L’intégrité des gènes de la famille FANC est essentielle au bon fonctionnement de la réparation des dommages à l’ADN. Récemment, différents variants d’épissage du gène FANCC ont été identifiés. Nous avons donc étudié l’impact du transcrit alternatif sur le processus de réparation des bris de l’ADN. Le transcrit FANCCΔ7 est présent dans toutes les lignées de cancer du sein analysées. L’analyse des fractions ribosomales confirma la traduction de FANCCΔ7 en protéine fonctionnelle. La protéine FANCCΔ7 semble séquestrée dans le cytoplasme des cellules HEK293T transfectées suite à un traitement à la MMC comparé à FANCC qui migre majoritairement au noyau. Nous avons démontré que les cellules déficientes infectées avec FANCCΔ7 sont bloquées en G2/M en présence de MMC. Finalement, FANCCΔ7 est incapable de mener à la monoubiquitination de FANCD2. Cette étude a permis de déterminer que le variant d’épissage FANCCΔ7 ne permet pas la réparation des pontages interbrins induits par la MMC.

Dans le cadre de la gestion du cycle de vie d’une application, la création de correctifs de bugs est une des tâches les plus importantes. Or celle-ci prend aussi le plus de temps, non seulement parce qu'il est difficile de créer un bon correctif, mais également parce qu'elle nécessite des interventions humaines. Un utilisateur doit en effet signaler le bug et le développeur doit le reproduire et le corriger, processus long et fastidieux. Il existe des techniques qui automatisent cette tâche mais elles exigent toujours l’intervention humaine à savoir qu'un développeur crée un test reproduisant le bug, exigence qui réduit considérablement leur applicabilité. Dans le cadre de cette thèse, nous proposons une nouvelle approche qui supprime cette exigence en créant de nouvelles techniques de génération de correctifs. Notre approche repose sur l'idée de rapprocher le plus possible la génération de correctifs de l'environnement de production. En effet c’est celui-ci qui contient toutes les données et toutes les interactions humaines qui mènent aux bugs. Au cours de cette thèse, nous présentons comment exploiter ces données pour détecter les bugs, comment générer les correctifs et comment les valider, le tout sans l'intervention d'un développeur. Nous évaluons notre approche sur sept jeux différents de correctifs réels provenant de projets open-sources en veillant, entre autres, à être particulièrement attentifs au nombre de correctifs générés, à leur validité ainsi qu’au temps requis pour leur génération. Ces évaluations démontrent l'applicabilité et la faisabilité de notre approche dans la génération de correctifs en production sans l'intervention d'un développeur. / Patch creation is one of the most important actions in the life cycle of an application. Creating patches is a really time-consuming task. Not only because it is difficult to create a good and valid patch, but also because it requires the intervention of humans. Indeed, a user must report the bug and a developer must reproduce it and fix it, which takes a lot of time. To address this problem, techniques that automate this task have been created but those techniques still require a developer to create a test that reproduces the bug. This requirement drastically reduces the applicability of the approach since it still relies on the human. This thesis proposes new patch generation techniques that remove the human intervention for the generation of patches. Our idea is to put as close as possible the generation of patches to the production environment. We adopt this approach because the production environment contains all the data and human interactions that lead to the bug. During this thesis, we present how to exploit this data to detect bugs, generate and validate patches without the intervention of developers. We evaluate this approach on seven different benchmarks of real bugs collected from open-source projects. During the evaluation, we are particularly attentive to the number of generated patches, the correctness and the readability of the generated patches and the time required for generating them. Our evaluation shows the applicability and feasibility of our approach to generate patches in the production environment without the intervention of a developer.

