The ubiquitin-proteasome system regulates protein degradation. Although proteasomes localize in the nucleus of proliferating Saccharomyces cerevisiae, they are sequestered into cytoplasmic proteasome storage granules (PSG) in quiescence. Although important for cell cycle regulation and mediating external stressors, the content and structure of these membraneless PSGs remain unknown. Yeast deletion genetic screens identified several ubiquitin-related genes involved in proteasome sequestration into PSGs. This study aims to determine whether changes in free ubiquitin levels or ubiquitin post-translational modifications affect proteasome dynamics in quiescence. Unlike the wild-type, PSGs were not seen in catalytically inactive Ubp6 mutant strains in quiescence and proteasomes failed to be imported into the nucleus upon the resumption of cell growth. Although no significant differences in proteasome configurations were observed, Western blot analysis of these mutants suggests the presence of post-translationally modified monoubiquitinated proteasomes in quiescence. Ubiquitin modification may target proteasomes towards lysozomal degradation rather than into PSGs for storage.

Schizosaccharomyces pombe devient de plus en plus un système modèle pour étudier la régulation de l'expression des gènes et des protéines dans les processus impliqués dans le développement de cancers et de maladies génétiques. Ces travaux peuvent servir à étudier les propriétés putatives de la protéine humaine HID1 à empêcher des tumeurs de se former. J'ai utilisé la technique RNAseq pour révéler les changements d'expression des gènes sur les cellules de S. pombe dont sont absentes trois gènes orthologues du gène humain HID1: hid1+, hid2+ et hid3+. Des mutants ont été créés par remplacement de gènes et testés pour découvrir leurs propriétés de croissance. La croissance du mutant hid2Δ semblait meilleure tandis que celle de hid3Δ semblait plus lente que les contrôles. La morphologie cellulaire de chaque mutant était normale. La microscopie à transmission électronique a révélé que l'appareil de Golgi était fortement modifié dans hid3Δ. RNAseq a montré que plus de 500 gènes étaient exprimés différentiellement dans hid3Δ. Les changements d'expression indiquaient des cellules sous tension. Par ailleurs, un jeu défini de facteurs de transcription et un groupe de gènes encodant des protéines situées et sécrétées ont été introduits, ce qui suggère que la perturbation de la fonction protéique au niveau de la membrane plasmique a un effet feedback sur la régulation de l'expression des gènes. J'émets l'hypothèse que la croissance lente de hid3Δ s'explique par un état cellulaire de quiescence partielle. Aussi, S. pombe ont été séquencées et révèlent l'expression de petits ARN non codants spécifiques, dont des introns complets et d'autres ARN non codants non annotés. / Schizosaccharomyces pombe has become increasingly a model system to study the regulation of gene expression, stress signaling and metabolic and protein changes for processes implicated in the development of cancer and genetic diseases. This work was started to determine if S. pombe could be used to study the putative anti-tumor forming properties of the human HID1 protein. I employed the NGS technology RNAseq to reveal gene expression changes to the cells of S. pombe lacking three orthologues of the human HID1 gene, hid1+, hid2+ and hid3+. Mutants lacking these genes were created by gene replacement and tested for growth properties. The mutant hid2Δ appeared to grow better and hid3Δ grew more slowly than WT controls. The cell morphology of each mutant was normal and lengths and widths were unchanged. Transmission electron microscopy revealed that the Golgi apparatus was greatly modified in hid3Δ but not in other genotypes. RNAseq showed that under standard growth conditions more than 500 genes were differentially expressed in hid3Δ. Expression changes were indicative of cells under stress. Also, a defined set of transcription factors and a group of genes encoding proteins located in the plasma membrane and secreted were induced, suggesting that disruption of protein function at the plasma membrane feeds back to regulate gene expression. I hypothesize that slow growth of hid3Δ is due to a partial quiescent cell state. To start investigating mechanisms regulating gene expression, small RNA libraries of the size of S. pombe introns were sequenced and revealed the expression of specific small non-coding RNAs, including full introns and other un-annotated non-coding RNAs.

