung resultierte in einer deutlich gesteigerten Exzystierungsrate gegenüber der unbehandelten Kontrolle sowie in stark variierenden Inaktivierungsraten (24 - 91,5 %). Es konnte gezeigt werden, dass mit Neopredisan®135-E unter den gewählten Inkubationsbedingungen zwar eine gute, aber keine vollständige Inaktivierung der C. parvum-Oozysten erfolgt. Eine suboptimale Wirkung zeigte sich in einer hohen Varianz der Einzelmesswerte. Die Vitalitätsraten betrugen nach einstündiger Inkubation der Oozysten bei 38°C noch 100 %, nach 24 Stunden waren diese bereits auf 5 - 23 % abgesunken. Es scheint, als würden mesophile Verhältnisse die Exzystierung der Sporozoiten anregen und bei längerer Konditionierung eine Erschöpfung des Stoffwechsels der Entwicklungsstadien herbeiführen. Die Inaktivierungsrate bei 55°C lag zwischen 96 und 100 %. Bei thermophiler Konditionierung wurde in drei von sieben Fällen, nach der Inkubation in Neopredisan®135-E nur in einer der sieben Untersuchungen ein vollständiger Vitalitätsverlust beobachtet. Die vorgestellte Methode erwies sich als gut reproduzierbar, sensitiv und schnell. Die In-vitro-Kultivierung des Erregers C. parvum ließ sich mit der real-time PCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubte, gut in Einklang bringen. Die Verwendung der In-vitro-Kultur als lebendes System ließ eine gewisse Variabilität der Ergebnisse zwischen einzelnen Untersuchungen erwarten, die sich aber in einem akzeptablen Bereich bewegten. Eine weitere Optimierung im Sinne einer Sensitivitätssteigerung bei akzeptabler Störanfälligkeit und Variabilität ist anzustreben.

HINTERGRUND: Die Adipositas ist eines der bedeutendsten Gesundheitsprobleme des 21. Jahrhunderts und steht in engem Zusammenhang mit einer erhöhten Gesamtmortalität und -morbidität, die häufig durch kardiometabolische Folgeerkrankungen verursacht werden (Blüher, 2019; Branca et al., 2007; Flegal et al., 2013; Kitahara et al., 2014; World Health Organization, 2005). Aus dieser Problematik ergibt sich ein erhebliches Interesse an robusten Prädiktoren zur Risikostratifzierung und klinischen Verlaufsbeobachtung Adipositas-assoziierter Stoffwechseleffekte. Die Quantifizierung und Verteilungsanalyse des viszeralen und subkutanen Fettdepots gelten dabei als äußerst vielversprechend. In vorangegangenen Studien wurden vorrangig repräsentative Einzelschichtmessungen betrachtet, was jedoch zu uneinheitlichen Ergebnissen führte (Abate et al., 1997; Gronemeyer et al., 2000; Idoate et al., 2011; Irlbeck et al., 2010, 2018; Kuk et al., 2010; Schweitzer et al., 2015; Schwenzer et al., 2010; Springer et al., 2012). Zudem konzentrierten sich die meisten Studien nur auf das viszerale Fettgewebe (VAT) und die Skelettmuskulatur (SM) bei Patienten mit BMI Werten unter 30 kg/qm. Eine große Herausforderung stellt die Quantifizierung des abdominellen subkutanen Fettgewebes (ASAT) bei hochgradig adipösen Patienten mit großem abdominellem Diameter dar, da die Messfeldbreite der MRT-Geräte meist auf 50-55 cm beschränkt ist und laterale oder ventrale Anteile teilweise nicht erfasst werden können. Es besteht daher ein erheblicher Bedarf an zuverlässigen Methoden zur Quantifizierung des ASAT, insbesondere bei Patienten mit höhergradiger Adipositas. ZIELSETZUNG: Ziel dieser Studie war die