La spermatogenèse est un processus complexe permettant la génération de gamètes mâles ultra spécialisés, les spermatozoïdes. Plusieurs réorganisations successives de l'ADN sont essentielles pour la génération de gamètes mâles haploïdes, dont l'enjambement durant la méiose. La dernière étape de la spermatogenèse, la spermiogenèse, comporte une importante réorganisation nucléaire accompagnée de nombreuses cassures bicaténaires d'ADN, ce qui pourrait mener à une instabilité génétique, surtout dans ce contexte haploïde vulnérable. Le premier objectif de mes recherches était de mieux caractériser cette étape de remodelage chromatinien. Par une approche d'immunofluorescence, nous avons démontré la présence de l'enzyme topoisomérase IIß (TOP2B) lors du remodelage de la chromatine, ainsi qu'une réponse aux dommages à l'ADN coïncidant avec le remodelage chromatinien par l'apparition de la phosphorylation du variant d'histone H2AFX, une biomarqueur de cassures bicaténaires. II est donc fort probable que les spermatides utilisent un système de réparation propice à l'erreur, tel que la jonction terminale non-homologue (NHEJ) pour réparer les nombreuses cassures observées à ces étapes, menant possiblement à une instabilité génomique importante. Afin de mieux comprendre l'impact d'une réparation inadéquate ou d'une absence de réparation de ces cassures, nous avons voulu déterminer leur distribution sur le génome murin. Or, il n'existait aucune approche méthodologique permettant de cartographier ces cassures à l'échelle génomique. Utilisant plusieurs modèles in vitro et in vivo, nous avons mis au point une approche unique, appelée damaged DNA immunoprecipitation ou dDIP, pouvant enrichir les régions endommagée sans compromettre la résolution nucléotidique. Par la suite, nous avons mis au point une méthodologie de dDIP pour les cellules d'eucaryotes supérieurs en immobilisant les cellules dans une matrice d'agarose pour limiter l'introduction de dommages non-spécifiques. Le remodelage de la chromatine des spermatides représente une étape d'instabilité génomique encore peu explorée et pourrait s'avérer une source insoupçonnée de diversité génétique. Grâce à la création de la nouvelle méthodologie dDIP, il sera maintenant possible d'explorer l'importance des cassures transitoires observées durant ce drastique changement nucléaire pour les générations futures. De plus, cet outil peut être appliqué à différents types de dommages, tels que les dommages causés par le rayonnement ultraviolet et les dommages oxydatifs, et donc être utilisé dans l'étude de l'instabilité génomique et de la réparation de l'ADN dans de nombreux domaines scientifiques comme le cancer, la sénescence et la toxicologie.

La pulpe dentaire contient des cellules souches dormantes qui sont mobilisées suite àune lésion et participent aux processus de réparation dentinaire. L’utilisation de cellulessouches pulpaire en clinique dentaire n’est encore qu’un projet. La mise en place de nouvellesthérapies implique de caractériser ces cellules souches: (i) de définir leurs propriétésintrinsèques in vitro et (ii) leur capacité à améliorer la réparation dentaire in vivo. Un autreenjeu est d’identifier des marqueurs de ces cellules souches afin de pouvoir les localiser et lestrier au sein de la pulpe dentaire.Des lignées ayant les propriétés de cellules souches «pulpaires» ont été établies aulaboratoire à partir de la pulpe de molaires d’embryons de souris (ED18). Ces cellules portentla signature du lignage odontogénique, elles expriment Lhx 6 et Lhx 7, deux gèneshoméotiques qui spécifient la région du premier arc branchial à l’origine des odontoblastes.La caractérisation de ces lignées a permis d’apporter la première démonstration que descellules souches multipotentes sont présentes dans la pulpe. La lignée A4 a la capacité de sedifférencier de façon mutuellement exclusive, selon la nature des inducteurs et la géométriedes contacts intercellulaires (3D vs 2D), vers les programmes ostéogénique, chondrogénique,adipocytaire ou odontogénique. Les lignées C5 et H8 sont des cellules souches avec unpotentiel de différenciation restreint au lignage ostéo-odontogénique. Les cellules souchespulpaires expriment des marqueurs de surface communs avec les MSCs (cellules souches dela moelle). Un marqueur, CD90 (Thy 1), est absent dans les cellules multipotentes mais estexprimé par les clones qui ont des potentialités plus restreintes.Un axe in vivo a aussi permis de montrer pour la première fois que l’implantation decellules souches pulpaires dans la molaire de rat n’affecte pas la vitalité pulpaire et peutréparer une lésion dentinaire.La recherche sur les