Growth arrest specific (GAS) genes are highly inducible at quiescence (G0) and repressed rapidly in response to mitogens. Aberrant disruption of quiescence can lead to abnormal development and diseases such as cancer, thus, it is important to study the signals and mechanisms responsible for expressions of quiescent specific genes. p20K, a GAS gene whose expression is highly induced in conditions of contact inhibition & hypoxia in chicken embryo fibroblasts (CEF), is studied in this thesis. Preliminary studies demonstrate that p20K activation is dependent on its Quiescence Responsive Unit (QRU), a 48bp promoter region. In addition, the binding sites of a CCAAT/enhancer binding protein (C/EBPβ) and ERK2 on the QRU of p20K promoter overlap with each other regulating the competition between activating (C/EBPβ) and inhibiting (ERK2) of the p20K gene. After culturing CEF with media rich in growth factors (10%FBS), p20K induction is delayed in hypoxia. Moreover, it is the decrease of Phospho-ERK not CHOP level that correlates with p20K inhibition in hypoxia in both 5%CCS and 10%FBS. Western blotting analysis of Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF1α) expression indicated that this hypoxia-response factor is induced rapidly and with the same kinetics in CEF subjected to hypoxia cultured in 5%CCS or 10%FBS, indicating that they sense and respond similarly to low oxygen concentrations. These results suggest that p20K induction in hypoxia is caused by growth arrest induced by hypoxia. To further document this process, hypoxia mimicking reagent DMOG, a prolyl-hydroxylase inhibitor that can stabilize HIF in normoxia, was used. Interestingly, p20K expression was highly induced after DMOG treatment in CEF, even if CHOP, an inhibitor of C/EBPβ, was induced in these conditions. Co-Immunoprecipitation results showed that the accumulation of CHOP-C/EBPβ heterodimers was induced during DMOG treatment. Additionally, Proliferation Assay suggested that DMOG treatment significantly inhibited CEF proliferation. Finally, Chromatin Immunoprecipitation Analysis indicated that ERK-2 did not bind to the QRU after DMOG treatment, indicating that ERK-2 dissociation correlates with p20K induction in response to DMOG in CEF. Collectively, these results demonstrate that growth arrest induced by hypoxia or DMOG treatment plays a determinant role in p20K induction. In contrast, CHOP level or CHOP-C/EBPβ heterodimer reduction did not correlate with the induction of p20K. / Thesis / Master of Science (MSc)

Le gène H19, soumis à l’empreinte parentale, est fortement exprimé durant le développement embryonnaire, cependant, son expression est réprimée après la naissance dans l’ensemble des tissus à l’exception du muscle squelettique, et plus particulièrement des cellules souches musculaires : les cellules satellites. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du gène H19 dans la mise en place et dans la fonction de ces cellules souches durant la myogénèse adulte. En utilisant un modèle murin présentant une délétion du gène H19, les souris H19∆3, notre laboratoire avait montré que le gène H19 est capable de moduler, dans le muscle embryonnaire, l’expression de neuf gènes appartenant à un réseau de gènes soumis à l’empreinte parentale (IGN) impliqué dans la croissance. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le phénotype des muscles de ces souris mutantes qui présentent une hyperplasie et une hypertrophie des fibres musculaires. Ce phénotype est accompagné d’une diminution du nombre de cellules satellites qui apparait lors de l’entrée en quiescence de ces cellules. De façon étonnante, nous avons observé une meilleure capacité de régénération, malgré le nombre réduit de cellules satellites, dans les muscles H19∆3 comparée à celle des muscles wt. Cela indique que la capacité d’auto-renouvellement des cellules satellites n’est pas influencée par l’absence du gène H19. De même, nous avons observé une surexpression de plusieurs gènes appartenant à l’IGN lors de la régénération musculaire des muscles mutants comparés aux muscles wt. Ces résultats indiquent que le gène H19 module l’expression des gènes de l’IGN durant l’embryogénèse et par la suite, durant les étapes de régénération de la myogénèse adulte. / The imprinted H19 gene is highly expressed during embryonic development. H19 is fully repressed after birth in all tissues, with the exception of skeletal muscle, and especially of the muscle stem cells: the satellite cells. The aim of my thesis was to define the function of the H19 gene in the satellite cells establishment and function during adult myogenesis. Using loss-of-function H19∆3 mice, the laboratory had shown that the H19 gene was able to modulate the expression of several genes belonging to an imprinted gene network (IGN) in the embryonic muscle. During my thesis, I studied the muscle phenotype of these adult mice, which present both fiber hyperplasia and hypertrophy. This phenotype is accompanied by an important reduction of the satellite cell number, probably due to a delay in their entry into quiescence. Unexpectedly, despite the reduction in the number of satellite cells in mutant mice, the self-renewal capacity of the satellite cells is fully retained. In addition, we observe a better regeneration potential of the mutant muscles compared with wt muscles. This is accompanied by the enhanced expression of several genes from the IGN. These results indicate that H19 gene can modulate IGN gene expression both during embryogenesis and after birth, in adult myogenesis.