Entwicklung und Bereitstellung einer zuverlässigen und klinisch praktikablen Methode zur MRT-gestützten Quantifizierung des ASAT bei adipösen Patienten. Dazu wurden folgende Arbeitsschritte definiert: [I] Identifizierung einer repräsentativen MRT-Einzelschicht, [II] Evaluierung partieller Volumina, partieller Flächen und Strecken als Surrogate bei unvollständiger Erfassung ventrolateraler Anteile, [III] Evaluierung gängiger anthropometrischer Parameter zur Prädiktion des ASAT und [IV] Bestimmung allgemeiner, geschlechtsspezifischer Konversionsfaktoren. MATERIAL/METHODEN: Die Patienten wurden innerhalb von klinischen Studien des IFB AdipositasErkrankungen der Universitätsmedizin Leipzig rekrutiert und gemäß des Studienprotokolls im MRT untersucht. Nach Datenauswertung wurden die jeweiligen Ergebnisse in eine Datenbank eingetragen. Für die vorliegende Arbeit wurden retrospektiv MRT-Datensätze von 447 adipösen Patienten betrachtet. Bei 254 dieser Patienten (57%) war das ASAT im ventrolateralen Bereich unvollständig erfasst und konnte daher nicht genau quantifiziert werden. Zum Einschluss kamen somit 193 Patienten (116 Frauen, 77 Männer). Nach semiautomatischer Segmentierung der ASAT-Grenzen zwischen Beckenboden (BB) und Zwerchfell (ZF) wurden folgende Surrogatparameter als mögliche Prädiktoren für das gesamte ASAT-Volumen untersucht: - Referenz V(ASAT ): vollständig gemessenes ASAT-Volumen aus allen segmentierten (axialen) Einzelschichten zwischen ZF und BB - Einzelschichten: geschätztes ASAT-Volumen aus der segmentierten Fläche einer Einzelschicht auf Höhe von L1/L2 bis L5/S1 [A(L1-S1)], des Bauchnabels [A(UM)], der Spinae iliacae anteriores superiores [A(SIAS)] bzw. der Femurköpfe [A(FH)] - Strecken: geschätztes ASAT-Volumen aus einer dorsalen [d(dor-lat)] bzw. ventralen [d(ven)] Streckenmessung - Partialflächen: geschätztes ASAT-Volumen aus einer partiell segmentierten Fläche, mit lateraler Begrenzung durch die Femurköpfe [PA(FH)] bzw. die Spinae iliacae anteriores superiores [PA(SIAS)] - Partialvolumina: geschätztes ASAT-Volumen aus einem lateral durch die Femurköpfe [PV(FH)] bzw. die Spinae iliacae anteriores superiores [PV(SIAS)] und axial durch BB und ZF begrenzten Teilvolumen - Anthropometrie: geschätztes ASAT-Volumen aus einem anthropometrischen Parameter [BMI, Hüftumfang (HC), Taillenumfang (WC), Waist-to-Hip Ratio (WHR), Waist-to-Height Ratio (WHtR) bzw. Hip-to-Height Ratio (HHtR)] Aus Surrogaten abgeschätzte und vollständig gemessene ASAT-Volumina wurden statistisch miteinander verglichen. Die deskriptiven Daten wurden mittels Bestimmtheitsmaß (R2), Pearson-Korrelationskoeffizient (rp) sowie Mittelwert (d) und Standardabweichung (sd) der Messwertdifferenzen dargestellt. Die einfache lineare Regressionsanalyse zwischen dem vollständig gemessenen ASAT-Volumen (Referenz) und den eingeführten Surrogatparametern ergab neben dem Bestimmtheitsmaß die jeweilige Steigung m und den y-Achsenabschnitt b, welche entsprechend der linearen Gleichung V~ASAT (p)=m*p+b als Konversionsfaktoren für die Abschätzung des ASAT-Volumen (V~ASAT) dienen. ERGEBNISSE: Die R2-Werte zwischen lumbosakralen Einzelschichtmessungen und V(ASAT ) lagen zwischen 0,60 und 0,90 für Frauen - mit bester Übereinstimmung bei A(L5/S1). Bei den Männern lag R2 zwischen 