L'adaptation d'une bactérie aux changements de son environnement est contrôlée par un réseau de régulation large et complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs et modules différents. Dans ce travail, nous avons étudiés un module de régulation spécifique, contrôlant l'adaptation de la bactérie Escherichia coli à un changement de sources de carbone. Dans un milieu contenant du glucose et de l'acétate, la croissance est divisée en deux phases : les bactéries utilisent préférentiellement le glucose et commencent à métaboliser l'acétate qu'après l'épuisement du glucose. En effet, la présence du glucose réprime la transcription d'un gène nécessaire à la croissance sur acétate, le gène acs (codant pour l'acétyl-CoA synthétase). Le mécanisme régulateur fait intervenir le facteur de transcription Crp-AMPc et le système de transfert de phosphate (PTS), qui permet l'import du glucose. Plusieurs modèles décrivent en détail la cascade de réactions moléculaires à l'origine de cette « répression catabolique ». Cependant, certaines de nos observations expérimentales ne sont pas correctement prédites par les modèles actuels. Ces modèles doivent être révisés ou complétés. L'outil majeur que nous employons pour les expériences est la fusion transcriptionnelle : une région promotrice fusionnée en amont d'un gène rapporteur (GFP, luciferase). Avec ces constructions, nous mesurons la dynamique de l'expression génique dans différentes souches (mutants) et différentes conditions environnementales. Les observations à l'échelle de la population sont corroborées par des mesures similaires à l'échelle de la cellule unique. Nous utilisons cette même technologie pour construire de petits systèmes synthétiques qui sondent davantage le phénomène de répression catabolique. Nous avons ainsi créé un interrupteur génétique dont le fonctionnement est contrôlé par le flux glycolytique et nous avons construit un petit système de communication intercellulaire basé sur la molécule AMPc. Enfin, nous proposons une manière originale de mesurer l'état métabolique des cellules en utilisant la dépendance énergétique de la luciferase. / The adaptation of bacteria to changes in their environment is controlled by a large and complex regulatory network involving many different actors and modules. In this work, we have studied a specific module controlling the adaptation of Escherichia coli to a change in carbon sources. In a medium containing glucose and acetate, growth is divided into two phases : the bacteria preferentially use glucose and start to metabolize acetate only after glucose exhaustion. Indeed, the presence of glucose represses the transcription of a gene needed for growth on acetate : the acs gene (coding for acetyl-CoA synthetase). The regulatory mechanism involves the Crp-cAMP regulator and the phosphate transfer system (PTS), which is responsible for glucose import. Several models describe the cascade of molecular reactions responsible for this « catabolite repression ». However, our work shows that many of our experimental observations are incorrectly predicted by current models. These models have to be amended.We use transcriptional fusion, i.e., the fusion of a promoter region upstream of a reporter gene (GFP, luciferase), to measure the dynamics of gene expression in different genetic backgrounds and environmental conditions. Observations at the population level are corroborated by similar measurements at the single cell level. We use this same technology to construct small synthetic systems that probe further aspects of the phenomenon of catabolite repression. We have thus created a genetic toggle switch controlled by the glycolytic flux and we have built an inter-cellular communication system mediated by cAMP. Finally, we propose a novel way to measure the metabolic state of cells by using the energy dependence of the luciferase enzyme.