Les lymphocytes T (LT) perçoivent et intègrent en permanence des signaux solubles et cellulaires, conditionnant leur comportement et leur devenir. A l’état de repos, les propriétés des LT s’appuient sur un réseau moléculaire caractéristique, au sein duquel les facteurs de transcription FoxOs jouent un rôle majeur. En effet, ces derniers sont impliqués dans le maintien de la quiescence et de la capacité circulatoire des LT, de par le profil transcriptionnel qu’ils induisent. Nous avons identifié Fam65b comme une nouvelle cible transcriptionnelle de FOXO1. D’un point de vue fonctionnel, nous avons démontré que Fam65b régule négativement le seuil de prolifération des LT en réponse à une stimulation du récepteur à l’antigène (TCR) ou du récepteur aux chimiokines CCR7. In vivo, dans un modèle de souris transgénique pour le TCR, ces caractéristiques fonctionnelles se traduisent par une réponse secondaire plus efficace en absence de Fam65b. Physiologiquement, la moindre expression de Fam65b que nous avons observé dans les LT mémoires par comparaison aux LT naïfs corrèle avec leur plus grande réactivité. L’ensemble de ces résultats suggère que Fam65b pourrait être un marqueur fonctionnel des LT mémoires. Enfin, nous avons pu démontrer que les effets fonctionnels de Fam65b résultent d’une inhibition de l’activité de RhoA.Fam65b est donc un régulateur de la quiescence et de la migration des LT. De par son rôle de régulateur de l’activité de RhoA, Fam65b constitue un nouveau lien fonctionnel entre deux familles majeures, contrôlant la physiologie des LT : les Rho-GTPases et les FoxOs. / T cells continually sense numerous soluble and cellular signals, which determine their behavior and differentiation pattern. At the steady state, lymphocytes properties rely on a specific network, in which FoxOs transcription factors play a central role. Indeed, FoxOs-induced transcriptome is involved in the maintenance of T cell quiescence and circulation.We identified a new transcriptional target of FoxO1 named Fam65b. We show that Fam65b acts as a brake on T lymphocyte activation downstream of the T cell receptor. Functionally, we demonstrate that Fam65b negatively regulates the threshold of T cell activation downstream of TCR or CCR7 stimulation. These characteristics allow a more efficient secondary response as Fam65b expression is inhibited. Physiologically, the lower expression of Fam65b in memory T cells compared to naïve T cells takes part in their enhanced reactivity. This suggests that Fam65b could be a functional marker of memory T cells. Finally, we demonstrated that the role of Fam65b is mediated by an inhibition of RhoA activity. Therefore, Fam65b is a regulator of T cell quiescence and migration. Because he regulates the activity of RhoA, Fam65b constitutes a functional link between two major families of proteins which control T cell physiology: Rho GTPases and FoxOs.

