Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique.

La mucoviscidose est la maladie génétique létale la plus fréquente dans les populations d’origine Caucasiennes et résulte de mutations du gène CFTR. Bien que de nombreux travaux aient permis de comprendre le mode de synthèse et de maturation de la protéine ainsi que la fonction du canal CFTR, les mécanismes qui contrôlent l’expression de ce gène restent peu connus. En effet, le gène CFTR est finement régulé au niveau tissulaire et au cours du développement pulmonaire. Le contrôle de cette expression nécessite le recrutement d’éléments régulateurs qui modulent à la fois l’activité de son promoteur et la stabilité de son transcrit en contexte physiologique et lors de stress cellulaires induits par la pathologie. Le premier travail a été d’identifier en contexte physiologique des régulateurs, incluant des facteurs de transcription et des miARNs, qui participent à la répression de l’expression du gène CFTR dans des cultures pulmonaires fœtales et matures. La détermination d’éléments cis répresseurs a permis le développement d’outils capables de stabiliser les transcrits CFTR. Grâce à l’utilisation d’oligonucléotides modifiés bloquant la fixation des miARNs sur le transcrit CFTR, nous avons montré dans un modèle ex vivo issu de patients CF, une augmentation du taux d’ARNm et de la quantité de protéines CFTR (p.Phe508del) ainsi qu’une restauration de l’activité du canal muté. Le second travail fait suite à l’exploration du locus CFTR, par des séquenceurs de deuxième génération, des régions non codantes incluant les introns, séquences encore peu étudiées à ce jour. Sur une cohorte de patients CF chez qui une seule mutation avait été identifiée, nous avons détecté de nouvelles mutations affectant l’épissage à travers l’insertion d’un exon cryptique. L’utilisation d’oligonucléotides modifiés, spécifiquement localisés sur les introns ciblés, a permis de restaurer la séquence normale des transcrits. Enfin, dans le but d’identifier de nouveaux miARNs qui participent à la physiopathologie CF, le profil d’expression des miARNs a été évalué à partir de différents épithéliums respiratoires (polypes, nez, bronches) issus d’individus sains où atteints de mucoviscidose. La caractérisation d’éléments cis- et trans-régulateurs est essentielle pour poursuivre la compréhension des mécanismes impliqués dans l’expression du gène CFTR ainsi que pour déterminer de nouvelles cibles pour combattre la mucoviscidose. / Cystic Fibrosis is the most frequent lethal genetic disease in the Caucasian populations and results from CFTR gene mutations. Many studies improved the understanding of CFTR biogenesis and CFTR channel function, however the mechanisms driving the expression of this gene remains neglicted. CFTR gene displays a tightly regulated tissue-specific and temporal expression in the lungs. This regulation requires the recruitment of regulatory elements which modulate, the activity of CFTR gene transcription and the stability of its transcript, in both physiological and cellular stress conditions.Firstly, we identify regulators, including transcription factors and miRNAs, which contribute to the CFTR gene repression in pulmonary mature cells compared to fœtal cultures. Determination of cis-repressors elements led to the development of oligonucleotides that block specifically the binding of miRNAs on the CFTR transcrits and that stabilize it. Administration of these modified oligonucleotides, in a ex-vivo model taken from CF patients, increased CFTR mRNA level, p.Phe508del proteins amount, as well as restored CFTR channel activity.Secondly, by using a next generation sequencing approach, we explored the entire CFTR locus, including introns poorly studied. In CF patients in whom only one mutation had hitherto been identified, we found the second disease-causing CFTR mutation that results in aberrantly spliced transcripts due to the inclusion of a pseudoexon in the mature transcripts. We next tested the effect of pseudoexon skipping mediated by antisense oligonucleotides targeting splice sites on two of them. Our findings result in the restoration of the full-length, in-frame CFTR transcript, demonstrating the effect of antisense oligonucleotide-induced pseudoexon skipping in CF. Finally, in order to identify new miRNAs deregulated in CF and to determine their involvement in CF physiopathology, miRNA expression profiling was carried out in three airway epitheliums (polyps, nose, bronchi) taken from healthy individuals and CF patients.Characterization of cis- and trans-regulatory elements offers new understanding of the control of the CFTR gene regulation and new therapeutic targets for Cystic Fibrosis.