Les biofilms sont des communautés de microorganismes adhérant à une surface et encastrées dans une substance polymérique produite par les cellules du système, dite matrice extracellulaire. Du fait de leur nature ubiquitaire, les biofilms colonisent de nombreux environnements et causent souvent de sérieux problèmes dans les secteurs de la santé et de l’industrie. La dispersion par ajout d’agent chimique est l’une des stratégies de lutte contre les biofilms. Un acide gras, l’acide cis-2-décénoique (CDA), semble être prometteur pour ce faire, grâce à l’étendue de son action dispersante sur les espèces et règnes du vivant. L’objectif de ce travail de thèse est d’investiguer les mécanismes de dispersion des biofilms de l’espèce bactérienne Escherichia coli (E. coli) par la molécule modèle CDA. Le CDA modifie-t-il les structures du biofilm ou induit-il une réponse génétique des bactéries lors de la dispersion ? Pour répondre à ces questions, la dispersion des biofilms d’E. coli a été étudiée in situ dans des chambres microfluidiques par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Des souches bactériennes spécifiques ont été construites par clonage de promoteurs d’intérêt en fusion transcriptionnelle avec un gène codant pour une protéine fluorescente verte. Les résultats confirment l’activité dispersante du CDA avec une réduction significative de la biomasse, de l’épaisseur moyenne et de l’aire de recouvrement par couche du biofilm. Un outil innovant d’analyse d’images CLSM a été développé en collaboration dans le but de déterminer les propriétés structurales du biofilm et l’intensité de fluorescence in situ du rapporteur étudié. Les résultats indiquent une augmentation de l’intensité moyenne de fluorescence des biofilms après dispersion avec le CDA, au niveau global en considérant tout le biofilm et au niveau local en considérant une segmentation du biofilm en microcolonies, ainsi qu’en profondeur. Ces résultats évoquent un changement d’expression génique des bactéries en présence de CDA. Par ailleurs, les résultats montrent que le CDA ne semble pas avoir d’effet en culture planctonique, ni sur la croissance bactérienne ni sur l’activité des promoteurs sélectionnés. Ceci suggère que les effets du CDA sont biofilm-dépendants. / Biofilms are microbial communities adhering to a surface and embedded in a self-produced polymeric substance, called extracellular matrix. By being ubiquitous in nature, biofilms colonize numerous environments, and they often cause serious problems for both health and industry sectors. Dispersion is one of the strategies for fighting biofilms. A fatty acid, cis-2-decenoic acid (CDA), seems to be promising for dispersing biofilms by the extent of its action on different species of microbes. The aim of this thesis work is to investigate the mechanisms of biofilm dispersion of the bacterial species Escherichia coli (E. coli) by the model molecule CDA. Does CDA modify the biofilm structures or does it induce a genetic response from bacteria during dispersion? To answer these questions, E. coli biofilm dispersal has been studied in situ in microfluidic chambers by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Specific bacterial strains have been developed by cloning promoters of interest in transcriptional fusion with a gene encoding for a green fluorescent protein. The results confirm the dispersing activity of CDA with a significant decrease of biomass, biofilm average thickness and area over biofilm depth. A novel tool for analyzing CLSM images has been developed in collaboration in order to measure the biofilm structural properties as a function of in situ fluorescence intensity of the studied reporter. The results indicate an increase in the mean fluorescence intensity of the biofilms after dispersion with CDA, at a global level for the whole biofilm and at a local scale by considering a biofilm segmentation into microcolonies. These results evoke a change in gene expression by bacteria in the presence of CDA. Furthermore, the results show that CDA does not seem to have an effect on planktonic bacteria, neither on the bacterial growth nor on the activity of the selected promoters. This suggests that the CDA effects are biofilm-dependent.

L'adaptation d'une bactérie aux changements de son environnement est contrôlée par un réseau de régulation large et complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs et modules différents. Dans ce travail, nous avons étudiés un module de régulation spécifique, contrôlant l'adaptation de la bactérie Escherichia coli à un changement de sources de carbone. Dans un milieu contenant du glucose et de l'acétate, la croissance est divisée en deux phases : les bactéries utilisent préférentiellement le glucose et commencent à métaboliser l'acétate qu'après l'épuisement du glucose. En effet, la présence du glucose réprime la transcription d'un gène nécessaire à la croissance sur acétate, le gène acs (codant pour l'acétyl-CoA synthétase). Le mécanisme régulateur fait intervenir le facteur de transcription Crp-AMPc et le système de transfert de phosphate (PTS), qui permet l'import du glucose. Plusieurs modèles décrivent en détail la cascade de réactions moléculaires à l'origine de cette " répression catabolique ". Cependant, certaines de nos observations expérimentales ne sont pas correctement prédites par les modèles actuels. Ces modèles doivent être révisés ou complétés. L'outil majeur que nous employons pour les expériences est la fusion transcriptionnelle : une région promotrice fusionnée en amont d'un gène rapporteur (GFP, luciferase). Avec ces constructions, nous mesurons la dynamique de l'expression génique dans différentes souches (mutants) et différentes conditions environnementales. Les observations à l'échelle de la population sont corroborées par des mesures similaires à l'échelle de la cellule unique. Nous utilisons cette même technologie pour construire de petits systèmes synthétiques qui sondent davantage le phénomène de répression catabolique. Nous avons ainsi créé un interrupteur génétique dont le fonctionnement est contrôlé par le flux glycolytique et nous avons construit un petit système de communication intercellulaire basé sur la molécule AMPc. Enfin, nous proposons une manière originale de mesurer l'état métabolique des cellules en utilisant la dépendance énergétique de la luciferase.