cellules souches dentaires est toujours confrontée à l’absence deconnaissances concernant la localisation, l’identité et les propriétés intrinsèques des cellulesqui participent à la formation de dentine réparatrice. En exploitant ces cellules pulpaires, nousavons récemment mis en évidence que l’inactivation de la voie Wnt canonique est une étapenécessaire à la transition entre l’état «cellule souche» et la «détermination» vers le lignageodontogénique. Cette observation a été validée in vivo: l’implantation d’un activateurpharmacologique de la voie Wnt, (le BIO) inhibe la formation «naturelle» de dentineréparatrice au niveau du site de la lésion.De façon surprenante, des approches biochimiques et pharmacologiques, nous ont aussipermis de découvrir que les cellules souches pulpaires possèdent l’ensemble des fonctions desneurones sérotoninergiques et des neurones dopaminergiques, incluant l’expression d’unrépertoire bien défini de récepteurs sérotoninergiques et dopaminergiques. Une étudephénotypique de souris KO pour le récepteur sérotoninergique 5-HT2B par microCT/ imageriemontre que ce récepteur contribue à l’amélogenèse et participe au développement de la sphèrecranio-faciale.Ces travaux avec une synergie des approches in vitro-in vivo ont pour but d’apporter desbases fondamentales pour développer des approches de thérapie cellulaire en biodentisterie. / Pas de résumé en anglais

La correction d'un bogue est une activité fréquente fait dans le cycle de vie du logiciel. L'activité vise à éliminer l'écart entre le comportement attendu d'un programme et ce qu'il fait réellement. Dans les dernières années, plusieurs approches automatiques de réparation de logiciels ont vu le jour pour synthétiser automatiquement des corrections de bugs. Malheureusement, la correction de bugs pourrait être encore difficile et coûteux pour les approches automatiques programme de réparation. Par exemple, pour réparer un bogue, une approche pourrait passer un temps infini à trouver une solution auprès d'un grand nombre de candidats. Dans cette thèse, nous visons à améliorer la réparabilité de bogues: augmenter le nombre de bogues réparés par des approches de réparation. Nous visons à ajouter réparation approches des stratégies pour optimiser la recherche de solutions. Nous présentons une stratégie qui consomme informations extraites de réparations effectuées par les développeurs. Ensuite, nous nous concentrons sur l'évaluation des méthodes de réparation automatique. Nous visons à introduire des procédures pour avoir significative évaluations d'approches.Nous définissons d'abord une méthode pour définir des jeux de données de défauts qui réduisent au minimum la possibilité de résultats biaisés. La manière dont un jeu de données est construite impacts sur le résultat d'une évaluation de l'approche. Nous présentons un jeu de données qui comprend un type particulier de défaut: les défauts instructions conditionnelles. Ensuite, nous cherchons à mesurer la réparabilité de ce type de défaut en évaluant trois approches de réparation automatique du logiciel. / Bug fixing is a frequent activity done in the software life cycle. The activity aims at removing the gap between the expected behavior of a program and what it actually does. In the recent years, several automatic software repair approaches have emerged to automatically synthesize bug fixes. Unfortunately, bug fixing could be even hard and expensive for automatic program repair approaches. For example, to repair a given bug, a repair technique could spend infinite time to find a fix among a large number of candidate fixes. In this thesis, we aim at improving repairability of bugs. That is, to increase the number of bugs repaired by repair approaches. First, we concentrate on the study of repair search spaces i.e., all possible solutions for the fix. We aim at adding repair approaches strategies to optimize the search of solutions in the repair search space. We present a strategy to reduce the time to find a fix. The strategy consumes information extracted from repairs done by developers. Then, we focus on the evaluation of automatic repair approaches. We aim at introducing methodologies and evaluation procedures to have meaningful repair approach evaluations.We first define a methodology to define defect datasets that minimize the possibility of biased results. The way a dataset is built impacts on the result of an approach evaluation. We present a dataset that includes a particular kind of defect: if conditional defects. Then, we aim at measuring the repairability of this kind of defect by evaluating three state-of-the-art automatic software repair approaches.