0,72 und 0,92 mit höchster Korrelation etwas kranialer [A(L4/L5)]. Eine aggregierte Betrachtung beider Geschlechter favorisierte A(L5/S1) mit R2=0,92 und sd=9,2 %. Bei Männern befand sich der zweitgrößte, bei Frauen der drittgrößte ASAT-Anteil auf Bauchnabelhöhe entsprechend gut korrelierte A(UM) bei beiden Geschlechtern mit V(ASAT). d(ven) war mit einem R2 von 0,54 gegenüber d(dor-lat) (R2=0,47) leicht überlegen, wenngleich auf mäßigem Niveau. Sehr ähnliche Ergebnisse zeigten die dorsalen Flächen PA(FH/SIAS) mit R2-Werten leicht unterhalb von 0,5 (R2=0,47). Die stärkste Übereinstimmung mit V(ASAT) wurde erwartungsgemäß für dorsale Partialvolumina beobachtet mit leichter Präferenz von PV(FH) (R2=0,78) gegenüber PV(SIAS) (R2=0,69). Der direkte Vergleich mit d(dor-lat/ven) und PA(FH/SIAS) favorisierte PV(FH) als bestes Surrogat zur Abschätzung von V(ASAT). Der BMI erreichte mit einem R2 von knapp 0,5 (R2=0,47) und einer einfachen Standardabweichung von 26,8 % äquivalente Ergebnisse wie d(dor-lat) und PA(FH/SIAS). Übergreifend betrachtet war der BMI den bildgebenden Surrogaten A(L1-S1)/A(UM/SIAS/FH) und PV(FH/SIAS) deutlich unterlegen. Der Hüftumfang korrelierte vergleichsweise stark mit V(ASAT). Der Taillenumfang zeigte für Männer mit R2=0,58 und sd=26,0 % eine akzeptable Übereinstimmung mit V(ASAT), jedoch nicht für beide Geschlechter gemeinsam betrachtet (R2 0,23). Die WHR erwies sich als unbrauchbar (R2=0,05), die WHtR erreichte darüber hinaus schlechtere Ergebnisse als die zuvor betrachteten MRT-Einzelschichten, BMI oder der Hüftumfang. Einzig die HHtR erreichte eine gute Korrelation (R2=0,53) vergleichbar mit d(ven) und marginal besser als PA(FH/SIAS) und d(dor-lat). EMPFEHLUNGEN: Bei vollständiger Darstellung des abdominellen SAT auf axialen Einzelschichten ist eine Messung auf Höhe L4/L5 bei Männern und L5/S1 bei Frauen die Methode der Wahl zur Abschätzung von V(ASAT). Gemeinsam betrachtet ist L5/S1 zu favorisieren. Bei unklarer sagittaler oder coronarer Zuordnung bestimmter Wirbelkörperhöhen eignet sich eine umbilikale Einzelschichtmessung zur ASAT-Quantifizierung, einhergehend mit einer akzeptablen Einschränkung der Genauigkeit. Im Falle einer unvollständigen Darstellung ventraler oder lateraler SAT Anteile, insbesondere bei höhergradiger Adipositas, bietet sich das dorsale Partialvolumen PV(FH) als geeignetes Surrogat zur Abschätzung von V(ASAT) an. Der wesentliche Nachteil aller anthropometrischen Parameter ist deren Unfähigkeit in der Differenzierung einzelner Fettkompartimente. Sollten MRT-gestützte Verfahren jedoch zu aufwändig erscheinen oder nicht möglich sein, so empfehlen sich die Messung des Hüftumfangs oder die Bestimmung der HHtR zur Abschätzung des V(ASAT).:Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Motivation 1.2 Zielsetzung 2 Material und Methoden 2.1 Design 2.2 Patientenkollektiv 2.3 MRT-Protokoll 2.4 Prädiktoren 2.4.1 Einzelschichten 2.4.2 Strecken, Partialflächen und -volumina 2.4.3 Anthropometrische Parameter 2.5 Software zur semiautomatischen Bildsegmentierung 2.6 Statistische Auswertung 3 Ergebnisse 3.1 Konversionsfaktoren 3.2 Einzelschichten 3.2.1 Geschlechtsspezifische ASAT-Verteilung 3.2.2 Bandscheibenfach L4/L5 3.2.3 Bandscheibenfach L5/S1 3.2.4 Umbilikus 3.2.5 