L'organisation orientationnelle bio-moléculaire des lipides et des protéines dans la membrane plasmique constitue un facteur important dans les processus biologiques au cours desquelles les fonctions peuvent être reliées aux mécanismes d'orientation et d'organisation. Le concept de séparation transitoire des phases à l'échelle nanométrique dans les domaines ordonnés et désordonnés, aussi appelé « radeau lipidique », est maintenant largement accepté. De plus, les domaines ordonnés contiennent des protéines de signalisation, ce qui souligne l'importance des séparations de phase au cours des processus de signalisation. Dans cette thèse de doctorat, nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et de reporters lipidiques tels que di-8-ANEPPQ et DiI(C18). Nous avons étudié l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine de signalisation MHC Class I et des reporters lipidiques par imagerie d'anisotropie de fluorescence résolue en polarisation. Nous avons observé l'influence du cytosquelette d'actine sur l'ordre orientationnel moléculaire de la protéine MHC et des reporters lipidiques dans la membrane plasmique. De plus, nous avons trouvé que l'ordre orientationnel moléculaire des reporters dépend de la morphologie cellulaire. Nous avons examiné les plis membranaires en modifiant la forme des cellules de façon mécanique ou pharmacologique. / Biomolecular orientational organization of lipids and proteins in the plasma membrane is a crucial factor in biological processes where functions can be closely related to orientation and ordering mechanisms. The concept of transient nanosized phase separations in ordered and disordered domains, called "lipid rafts" is now widely accepted. Furthermore, the ordered domains are enriched in signaling proteins, which highlights the crucial impact of phase separation during the signaling processes. While this field has been so far largely addressed by studying the translational diffusion behavior of membrane proteins and lipid reporters by Single Molecule Tracking (SMT) or Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), only little is known about the orientational behavior of signaling proteins and lipid reporters in the plasma membrane. In this PhD thesis we investigated the molecular orientational order of the signaling molecule MHC Class I protein using fluorescence anisotropy imaging as well as of lipid reporter di-8-ANEPPQ using polarization-resolved fluorescence imaging. Fluorescence anisotropy imaging requires a fluorescent label rigidly attached to the system under study, able to report its orientational order behavior. Thus, MHC Class I protein has been successfully labeled in a rigid way. We analyzed the orientational order of MHC Class I protein quantitatively in the endomembrane and plasma membrane and we found that the orientational order of MHC Class I protein in both membranes depends primarily on the maturation state of the protein and its interaction with the cytoskeleton.

La répression catabolique désigne un mode de régulation très répandu chez les bactéries, par lequel les enzymes nécessaires à l'import et la digestion de certaines sources carbonées sont réprimées en présence d'une source carbonée avantageuse, par exemple le glucose dans le cas de la bactérie E. coli. Nous proposons une approche mathématique et expérimentale pour séparer et évaluer l'importance des différents mécanismes de la répression catabolique. En particulier, nous montrons que l'AMP cyclique et l'état physiologique de la cellule jouent tous deux un rôle important dans la régulation de gènes sujets à la ré- pression catabolique. Nous présentons également des travaux méthodologiques réalisés dans le cadre de cette étude et contribuant à l'étude des réseaux de régulation génique en général. En particulier, nous étudions l'applicabilité de l'approximation quasi-stationnaire utilisée pour la réduction de modèles, et présentons des méthodes pour l'estimation robuste de taux de croissance, activité de promoteur, et concentration de protéines à partir de données bruitées provenant d'expériences avec gènes rapporteur. / Carbon Catabolite Repression (CCR) is a wide-spread mode of regulation in bacteria by which the enzymes necessary for the uptake and utilization of some carbon sources are repressed in presence of a preferred carbon source, e.g., glucose in the case of Escherichia coli . We propose a joint mathematical and experimental approach to separate and evaluate the importance of the different components of CCR. In particular, we show that both cyclic AMP and the global physiology of the cell play a major role in the regulation of the cAMP-dependent genes affected by CCR. We also present methodological improvements for the study of gene regulatory networks in general. In partic- ular, we examine the applicability of the Quasi-Steady-State-Approximation to reduce mathematical gene expression models, and provide robust meth- ods for the robust estimation of growth rate, promoter activity, and protein concentration from noisy kinetic reporter experiments.