Un certain nombre de régions du cerveau des vertébrés, y compris chez l’homme, continuent d’être le siège de l’ajout de nouveaux neurones à l’âge adulte. Ces nouveaux neurones sont produits à partir de cellules spécialisées, appelées cellules souches neurales (CSN). Celles-ci sont capables de s’auto-renouveler et sont principalement trouvées dans un état d’arrêt transitoire du cycle cellulaire que l’on appelle quiescence. A l’heure actuelle, les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant aux CSN de trouver un équilibre entre maintien et différentiation, ainsi que les règles générales gouvernant l’évolution de leur population, ne sont que partiellement compris. A l’échelle moléculaire, plusieurs facteurs et voies de signalisation apparaissent déterminants pour l’homéostasie des CSN. Notamment, la voie de signalisation du récepteur Notch s’avère essentielle pour maintenir à la fois l’état de quiescence et le caractère souche des CSN. Il demeure néanmoins inconnu si la signalisation Notch affecte ces deux propriétés de manière indépendante ou non. A l’échelle cellulaire, la plupart des modèles actuels suggèrent que les CSN se divisent rarement et principalement de manière asymétrique. Cette dernière propriété permettrait aux CSN de se perpétuer tout en donnant naissance à des cellules filles déterminées à se différencier en neurones. Le pallium du poisson-zèbre abrite une population particulièrement importante de CSN, que l’on appelle glies radiaires (GR), et qui possèdent les mêmes caractéristiques fondamentales que leurs homologues chez les mammifères. Notre laboratoire avait précédemment démontré que le récepteur Notch3 était nécessaire au maintien de la quiescence des GR. Le travail présenté dans ce manuscrit se décompose en deux études complémentaires dont les objectifs respectifs étaient: (1) d’améliorer notre compréhension du rôle de la voie de signalisation Notch3 dans l’homéostasie des GR et (2) d’étudier les schémas de divisions adoptés par les GR afin de maintenir leur nombre sur une longue durée. Dans la première étude, nous démontrons que le rôle de la signalisation Notch3 s’étend au-delà du simple contrôle de la quiescence des GR en contribuant également au maintien de leur caractère souche par l’intermédiaire de son gène cible hey1. Un point important de cette découverte est que l’action du facteur Hey1 sur le caractère souche des GR apparaît indépendante du rôle de Notch3 dans le maintien de leur quiescence. Dans la seconde étude, nous avons réalisé une analyse clonale du devenir des GR exprimant le gène her4.1. Ceci nous a permis de mettre en évidence que leurs choix entre différentiation, amplification et auto-renouvellement apparaissent stochastiques, mais équilibrés, ce qui leur permet de maintenir leur population dans le temps. De façon très intéressante, nous avons aussi observé que le nombre total de GR du pallium augmente au cours de la vie, ce qui, au regard du comportement homéostatique de la population de GR exprimant her4.1, nous amène à proposer que la zone neurogénique du pallium est organisée selon une hiérarchie dans laquelle une population inconnue de progéniteurs produit continuellement de nouvelles GR, qui ensuite se maintiennent grâce à un équilibre probabiliste entre leurs différents lignages. / New neurons continue to be added into discrete brain regions of most adult vertebrate species, including humans. Adult born neurons arise from precursor cells, called neural stem cells (NSCs), endowed with self-renewal potential and mostly found in a state of reversible cell cycle arrest, named quiescence. Currently, the molecular, cellular and population rules allowing NSC to balance maintenance and differentiation remain incompletely understood. At the single cell level, several factors and signalling pathways were demonstrated to be essential for NSC homeostasis. Among them, the Notch signalling pathway is critically involved in the control of NSC quiescence and stemness. However, whether these two properties represent molecularly distinct or overlapping outputs of the Notch signalling pathway remains unknown. At the cellular level, current models state that NSCs divide rarely and mostly asymmetrically, allowing both self-renewal and the generation of a more committed progeny that ultimately exits the cell cycle and fulfils neuronal differentiation. The adult zebrafish pallium harbours NSCs, called radial glia (RG), which share with their mammalian counterparts the same basic properties. Previously, our laboratory demonstrated that Notch3 was necessary to maintain RG quiescence. Here, in two different and complementary works, we took advantage of the widespread neurogenic ventricular zone (VZ) of the adult