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 3.3 Strecken, Partialflächen und –volumina 3.3.1 ddor-lat/ven: Strecken 3.3.2 PAFH/SIAS: Partialflächen 3.3.3 PVFH/SIAS: Partialvolumina 3.3.4 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 3.4 Anthropometrische Parameter 3.4.1 BMI 3.4.2 Umfangsmessungen 3.4.3 Quotienten 3.4.4 sd: Standardabweichung der Messwertdifferenzen 4 Diskussion 4.1 Einzelschichten 4.1.1 Literaturvergleich 4.1.2 ASAT-Verteilung: Sexueller Dimorphismus 4.1.3 Lumbosakrale Einzelschichten – Exzellentes Surrogat zur Abschätzung des abdominellen SAT 4.1.4 Umbilikale Einzelschicht: Einfach lokalisierbare Alternative bei fehlender Schnittbildanalyse 4.2 Strecken, Partialflächen und -volumina 4.2.1 Literaturvergleich 4.2.2 Dorsale Partialvolumina bei ventrolateralen Bildartefakten 4.2.3 Dorsale Partialflächen erlauben keine verlässlichen Vorhersagen 4.2.4 Einfache Streckenmessungen: Klinisch praktikabel und vergleichsweise genau 4.3 Anthropometrische Parameter 4.3.1 BMI als grober Richtwert – keine Aussage zu individueller Körperzusammensetzung 4.3.2 Umfangsmessungen zeigen stärkeren Zusammenhang bezüglich subkutaner Fettgewebsverteilung 4.3.3 Quotienten: HHtR ist anderen Quotienten deutlich überlegen 4.4 Empfehlungen 4.4.1 Lumbosakrale Einzelschichtmessungen – Reliable Methode abdomineller Fettquantifizierung 4.4.2 Adipositasbildgebung: Partialvolumina und ventrale Streckenmessungen bei unvollständiger Erfassung ventrolateraler ASAT-Anteile 4.4.3 Anthropometrische Parameter – ungenau bezüglich abdomineller Fettverteilung 4.5 Methoden 4.5.1 MRT-gestützte Fettgewebsquantifizierung 4.5.2 Statistische Auswertung und Konversionsfaktoren 4.6 Ausblick 4.6.1 Akkurate Bildgebungsmethoden für Forschungszwecke bevorzugt 4.6.2 Monitoringparameter bariatrischer Studien 4.6.3 Unabhängiger prädiktiver Faktor onkologischer Grunderkrankungen 4.7 Limitationen 5 Zusammenfassung der Arbeit 6 Literaturverzeichnis 7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 8 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 9 Danksagung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Algorithmus zur semiautomatischen Detektion von pathologischen, skelettalen Mehranreicherungen in der 18F-FDG-PET entwickelt, der gleichzeitig als Grundlage für die Ermittlung des metabolischen, skelettalen Tumorvolumens diente. Hierzu wurden PET/CT-Datensätze von Kindern und Jugendlichen, die an einem Hodgkin-Lymphom erkrankt waren und im Zeitraum von 2007 bis 2013 in der EuroNet-PHL-C1-Studie behandelt wurden, analysiert. Bei 142 Kindern war im Rahmen einer zentralen Referenzbeurteilung im PET/CT ein Skelettbefall diagnostiziert und dokumentiert worden. Auf dieser Basis (Goldstandard) erfolgte die Testung verschiedenster Methoden, von denen sich die nachfolgende als die am besten geeignete erwies: Als Referenzregion zur Bestimmung eines physiologischen Stoffwechselniveaus im Skelett (SUVmean) wurde eine 15 bis 30 ml große VOI in einem nach visueller Einschätzung nicht tumorbefallenen Wirbelkörper (meist LWK 4) platziert. Auf Grundlage des damit ermittelten physiologischen Skelettstoffwechselniveaus identifizierte das Suchprogramm skelettale Läsionen, sofern diese einen SUV > (SUVmean + 2,5 SD) aufwiesen. Dieser in das Programm implementierte Algorithmus wurde an