NUR77 est un récepteur nucléaire (RN) orphelin impliqué dans la régulation de processus biologiques dont la mort cellulaire, notamment dans la maladie de Parkinson (MP), découlant de la perte de neurones dopaminergiques, et dans le cancer du sein, résultant de la prolifération de cellules mammaires. NUR77 est impliqué dans le déclenchement et la protection de la mort cellulaire et son activité serait indépendante de la liaison d’un ligand. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité de NUR77 est influencée par ses modifications post-traductionnelles (MPTs) et ses partenaires d’interactions. L’objectif général de cette thèse était de caractériser les MPTs et les partenaires d’interaction modulant l’activité de NUR77, dans des modèles de cellules en culture, afin de mieux comprendre ses fonctions biologiques - notamment dans la mort cellulaire. Le premier objectif de ce doctorat était de caractériser le rôle de la SUMOylation, une modification modulant l’activité des RN, chez NUR77, par des essais rapporteurs dans les cellules Human Embryonic Kidney 293 (HEK293). La surexpression de la E3 SUMO ligase PIASγ et/ou de l’isoforme 2 de la SUMO, protéines importantes dans la régulation de la SUMOylation chez les RN, a engendré un effet répresseur sur l’activité transcriptionnelle de NUR77. L’effet de PIASγ sur l’activité de NUR77 est modulé par la Sentrin SUMO-specific protease 1, qui hydrolyse la liaison des SUMO. Les mutations des résidus lysine dans des sites consensus de SUMOylation, de NUR77 (K102 et K577), empêchant cette MPT, ont causé des effets opposés sur son activité transcriptionnelle, suggérant le recrutement différent de corégulateurs de la transcription. Ces résultats combinés indiquent que la SUMOylation et les PIASγ et SUMO2 sont, respectivement, une MPT et des corégulateurs importants dans l’activité de NUR77. Le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser l’interactome de NUR77 dans des HEK293 vivantes afin d’identifier les interacteurs pouvant moduler son activité, à l’aide d’une méthode de marquage des protéines proximales avec la biotine basée sur la peroxydase APEX2, combinée à la spectrométrie de masse. Ce procédé a identifié 336 potentiels interacteurs de NUR77, dont plusieurs connus. Des essais de coimmunoprécipitation et de coimmunofluorescence menés dans les HEK293 et dans les cellules du cancer du sein MCF-7 ont montré, respectivement, que la protéine régulatrice de l’apoptose Apoptosis Inhibitor 5 (API5), interagissait et colocalisait avec NUR77. La privation de sérum dans le milieu de culture des cellules et la diminution de l’expression de API5 a conduit à une augmentation des niveaux protéiques et de l’activité de NUR77 et à une diminution de la survie cellulaire. Ces données suggèrent que API5 constitue un régulateur de NUR77 dans les voies de signalisation associées à la mort cellulaire et que cette interaction pourrait constituer une cible pour moduler l’apoptose. Elles valident également l’approche d’identification d’interacteurs de NUR77. Les travaux de cette thèse ont donc permis de générer des outils pour caractériser l’activité de NUR77 et ont révélé des corégulateurs de cette activité. La poursuite de ces projets pourrait révéler le caractère opportun de cibler NUR77 comme modulateur de la mort cellulaire, notamment dans la MP et le cancer du sein. / NUR77 is an orphan nuclear receptor (NR) involved in the regulation of multiple cell biology processes including cell death, in particular in Parkinson's disease (PD), which results of the loss of dopaminergic neurons, and in breast cancer (BC), which is caused by the proliferation of mammary epithelial cells. NUR77 is involved in triggering and inhibiting cell death and its activity is believed to be independent of a ligand binding. We hypothesized that the regulation of NUR77 activity does not occur through a ligand, but through the influence of its post-translational modifications (PTMs) and its interaction partners. The general objective of this PhD project was to characterize the PTMs and the interacting partners that modulate the activity of NUR77 in cultured cell models, to better understand its physiological roles, in particular in the regulation of cell death. The first objective of this thesis was to characterize the role of SUMOylation, a modification that regulates NR activity, in regulating NUR77 transcriptional activity in reporter assays in Human Embryonic Kidney (HEK293) cells. Overexpression of the E3 SUMO ligase