zebrafish pallium to (1) explore further the role of Notch3 signalling in RG homeostasis and (2) investigate the division pattern and dynamics allowing the RG population to be maintained on the long run. In the first study, we demonstrate that the role of Notch3 signalling extends beyond the simple maintenance of RG quiescence and that Notch3 also contributes to RG stemness. By overlapping the transcriptomic profiles of both notch3 mutant RG and adult pallial VZ progenitors, we identified different sets of Notch3 target genes potentially responsible for its pleitropic effect in RG. Notably, we show that the Notch3 signalling contribution to RG stemness critically relies on the transcriptional activation of its canonical target gene hey1 and this, independently of Notch3 action on RG quiescence. In the second study, we performed a quantitative analysis of the fates of individual her4.1(Hes5)-expressing RG. We demonstrate that these cells adopt balanced stochastic fates, which allows their population to reach homeostasis. We also report that the overall RG population of the zebrafish pallium continues to grow during adulthood and that this expansion is very likely driven by a yet undefined upstream population of progenitors. As a consequence, we propose that the adult zebrafish is organised into a hierarchy of progenitors dominated by an unknown population that fuels the ongoing production of an intrinsically homeostatic population of RG which, itself, follows neutral drift dynamics.

La mitochondrie forme un réseau dynamique de tubules, dont la morphologie et la distribution sont étroitement régulées. Les mitochondries sont des organelles à double membrane dont l’architecture interne est complexe. Les crêtes mitochondriales forment des invaginations de la membrane interne. Elles sont le lieu des phosphorylations oxydatives, réactions par lesquelles l’ATP synthase produit l’ATP. L’ATP synthase est également connue pour son rôle clé dans la morphogenèse des crêtes. Dans cette étude j’ai mis en évidence in vivo la localisation en cluster de l’ATP synthase au sein du réseau mitochondrial de S. cerevisiae se développant sur substrat fermentescible. Mes résultats suggèrent que ces clusters correspondent aux crêtes mitochondriales, ce qui ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude du remaniement de la membrane interne.La morphologie du réseau mitochondrial est maintenue par un équilibre entre les processus de fusion et de fission des tubules mitochondriaux. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai mis en évidence une fragmentation progressive du réseau mitochondrial lors de l’entrée des cellules en quiescence, un état cellulaire non prolifératif réversible. En quiescence, le réseau mitochondrial est constitué de petites vésicules sous corticales immobiles au contenu enzymatique variable. Lors d’un retour à l’état prolifératif ces vésicules fusionnent rapidement pour reformer un réseau tubulaire, et ce, avant l’émergence de la cellule fille. De façon surprenante j’ai mis en évidence que ni les machineries canoniques de fusion ou de fission, ni le cytosquelette d’actine ne sont requis lors du remaniement du réseau mitochondrial dans les transitions entre prolifération et quiescence. / Mitochondria form a dynamic tubular network which organization and distribution is highly regulated.Mitochondria are double membrane organites with a complex internal architecture. Cristae, which areinner membrane invaginations, are the site of oxidative phosphorylation, reactions by which ATP synthaseproduces ATP. ATP synthase also play a key role in cristae morphogenesis. In this study, I have shown thatATP synthase localized as discrete clusters along the mitochondrial network in living S. cerevisiae cellsgrown on a fermentable carbon source. Overall our data suggest that ATP synthase clusers correspond tomitochondrial cristae, opening new avenues to explore the mechanisms involved in inner membraneremodelling.Mitochondrial network morphology is regulated by a dynamic equilibrium between the fusion and fissionof mitochondrial tubules. In the second part of my thesis, I highlight a progressive mitochondrialfragmentation during quiescence establishment, a state defined as a reversible absence of proliferation.Quiescent cells mitochondrial network is composed of immobile small cortical mitochondrial vesicles witha variable enzymatic content. Upon quiescence exit, cortical mitochondrial vesicles rapidly fuse and atubular network is reconstituted prior to bud emergence. Astonishingly, neither the canonical fusion orfission machineries nor the actin cytoskeleton are required for the mitochondrial network modificationduring quiescence / proliferation transition.