Les mécanismes de réparation de l’ADN sont cruciaux pour la survie cellulaire. Cependant, ces mécanismes sont souvent altérés dans les processus cancéreux permettant l’accumulation de mutations et d’instabilité génétique. Plusieurs voies de réparation sont utilisées par les cellules pour réparer différents types de dommages à l’ADN. La réparation des cassures double-brin (CDB) par la Recombinaison Homologue (RH) permet de réparer fidèlement ces lésions. PALB2 est au coeur d’un réseau d’interactions protéiques comprenant BRCA1 et BRCA2. Tout comme ces dernières, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Ainsi, par ses fonctions dans la stabilité du génome et le cancer, l’étude fonctionnelle de PALB2 et la compréhension du rôle de ses domaines sont essentiels. En effet, PALB2 se lie à l’ADN, mais les mécanismes induisant sa liaison et la fonction de cette liaison sont toujours mal compris. En ce sens, nos collaborateurs ont identifié quatre principaux acides aminés dans ce domaine, comme étant importants car leurs mutations en alanine compromettent la liaison de PALB2 à l’ADN. De ce fait, mon premier objectif porte sur l’étude fonctionnelle de ce domaine de liaison à l’ADN dans la recombinaison homologue. En accord avec les essais biochimiques conduits par nos collaborateurs, notre étude in vivo a pu démontrer que la mutation de ces résidus en alanine réduit de 50% la formation de foyers RAD51 aux dommages, réduisant ainsi l’efficacité de la RH dans ces cellules. Mon deuxième objectif, vise l’établissement de modèles de létalité synthétique pour tuer les cellules déficientes en réparation de l’ADN. Le but est d’identifier de nouveaux interacteurs de PALB2 par la technique BioID et qui seraient synthétiquement létaux en combinaison avec d’autres mutations génétiques. Enfin, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP amènent à une létalité synthétique dans les cellules déficientes en PALB2. Cependant, ces études ne prennent pas en compte l’aspect tridimensionnel de la tumeur cancéreuse. C’est pourquoi, dans mon projet j’ai initié le développement de modèles 3D qui pourraient possiblement aider à l’évaluation des stratégies de létalité synthétique, se rapprochant ainsi du contexte physiologique de la tumeur.