den PET/CT-Datensätzen der 142 Patienten mit visuell detektiertem Skelettbefall validiert. Dabei wurde ein Skelettbefall bei 130 von 142 Patienten (Sensitivität auf Patientenebene von 91,5 Prozent) programmbasiert korrekt diagnostiziert. Von 1015 visuell erfassten skelettalen Läsionen wurden 774 durch das Suchprogramm richtig erkannt (Sensitivität auf Regionenebene von 76,3 Prozent). Von 5375 nicht befallenen Regionen wurden 5137 korrekterweise auch nicht als Läsionen durch das Programm angezeigt (Spezifität auf Regionenebene von 95,6 Prozent). Das Ausmaß das Skelettbefalls in Form des metabolischen, skelettalen Tumorvolumens wurde mit dem ereignisfreien Überleben und dem Gesamtüberleben verglichen: Es ergab sich keine Korrelation. Die Arbeit umfasst 156 Seiten, 59 Abbildungen, 31 Tabellen und 96 Literaturangaben.

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Vitales Knochengewebe ist ständigen Umbauprozessen unterworfen. Entsteht ein Defekt, wird der Knochen durch neugeformte Strukturen repariert. In diesen Prozess sind verschiedene Zelltypen involviert, darunter Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten (Teitelbaum, 2000a; Ross und Christiano, 2006; Zhang et al., 2012). In der Wiederherstellungs-Chirurgie ist Knochenersatz von großer Bedeutung, wenn schwere skelettale Schäden auftreten (Onoda et al., 2011). Auto- als auch Allotransplantationen von Knochengeweben sind aufgrund der guten osteoinduktiven und biochemischen Eigenschaften noch immer der Goldstandard (Parikh, 2002; Sen und Miclau, 2007; Zhang et al., 2012). Aufgrund der Knappheit der zur Verfügung stehenden muskuloskelettalen Spendermaterialien und der zugleich steigenden Anzahl von notwendigen Knochenmaterialtransplantationen wird vermehrt nach Materialersatz gesucht. Der ideale Knochentransplantatersatz ist biokompatibel, bioresorbierbar, dirigiert die Richtung der Knochenneubildung (osteokonduktiv), regt die Knochenneubildung an (osteoinduktiv), ist strukturell knochenähnlich, einfach anzuwenden und kosteneffektiv (Greenwald et al., 2001; Parikh, 2002; Chim und Schantz, 2005; Zhang et al., 2012). Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Gebiet der Wissenschaft, welches die Prinzipien des Ingenieurwesens und der Biowissenschaften auf die Entwicklung biologischer Ersatzmaterialien anwendet, die für die Wiederherstellung, Erhaltung oder Verbesserung von Gewebe- oder Organfunktionen eingesetzt werden (Langer, 1993; Nerem und Sambanis, 1995). Langfristig sollen für die Implantation geeignete Systeme entwickelt oder in vivo Geweberemodelling ermöglicht werden. Hauptkomponente des Tissue Engineering ist der Einsatz lebender Zellen und/oder extrazellulärer Matrixbestandteile in der Entwicklung solcher Systeme und Konstrukte, die implantiert zur Wiederherstellung oder zum Ersatz der biologischen Funktionen führen. Um das biologische Verhalten der Konstrukte kontrollieren zu können, erfordert die Entwicklung das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von Zellen, Geweben und Organen. Die extrazelluläre Matrix der biologischen Systeme ist ebenfalls von großer Bedeutung, da sie ihre mechanischen Eigenschaften bestimmt. Chemische und strukturelle Stabilität sind weitere notwendige Eigenschaften, um das Überleben der Zellen nach der