Quiescence is a non-proliferative cellular state that is critical to tissue repair and regeneration. Although often described as the G0 phase, quiescence is not a single homogeneous state. As cells remain quiescent for longer durations, they move progressively deeper and display a reduced sensitivity to growth signals. Deep quiescent cells, unlike senescent cells, can still re-enter the cell cycle under physiological conditions. Mechanisms controlling quiescence depth are poorly understood, representing a currently underappreciated layer of complexity in growth control. Here, we show that the activation threshold of a Retinoblastoma (Rb)-E2F network switch controls quiescence depth. Particularly, deeper quiescent cells feature a higher E2F-switching threshold and exhibit a delayed traverse through the restriction point (R-point). We further show that different components of the Rb-E2F network can be experimentally perturbed, following computer model predictions, to coarse-or fine-tune the E2F-switching threshold and drive cells into varying quiescence depths.

Radial chromosome positioning in interphase nuclei is non-random and can alter according to developmental, differentiation, proliferation or disease status. The aim of this thesis is to understand how chromosome re-positioning is elicited and to identify the nuclear structures that assist this re-localisation event. By positioning all human chromosomes in primary fibroblasts that have left the proliferative cell cycle, the study within this thesis has demonstrated that in cells made quiescent by reversible growth arrest, chromosome positioning is altered considerably. Upon removal of serum from the culture medium, chromosome re-positioning took less than 15 minutes, required energy and was inhibited by drugs affecting the polymerization of myosin and actin. The nuclear distribution of nuclear myosin 1β was dramatically different in quiescent cells as compared to proliferating cells. If the expression of nuclear myosin 1β was suppressed using interference RNA procedures the movement of chromosomes after 15 minutes in low serum was inhibited. When high serum was restored to the serum starved cultures chromosome repositioning was only evident after 24-36 hours that coincided with a return to a proliferating distribution of nuclear myosin 1β.

Une tumeur est composée de plusieurs sous populations cellulaires. L’une d’entre elles, celle des cellules souches tumorales, est à l’origine du développement des tumeurs. Une des propriétés majeures de ces cellules est la capacité d’entrer dans un état de quiescence. De ce fait, elles sont résistantes aux thérapies anticancéreuses conventionnelles qui visent les cellules cyclantes et peuvent ainsi persister pendant de nombreuses années. Ce phénomène est appelé dormance tumorale. L’activation de ces cellules souches tumorales quiescentes conduit à la récidive de la maladie. Le passage de l’état quiescent à l’état activé serait réversible, cependant les mécanismes responsables ne sont pas encore connus. Notre hypothèse est que les facteurs inflammatoires stimulent la transition des cellules de l’état quiescent à l’état activé. Dans ce but, nous avons étudié les effets de la principale cytokine pro-inflammatoire, le TNF, sur le compartiment des cellules souches de mélanome et leur activation. Pour cela, nous avons utilisé un système d’expression, inductible par la tétracycline, qui nous a permis d’identifier et d’étudier les cellules quiescentes H2B-GFP positives et cela dans les modèles in vitro des mélanosphères et des équivalents de peaux humaines reconstruites, afin de se rapprocher de l’organisation tumorale in vivo. Grâce à des tests fonctionnels, comme la formation de mélanosphères et de colonies, et diverses techniques telles que la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence et l’analyse de l’expression de gènes au niveau protéique, nous avons mis en évidence que les cellules H2B-GFP positives (« label retaining cells ») au sein des mélanosphères montrent un enrichissement en marqueurs de cellules souches du mélanome (ABCB5, VEGFR). De plus, nous avons montré que le TNF agit sur le compartiment des cellules souches. En effet, un traitement au TNF augmente le pourcentage de cellules exprimant des marqueurs de