La régulation de l’expression génique chez les mammifères dépend de l’organisation tridimensionnelle des chromosomes, en particulier à l’échelle des communications entre les séquences régulatrices et leurs promoteurs cibles. Ainsi, les chromosomes sont organisés en une nouvelle architecture consistant en domaines d’interactions topologiques (TADs, acronyme anglais). Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans cette architecture et leurs importances au cours du développement embryonnaire, pour un locus bien particulier, le Xic (acronyme anglais pour X-inactivation centre). Le Xic contient les éléments régulateurs nécessaires pour initier l’inactivation du chromosome X (ICX), un phénomène épigénétique spécifique du développement des mammifères femelles, rendant l’un des deux chromosomes X inactif du point de vue transcriptionnelle. L’ICX permet d’égaliser l’expression des gènes liés au X entre les sexes chez les mammifères. Le Xic est organisé au moins en deux TADs mais une partie du locus reste encore non identifiée. Je présente ici une analyse fonctionnelle approfondie des différents éléments régulateurs au sein du Xic, comprenant des enhancers, des gènes d’ARNs non codants et des éléments structurels. Après avoir créé une série d’allèles mutés chez la souris et les cellules souches embryonnaires murines, j’ai caractérisé l’impact de ces réarrangements génomiques sur le paysage structurel et transcriptionnel du Xic. J’ai identifié des nouveaux acteurs dans la régulation de ce locus, en particulier des séquences régulatrices conservées chez les mammifères placentaires et des éléments structurels importants pour la formation d’une frontière entre les deux TADs du Xic, importante pour leur séparation et régulation. Je décris aussi la découverte de communication entre ces TADs, ce qui constitue un mécanisme inédit de régulation génique pendant le développement. Ce travail contribue à un nouveau niveau de compréhension des lois qui régissent l’organisation des TADs dans le contexte de la régulation génique chez les mammifères. / Mammalian gene regulatory landscapes rely on the folding of chromosomes in the recently discovered topologically associating domains (TADs), which ensure appropriate communication between cis-regulatory elements and their target promoters. The aim of my PhD project was to characterise the molecular mechanisms that govern this novel architecture and its functional importance in the context of a critical and developmentally regulated locus, the X-inactivation centre (Xic). The Xic contains the necessary elements to trigger X-chromosome inactivation, an epigenetic phenomenon that occurs during the development of female mammals to transcriptionally silence one of the X-chromosomes and equalise X-linked gene expression between sexes. The Xic is partitioned into at least two TADs, but its full extent is unknown. Here, I present a comprehensive functional analysis of different cis-regulatory elements within the Xic, including enhancer-like regions, long noncoding RNA loci and structural elements. Upon generating a series of mutant alleles in mice and murine embryonic stem cells, I characterised the impact of these genomic rearrangements in the structural and transcriptional landscape of the Xic and identified novel players in the regulation of this locus, including cis-acting elements conserved across placental mammals and structural elements critical for the insulation between the Xic TADs. I also found evidence for communication across TADs at this locus, which provides new insights into how regulatory landscapes can work during development. This study also extends our understanding of the rules governing the organisation of TADs and their chromatin loops in the context of mammalian gene regulation. / Nos mamíferos, a regulação da expressão genética depende da organização tridimensional dos cromosomas, em particular ao nível da comunicação regulatória entre promotores e enhancers. A esta escala, descobriu-se recentemente que os cromossomas estão organizados em domínios de interações topológicas (conhecidos como TADs, no acrónimo inglês) que se pensa providenciarem uma base estrutural para as paisagens de regulação transcricional dos genes. O meu projecto de tese teve como objectivo caracterizar os mecanismos moleculares responsáveis por esta arquitectura e a sua importância funcional no contexto de um locus crítico para o desenvolvimento embrionário, o centro de inactivação do cromossoma X (Xic, acrónimo inglês). O Xic contém os elementos genéticos necessários e suficientes para iniciar a inactivação do cromossoma X, um fenómeno epigenético que ocorre durante o desenvolvimento das fêmeas de mamíferos para silenciar um dos cromosomas X e igualar a expressão dos genes do X entre indivíduos XX e XY. O Xic está organizado em pelo menos dois TADs, mas o seu intervalo genético completo permanece desconhecido. Apresento nesta tese uma análise funcional e detalhada de diferentes sequências reguladoras presentes no Xic, incluindo regiões do tipo enhancer, genes de ARNs não codificantes e elementos estruturais. Após a criação de diversos alelos mutantes (deleções, inserções, inversões) em ratinho e em células estaminais embrionárias, através das recentes técnicas de engenharia genética, TALENs e CRISPR/Cas9, caracterizei o impacto destes rearranjos genéticos na paisagem topológica e transcricional do Xic, o que permitiu a identificação de novos actores moleculares na regulação deste locus. Em particular, descobrimos sequências de regulação transcricional altamente conservadas em mamíferos placentários e elementos estruturais importantes para a formação da fronteira entre os dois TADs do Xic. Descrevo também evidência de que há comunicação entre os dois TADs neste locus, o que compromete os modelos actuais do modus operandis dos TADs, e por isso contribui para um novo nível de compreensão dos mecanismos que regulam a expressão genética durante o desenvolvimento.