L’ADN dans nos cellules est exposé continuellement à des agents génotoxiques. Parmi ceux-ci on retrouve les rayons ultraviolets, les agents mutagènes chimiques d’origine naturelle ou synthétique, les agents radiomimétiques, et les dérivés réactifs de l’oxygène produits par les radiations ionisantes ou par des processus tels que les cycles métaboliques redox. Parmi les dommages infligés par ces agents, les plus dangereux sont les cassures simples- et double-brin de l’ADN qui brisent son intégrité et doivent être réparées immédiatement et efficacement afin de préserver la stabilité et le fonctionnement du génome. Dans la cellule, ces cassures sont formées et réparées au niveau de la chromatine, où l'environnement moléculaire et les évènements impliqués sont plus complexes et les systèmes expérimentaux appropriés pour leur exploration sont peu développés. L’objectif de ma recherche visait ainsi l’exploration de ces processus et le développement de nouveaux modèles qui nous permettraient d’étudier plus précisément la nature de la formation et de la réparation des cassures simple- et double-brin de l’ADN in vivo. J’ai utilisé comme modèle un minichromosome (l’episome du virus Epstein-Barr) d’environ 172 kb, qui possède toutes les caractéristiques de la chromatine génomique. Nous avons observé que la radiation gamma induit un changement conformationnel de l’ADN du minichromosome par la production d’une seule cassure double-brin (CDB) localisée de façon aléatoire. Une fois linéarisé, le minichromosome devient résistant à des clivages supplémentaires et par la radiation ionisante et par d’autres réactifs qui induisent des cassures, indiquant l’existence d’un nouveau mécanisme qui dépend de la structure chromatinienne et par lequel une première CSB dans le minichromosome confère une résistance à la formation d’autres cassures. De plus, la reformation des molécules d’ADN du minichromosome surenroulées après l’irradiation indique que toutes les cassures simple-brin (CSB) et CDB sont réparées et les deux brins fermés de façon covalente. Nos découvertes indiquent que la réparation par ligature d'extrémités d'ADN non homologues est le principal mécanisme responsable de la réparation des CDB, alors que la réparation des CSB est indépendante de la polymérase poly-ADP ribose-1 (PARP-1). La modélisation mathématique de la cinétique de réparation et le calcul des vitesses de réparation a révélé que la réparation des CSB est indépendante de la réparation des CDB, et représente l’étape limitante dans la réparation complète des minichromosomes. Globalement, nous proposons que puisque ce minichromosome est comparable en longueur et en topologie aux boucles d’ADN sous contrainte de la chromatine génomique in vivo, ces observations pourraient fournir une vision plus détaillée de la cassure et de la réparation de la chromatine génomique. / DNA in our cells is exposed continually to DNA-damaging agents. These include ultraviolet light, natural and man-made mutagenic chemicals, and reactive oxygen species generated by ionizing radiation or processes such as redox cycling by heavy metal ions and radio-mimetic drugs. Of the various forms of damage that are inflicted by these mutagens, the most dangerous are the single- and double-strand breaks (SSBs and DSBs) which disrupt the integrity of DNA and have to be repaired immediately and efficiently in order to preserve the stability and functioning of the genome. In the cell, induction and repair of strand breaks takes place in the context of chromatin where the molecular environment and the events involved are more complex and suitable experimental systems to explore them are much less developed. A major focus of my research was therefore aimed towards exploring these processes and developing new models which will allow us to look more precisely into the nature of induction and repair of SSBs and DSBs in DNA in vivo. We used as a model the naturally-occurring, 172 kb long Epstein-Barr virus (EBV) minichromosome which posses all the characteristics of genomic chromatin and is maintained naturally in Raji cells. Gamma-irradiation of cells induces one, randomly-located DSB and several SSBs in the minichromosome DNA, producing the linear form. The minichromosome is then resistant to further cleavage either by ionizing radiation or by other break-inducing reagents, suggesting the existence of a novel mechanism in which a first SSBs or DSBs in the minichromosome DNA results in a conformational change of its chromatin which confers insensitivity to the induction of further breaks. Supercoiled molecules of minichromosome DNA were reformed when cells were incubated after irradiation, implying that all SSBs and DSBs were repaired and both strands were covalently closed. Using specific inhibitors or siRNA depletion of repair enzymes, we found that Non Homologous End Joining was the predominant pathway responsible for DSB repair, whereas repair of SSBs was PARP-1 independent. We could also show clearly that topoisomerases I and II are not required for repair. Mathematical modeling of the kinetics of repair and calculation of rate constants revealed that repair of SSBs was independent of repair of DSBs and was the rate-limiting step in complete repair of minichromosomes. Overall, we propose that since this minichromosome is analogous in length and topology to the constrained loops which genomic chromatin is believed to form in vivo, these observations could provide more detailed insights into DNA breakage and repair in genomic chromatin.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.

Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s'inscrit comme un élément clef dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes. L'implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux dommages à l'ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série d'analyses a démontré l'importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs d'acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l'activité catalytique de Esa1. Parallèlement, d'autres études ont permis d'approfondir la fonction du domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté directement au site de cassure de l'ADN. Des recherches menées autour de l'étude de l'activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l'implication de NuA4 dans les événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce complexe dans la réparation de l'ADN.

L'intégrité de l'ADN génomique humain est maintenue par des systèmes de réparation de l'ADN qui protègent les cellules des dommages causés par des agents environnementaux ou des lésions spontanées de l'ADN. Chaque cellule peut subir jusqu'à 10⁵ lésions par jour, y compris les cassures double-brin de l'ADN (CDB). La poly(ADPribosyl)ation (PARylation) est l'un des premiers événements de signalisation moléculaire survenant aux CDBs. Il est catalysé par les poly(ADP-ribose)polymérases (PARP) qui sont directement activées par ces lésions d'ADN. Le fait de ne pas générer de poly(ADP)ribosyl (pADPr) en réponse à des dommages à l'ADN par une inhibition chimique ou par l'absence de PARP-1 augmente la sensibilité cellulaire au stress génotoxique, indiquant que la pADPr elle-même est une molécule clé de signalisation des dommages à l'ADN. L'inhibition de l'enzyme de signalisation des dommages à l'ADN, la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des nouvelles thérapies les plus prometteuses contre le cancer. Les inhibiteurs de PARP sensibilisent les cellules cancéreuses aux agents endommageant l'ADN et tuent efficacement les cellules cancéreuses du sein, des ovaires et du pancréas déficientes en BRCA1 (Breast Cancer gene 1) et BRCA2 (Breast Cancer gene 2), ce qui suggère que les cellules déficientes en réparation des CDBs sont extrêmement sensibles à l'inhibition de PARP. Pourtant, les mécanismes sous-jacents à cette létalité synthétique entre le déficit de réparation du CDB et l'inhibition de PARP restent mal définis. Il y a un débat considérable sur le mécanisme par lequel l'inhibition de PARP tue les cellules déficientes en réparation de l'ADN, et le plein potentiel des inhibiteurs de PARP dans le traitement du cancer ne peut être obtenu que par une compréhension claire des voies de réponse aux dommages de l'ADN (DDR) aux CDB et comment ils sont affectés par les inhibiteurs de PARP. L'objectif général de ma thèse est d'étudier le rôle de PARP-1 dans la réparation DSB et d'identifier les interacteurs de PARP-1 qui jouent également un rôle dans ce processus. Les cellules eucaryotes réparent les CDBs par deux voies principales, la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). La HR est initiée par la liaison des CDBs par BRCA1 et le complexe MRE11-RAD50-NBS1 et des nucléases EXO1/DNA2 pour générer de l'ADN simple-brin, qui est ensuite utilisé par la recombinase RAD51 et le complexe BRCA1-PALB2-BRCA2. Une question clé dans notre domaine concerne les facteurs critiques pour réguler le choix de la voie CDB. HR est initiée à partir d'extrémités DSB hautement résectées, tandis que dans le NHEJ, la résection est empêchée par des facteurs de réparation clés incluant RIF1 et 53BP1. En utilisant des cellules déficientes en PARP-1, nous avons observé que deux inhibiteurs de la résection de l'ADN et des régulateurs de choix de voie, RIF1 et 53BP1, la formation de foyers induits par des dommages à l'ADN sont fortement altérés. Cela confirme notre hypothèse selon laquelle PARP-1 participe à la réparation du DSB en influençant la résection de l'ADN. Afin de mieux comprendre le mécanisme de résection et le rôle que PARP-1 y joue, nous avons identifié d'autres protéines qui interagissent avec PARP-1 et modulent ce processus. Pour ce faire, nous avons utilisé des données sur les protéines de liaison au pADPr générées à la fois dans notre laboratoire et celui