cellules souches de mélanome, inhibe la différenciation des cellules de mélanome (inhibition de l’expression de Melan-A dans les mélanosphères et diminution de la pigmentation des équivalents de peau), active les cellules souches quiescentes et induit des effets qui perdurent après le retrait du TNF. Notre étude a montré que ces effets seraient causés par une activation des voies PI3K/Akt et NFκB par le TNF. Un grand nombre de données suggérant qu’une sous-population de cellules cancéreuses est capable d’entrer en quiescence en réponse à une thérapie anticancéreuse, nous avons également étudié les effets de la première thérapie ciblée du mélanome : le vemurafenib, sur le compartiment des cellules souches. Nos résultats ont montré que le vemurafenib augmente le compartiment des cellules souches de mélanome (augmentation du nombre de mélanosphères formées et du pourcentage de cellules exprimant un marqueur de cellules souches de mélanome : ABCB5) et induit leur quiescence (augmentation du pourcentage de cellules H2B-GFP+ et en phase GO du cycle cellulaire). Nous avons également montré que le vemurafenib stimule l’activation de protéines régulant la quiescence des cellules souches.Nous espérons que nos recherches apporteront de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui contrôlent l’activation des cellules souches cancéreuses quiescentes et offrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer. / Accumulating data suggest that both cancer development and recurrence depend on the ability of resistant tumor cells to adopt a quiescent or dormant phenotype following treatment. These dormant cells reside in various tissues of patients in complete remission without any clinical manifestation until they reactivate and cause tumor recurrence. Mechanisms that control the activation of quiescent tumor cells remain poorly understood, however, the tumor microenvironment, cellular interactions and various diffusible factors appear essential. Herein, our goal is to decipher whether a major pro-inflammatory cytokine, Tumor Necrosis Factor (TNF) contributes to the quiescence/activation phenotypic switch in melanoma. For this purpose, we used a 3D melanosphere and the in vivo-like skin equivalent models in which to reconstitute the in vivo-relevant cellular heterogeneity and tumor organization and an inducible histone 2B coupled to the GFP (H2B-GFP) expression system to identify the quiescent cell compartment and to monitor the TNF-induced changes. Our results suggest that TNF increases the proportion of H2B-GFP-positive, label retaining cells (LRC) in melanospheres. The LRCs were enriched in melanoma stem cell markers, ABCB5 and VEGFR and this was upregulated by TNF. Furthermore, TNF increases the number of melanospheres, and in skin equivalents, the presence of TNF seems to inhibit the differentiation of melanoma cells and increase the stem cell compartment. This effect appears to be governed by the activation of the PI3K / Akt pathway. In conclusion, these data show that inflammatory environment induced by TNF, activates melanoma quiescent stem cells and increases the compartment of stem cells in skin equivalents by preventing their differentiation. Therefore, the control of inflammation and signaling pathways involved in the maintenance of tumor dormancy during the treatment of the original tumor would be a good therapeutic strategy in the fight against cancer recurrences.A lot of data suggest that a cancer cell subpopulation is able to enter quiescence in response to cancer therapy, therefore we have also studied the effects of the first targeted therapy of melanoma: vemurafenib, on the stem cell compartment. Our results show that vemurafenib increases the number of melanospheres and the percentage of ABCB5+ cells. So vemurafenib increases the melanoma stem cell compartment. Vemurafenib increases also the percentage of H2B-GFP + cells and the percentage of cells in the GO phase of the cell cycle, so induces quiescence of melanoma cells. We also showed that vemurafenib stimulates activation of proteins regulating quiescence of stem cells.We hope that our research will provide new knowledge about the mechanisms that control the activation of quiescent cancer stem cells and provide new perspectives for the treatment of cancer.