PIASγ or/and the isoform 2 of SUMO, both important regulators in SUMOylation of the NUR77 homolog NURR1, produced a repressive effect on the transcriptional activity of NUR77. The effect of PIASγ on the activity of NUR77 was shown to be modulated by the Sentrin SUMO-specific protease 1 protein, which removes SUMO tags on target proteins. In addition, mutations of lysine residues in SUMO consensus sites in NUR77 (K102 and K577) had opposite effects on its transcriptional activity, suggesting different recruitment of coregulators of transcription in the regions. The combination of these results indicates that SUMOylation is an important PTM for the regulation of NUR77 activity and that PIASγ and SUMO2 proteins are important transcriptional coregulators of NUR77. The second objective of this thesis was to evaluate NUR77 interactome in HEK293 living cells to identify the interactors that can modulate its activity, using a biotin-labelling method for proximal proteins based on the APEX2 peroxidase combined with mass spectrometry. This approach identified 336 potential interactors of NUR77, some that are consistent with the literature. Coimmunoprecipitation and coimmunofluorescence assays carried out in HEK293 cells and in MCF-7 breast cancer cell line have shown that the regulator of apoptosis Apoptosis Inhibitor 5 vi (API5), interacted and colocalized with NUR77. By depriving cells of serum and decreasing API5 expression, increased protein levels and activity of NUR77 was observed, as well as a decrease in cell viability. These data support that API5 is a regulator of NUR77 in its involvement in signalling pathways associated with cell death and that this interaction could be a target for modulating apoptosis. More generally, they validate the APEX2 tool which can be used to identify novel NUR77 interactors. In conclusion, the work of this thesis resulted in the generation of tools to better understand the activity of NUR77 and revealed important coregulators in this activity. The continued characterization of these interactors may provide opportunities to target NUR77 as a regulator of cell death, particularly in PD and in breast cancer.

Les progrès récents des techniques expérimentales biologiques ont conduit à la production d'une énorme quantité de données sur le comportement dynamique des réseaux de régulation génique (RRG). Nous présentons une approche pour l'identification des modèles affines-par-morceaux (APM) de RRGs à partir de données expérimentales. Ces modèles reposent sur l'hypothèse que la régulation survient au niveau de la synthèse et de la dégradation des produits de l'expression des gènes : les paramètres cinétiques sont supposés être constants jusqu'à ce que la concentration d'une protéine régulatrice franchisse un seuil de transition.<br /><br />La méthode que nous présentons se concentrent sur le problème de la détection des transitions entre les différents modes dynamiques à partir des données d'expression génique et sur la reconstruction des seuils de transition associés avec les interactions régulatrices. En particulier, notre méthode prend en considération les contraintes géométriques spécifiques aux modèles APM de RRGs. Une telle méthode d'identification est conçue pour des systèmes à erreur sur la sortie où les observations sont des séries temporelles de mesures bruitées de niveaux de concentration à l'intérieur d'une cellule.<br /><br />Les données sont d'abord classées en modes dans lesquels le comportement dynamique est considéré comme étant complètement décrit par une équation différentielle linéaire. À partir de la classification résultante, une technique de reconnaissance de forme est utilisée pour reconstruire toutes les combinaisons de seuils de transition qui sont cohérentes avec les données mesurées. Pour chaque combinaison de seuils, il est alors possible de fournir un réseau de régulation et les paramètres dynamiques de chaque mode.<br /><br />Les performances de notre approche ont été analysées en utilisant des données artificielles simulées pour un modèle simplifié de la réponse à un manque de carbone pour le bactérie Escherichia coli. En particulier, nous avons évalué l'influence du niveau du bruit et du pas d'échantillonnage sur les systèmes identifiés. Nos résultats montrent que la méthode, en association avec des séries temporelles de mesures suffisamment précises, lesquelles peuvent être obtenues avec des systèmes à gène rapporteur, permettent une identification quantitative de modèles APM de RRGs.