de notre collaborateur Ted Dawson de Johns Hopkins. Les candidats sélectionnés à partir de ces listes ont été criblés pour identifier une seule cible qui démontrerait un phénotype similaire à la perte de PARP-1. Deux cibles initiales ont été explorées et finalement une seule protéine à doigt de zinc a été choisie comme cible principale. Nous devons relever la fonction de ce doigt de zinc en HR, dans l'espoir qu'il permettra de découvrir davantage les mécanismes de PARP-1 en résection. En résumé, cette thèse élucide le rôle de PARP-1 dans la résection de l'ADN et identifie une protéine à doigt de zinc non étudiée auparavant qui interagit avec PARP-1 et partage une fonction similaire à PARP-1 dans la résection de l'ADN. / The integrity of human genomic DNA is maintained by DNA repair systems that will protect cells from damage by environmental agents or spontaneous DNA lesions. Each cell can experience up to 10⁵ lesions daily, including DNA double-strand breaks (DSB)s. Poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation) is one of the earliest molecular signalling events occurring at DNA DSBs. It is catalysed by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) that are directly activated by those DNA lesions. Failure to generate pADPr in response to DNA damage by either chemical inhibition or absence of PARP-1 increases the cellular sensitivity to genotoxic stress, indicating that pADPr itself is a key DNA damage signalling molecule. Inhibition of the DNA damage signalling enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is among the most promising new therapies in cancer. PARP inhibitors sensitize cancer cells to DNA damaging agents and efficiently kill BRCA1- and BRCA2-deficient breast, ovarian and pancreatic cancer cells, suggesting that cells deficient in DSB repair are exquisitely sensitive to PARP inhibition. Yet, the mechanisms underlying this synthetic lethality between DSB repair deficiency and PARP inhibition remain poorly defined. There is considerable debate about the mechanism through which PARP inhibition kills DNA repair-deficient cells, and the full benefit of PARP inhibitors in cancer therapy can only be achieved by a clear understanding of the DNA damage response (DDR) pathways to DSBs and how these are affected by PARP inhibitors. The overall aim of my PhD is to investigate the role of PARP-1 in DSB repair and identify interactors of PARP-1 which also play a role in this process. Eukaryotic cells repair DSBs by two major pathways, non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). HR is initiated by the binding of DSB by BRCA1 and the end resection of the DSB by MRE11 (and the associated NBS1, RAD50, CtIP, and EXO1) to generate single-stranded DNA, which is further processed by RAD51 and BRCA1-PALB2-BRCA2. A key question in our field regards which factors are critical for regulating the DSB pathway choice. HR is initiated from highly resected DSB ends, whereas in NHEJ, resection is prevented by key repair factors that include RIF1 and 53BP1. Using PARP-1-deficient cells, we have observed that two inhibitors of DNA resection and regulators of pathway choice, RIF1 and 53BP1, are strongly impaired in forming DNA damage-induced foci. This supports our hypothesis that PARP-1 participates in DSB repair by influencing DNA resection. In order to further understand the mechanism of resection and the role that PARP-1 plays in it we also aim to identify other proteins which interact with PARP-1 and modulate this process. To accomplish this, we made use of data on PAR binding proteins generated both in our lab and that of our collaborator Ted Dawson. The candidates selected from these lists were screened to identify a single target that would demonstrate a similar phenotype to PARP-1 loss. Two initial targets were further explored and finally a single zinc finger protein was selected as our primary target. We aim to characterize the function of this zinc finger in HR, in the hopes that it will further uncover the mechanisms of PARP-1 in resection. In summary this thesis elucidates the role of PARP-1 in DNA resection and identifies a previously unstudied zinc finger protein which interacts with PARP-1 and shares a similar function to PARP-1 in DNA resection.