Implantation in der in vivo Umgebung zu gewährleisten (Nerem und Sambanis, 1995). Denkansätze im Tissue Engineering beinhalten die Nutzung von Scaffolds, Zellen und deren Kombination. Häufigster Ansatz ist der Einsatz resorbierbarer oder biologisch abbaubarer Scaffolds, die an die Umgebung des lebenden Gewebes angepasst sind und mit lebenden Zellen besiedelt werden können. Die Zellen proliferieren und organisieren sich in der dreidimensionalen Struktur des Scaffolds und beginnen mit der Produktion adäquater extrazellulärer Matrix. Während der Formierung, Ablagerung und Organisation der neu generierten Matrix wird die Startmatrix des Scaffolds abgebaut, resorbiert und metabolisiert (Nerem und Sambanis, 1995; Stock und Vacanti, 2001). Die Zellen differenzieren sich auf dem Scaffold zu den gewünschten Organ- beziehungsweise Gewebezellen bevor die in vitro besiedelten Matrizen implantiert werden. Am Ende des Prozesses ist ein lebendes Gewebe oder Organ entstanden, welches die Funktion des Gewebes / Organs im Körper erhält, wieder herstellt oder verbessert. Das Risiko immunologischer Abwehrreaktionen, ebenso wie das Risiko viraler Infektionen wird beim Tissue Engineering durch den Einsatz autologer Spenderzellen umgangen. Die eingesetzten Scaffolds müssen zudem biokompatibel sein und den nutritiven als auch biologischen Ansprüchen der spezifischen Zellpopulation gerecht werden, die in der Gewebeformation involviert ist (Stock und Vacanti, 2001). Ein weiterer Ansatz ist es, Zellen von biologischer Matrix enzymatisch oder durch Detergenzien zu entfernen und diese dezellularisierte Matrix anschließend zu verwenden. Es handelt sich dabei um allogenes oder xenogenes Gewebe. Diese Matrix ist dann theoretisch biologisch abbaubar beziehungsweise resorbierbar und müsste sich gut für die Besiedlung mit Zellen eignen. Alternativ werden artifizielle Matrizen im Tissue Engineering eingesetzt (Stock und Vacanti, 2001; Heinemann et al., 2011). In Abbildung 1.1 ist das Prinzip des Tissue Engineering dargestellt (Drosse et al., 2008). Bei der Therapie von Knochendefekten in lasttragenden Regionen werden häufig nichtresorbierbare Materialien wie Metalle und Keramiken eingesetzt (Navarro et al., 2008). Der Einsatz von resorbierbaren Materialien ist erstrebenswert, da sich diese nach der Transplantation in den Prozess des Knochenremodellings integrieren und somit mit der Zeit durch körpereigenes Material ersetzt werden (Hutmacher, 2000; Boccaccini und Maquet, 2003; Navarro et al., 2008). Damit erlangt der Knochen langsam seine natürlichen biomechanischen Eigenschaften zurück (Baron, 1995; Teitelbaum, 2000b). Wichtig ist jedoch, dass die Resorption und der Ersatz durch körpereigenes Knochenmaterial ausgewogen stattfinden, sodass die mechanische Stabilität des Gewebes gewährleistet ist. Daher sind Untersuchungen zur Resorption von Biomaterialien von großer Bedeutung, bevor diese in der Klinik in vivo zum Einsatz kommen (Zhang et al., 2012). Osteoklasten sind für die Resorption von Knochen verantwortliche Zellen, weshalb sie in Zellexperimenten zur Untersuchung von Resorption eingesetzt werden. Typische Untersuchungsmethoden zum Nachweis von osteoklastärer Aktivität sind die Feststellung von Vielkernigkeit, die genanalytische Bestimmung von tartratresistenter saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) (Minkin, 1982; Ek-Rylander et al., 1991; Ljusberg et al., 2005; Detsch et al., 2010b), Carboanhydrase II (CAII) (Lehenkari et al., 1998; Detsch et al., 2010b; Schilling et al., 2004), Kathepsin K (Bossard et al., 1996; Littlewood-Evans et al., 1997; Votta et al., 1997; Söderström et al., 1999; Dodds et al., 2001; Ljusberg et al., 2005), des Kalzitoninrezeptors und des Vitronektinrezeptors (Detsch und Boccaccini, 2014; Blair, 1998; Schilling et al., 2004). Die enzymatische Messung von TRAP 5b (Halleen et al., 2000; Janckila et al., 2001) und CAII (Detsch et al., 2010a) und die Bestimmung der Kalziumkonzentration im Überstand der Zellkulturen (Neutzsky-Wulff et al., 2010; Reichert et al., 2013) sind weitere Marker, die zur Beschreibung osteoklastärer Zelldifferenzierung genannt wurden. Zudem können Kollagenspaltprodukte im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (Karsdal et al., 2003; Neutzsky-Wulff et al., 2010). Eine weitere große Rolle bei Resorptionsuntersuchungen an Biomaterialien spielt die Analyse von Resorptionspits. Allerdings gibt es hierbei einige Nachteile. Die mikroskopische Beurteilung der Resorptionslakunen ist sehr zeitaufwändig und kostenintensiv. Zudem ist eine sehr geringe Rauigkeit des eingesetzten Materials nötig, um die Resorption mikroskopisch anhand von Resorptionslakunen zu quantifizieren, da die Messmethoden die resorbierte Fläche und das resorbierte Volumen relativ zur originalen Oberflächenbeschaffenheit ermitteln. Ideal ist hierbei eine Rauigkeit von unter 1 m (Zhang et al., 2012) damit zwischen bereits vorher existierenden strukturellen Unebenheiten und neu entstandenen Pits unterschieden werden kann. Zudem können bisher bekannte Resorptionsassays nur die Resorption auf glatten Knochenstrukturen imitieren. Im Körper machen hingegen der trabekuläre oder spongiöse Knochen den größten Anteil aus, allerdings sind solche Strukturen in vitro schwer zu imitieren und Resorptionsstudien dazu sind noch nicht sehr zuverlässig (Zhang et al., 2012). Auf unregelmäßigen oder porösen Materialien können bisher noch keine quantifizierenden Aussagen über die Resorption gemacht werden. Die Motivation dieser Arbeit war es, biochemische Verfahren für die Quantifizierung von osteoklastärer Resorption zu entwickeln. Während die biochemischen Messungen der Aktivitäten von TRAP 5b und CAII bereits als osteoklastäre Marker eingesetzt werden, sollte hier erstmals die enzymatische Aktivität von Kathepsin K biochemisch bestimmt werden. Dazu wurden Osteoklasten auf verschiedenen Materialien kultiviert und untersucht. Durch biochemische Analyse sollten dann Rückschlüsse auf die Resorptionsaktivität der Zellen gezogen werden. Das Fernziel dieser Arbeit ist, das Resorptionsverhalten von Osteoklasten auf Biomaterialien zu quantifizieren, sodass die zeit- und kostenintensive mikroskopische Beurteilung ersetzt werden kann. Ein Schritt auf dem Weg zu diesem Ziel ist es, die Osteoklastogenese auf den Modellsubstraten genauer zu untersuchen und herauszufinden, wie die in vitro Resorption auf den verschiedenen Substraten beeinflusst werden kann. Die gemessenen Enzymaktivitäten sollten schließlich mit der Resorptionsaktivität der Osteoklasten in Korrelation gebracht werden.