Universiẗat, Diss., 2004--Jena.

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Miriam Scheller Therapeutischer Effekt von Rapamyzin auf die Entwicklung der polyzystischen Nierenerkrankung in der PKD2-mut-Ratte Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und Zentrum für Medizinische Forschung der medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg Eingereicht in 2017 (100 Seiten, 43 Abbildungen, 42 Tabellen, 189 Literaturangaben, 1 Anhang) Schlüsselwörter: ADPKD, PKD2-mut-Ratte, Rapamyzin, Zystenniere Die autosomal dominant vererbte polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist die am häufigsten vorkommende genetisch bedingte Nierenerkrankung mit einem Auftreten von 1:500 bis 1:1000 bei Neugeborenen. In 85 % der Fälle liegt eine Mutation im PKD1-Gen auf Chromosom 16 und in 15% der Fälle eine Mutation des PKD2-Gens auf Chromosom 4 vor. Es kommt zu einer Volumenzunahme der Nieren infolge multipler Zysten, vor allem in den proximalen Tubuli, sowie einer interstitiellen Fibrose mit Entzündungszellinfiltration. Desweiteren kann es zu extrarenalen Zysten, vor allem in Leber, Pankreas und Hoden, kommen, ebenso können sich auch intrakranielle Aneurysmen und Herzklappenanomalien ausbilden. Die Nierenfunktion verschlechtert sich progressiv und führt meist in einem Lebensalter von 60 Jahren zu einem terminalen Nierenversagen. Ziel der vorliegenden Studie war es, den therapeutischen Effekt von Rapamyzin auf die Entwicklung der ADPKD in der PKD2-mut-Ratte zu untersuchen und zu klären, ob es einen Therapieerfolg im Vergleich der männlichen und weiblichen Früh- und Spättherapierten und deren Kontrollgruppen gab, und falls ja, ob dieser auch noch nach 2 Monaten Therapiepause bestand. Darüber hinaus sollte geklärt werden, ob eine Geschlechtsdisposition vorlag. Die PKD2-mut-Ratten (n=77) wurden in 10 Gruppen aufgeteilt, die sich in Therapietiere, darunter männliche und weibliche Früh- (mit und ohne Pause) und Spättherapierte, und in deren Kontrollgruppen aufsplitteten. Alle Frühtherapierten erhielten ab Lebenswoche (LW) 3 über einen Zeitraum von 5 LW 0,3 mg/kg KG/d Rapamyzin per os. Den Spättherapierten wurde nach Ablauf des 3. Lebensmonats über einen Zeitraum von 5 LW die gleiche Dosis appliziert. Die Kontrollgruppen erhielten zeitlich entsprechend ein Vehikel. Während der Versuchszeit wurden von allen Tieren an 2 bzw. 3 Zeitpunkten, folgende Parameter zur Evaluierung der Nierenfunktion bestimmt: Blut- (Harnstoff, Kreatinin, Kalzium, Phosphat, Protein, Kalium, Natrium, GOT, GPT, ALP, Cholesterin und Glukose im Plasma) und Urinproben (Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und Exkretion) und Erhebung von Stoffwechselkäfigdaten (Körpergewicht, Kot- und Urinvolumen/24h, Futter- und Wasseraufnahme/24h). Für den statistischen Teil wurde das Programm SAS (Version 9.1, SAS Institut, Cary, NC) verwendet. Nach Ablauf der Versuchsdauer in LW 8 (Frühtherapierte) bzw. LW 17 (Frühtherapierte mit Pause und Spättherapierte) fand eine histologische Beurteilung der mit HE- und Azan-Färbung gefärbten Gewebeschnitte, und eine Einteilung mittels eines Gradings bezüglich des Entzündungsgrades, dem Grad der Fibrose (in Mark, Rinde und Übergangsbereich) und der Zystenausprägung (Zystenanzahl und -fläche) statt. Es stellte sich heraus, dass Rapamyzin weder zu einer statistisch signifikanten Reduktion von Harnstoff und Kreatinin im Plasma noch zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und Reduktion der Exkretion über den Urin führte. Insgesamt waren die Resultate der Nierenfunktionsparameter bei den Spättherapierten besser als bei den Frühtherapierten. Nicht korrelierend hierzu, hatten die Frühtherapierten mit Pause weniger Zysten, ein geringeres Nierengesamtgewicht und eine deutlich geringer ausgeprägte Fibrose in den Nieren als die Spättherapierten, die Ergebnisse waren ebenfalls nicht statistisch signifikant. Mit einzelnen Ausnahmen kam es bei allen zu einem Anstieg von Harnstoff und Kreatinin im Plasma, zu einer Abnahme der Harnstoff- und Kreatinin-Clearance und einer Zunahme der Harnstoff- und Kreatinin-Exkretion, das heißt einer Progression der PKD. Die Mittelwerte genannter Parameter der Therapietiere waren bis auf wenige Ausnahmen geringgradig schlechter als die der Kontrollgruppen, lagen aber immer noch im Normbereich (abgesehen von einzelnen Spättherapierten), was bedeutet, dass die Nierenfunktion bis zum Versuchsende in der 8. bzw. 17. LW noch nicht eingeschränkt war. Die z.T. über den Versuchsverlauf stagnierenden oder auch im Vergleich mit den Kontrolltieren statistisch signifikant besseren Ergebnisse bei den Spättherapierten lassen Rückschlüsse zu, dass der Wirkstoff Rapamyzin bei einer Langzeitbehandlung einen positiven Einfluss auf das Voranschreiten der PKD haben könnte. Grundsätzlich zeigte sich erwartungsgemäß, dass bei sämtlichen untersuchten Parametern, sowohl im Plasma und Urin als auch histologisch, eine deutliche Geschlechtsdisposition bestand, die einen schwereren Krankheitsverlauf bei den Männchen belegte. Ebenso konnte die bekannte negative Körpergewichtsentwicklung durch Rapamyzin belegt werden. In keinem Tier wurden Zysten bzw. eine fibrotische Umgestaltung der Leber nachgewiesen, was die Frage offen lässt, ob es in diesem Ratten-Stamm zu keiner Ausprägung extrarenaler Zysten kommt oder womöglich Rapamyzin hierauf einen positiven Effekt hatte. Zusammenfassend sollten die Ergebnisse jedoch kritisch betrachtet werden, da eine starke Variabilität der PKD-Ausprägung bestand und die Frage der statistischen Signifikanz bei vorliegender Gruppengröße bedingt fraglich ist.

In der vorgelegten Studie wurde Modafinil hinsichtlich seiner möglichen antidepressiven und kognitionsverbessernden Wirkung in einem akuten prädiktiven tierexperimentellen Test mit Ratten, dem Forced Swim Test (FST), sowie in einem kognitiven Test zur gerichteten Aufmerksamkeit in der sozialen Diskriminierung (SND), sowie in einem Depressionsmodell der Ratte getestet. Bei der akuten Gabe von Modafinil zeigte sich im FST bei naiven Ratten eine vergleichbare Wirkung mit typischen Antidepressiva, die sich in einer verkürzten immobilen Zeit im Wasserbassin ausdrückte, während durch die akute Administration von Modafinil sich das Diskriminierungsverhalten gesunder Ratten nicht änderte. Zur Induktion depressionsartigen Verhaltens wurde ein 14-tägiges Restrained Stress-Protokoll verwendet. Der FST diente zum Nachweis der depressionsartigen Verhaltensmuster. Gestresste und ungestresste Tiere wurden akut und subchronisch mit Modafinil bzw. Placebo behandelt, um damit die Reversibilität depressionsähnlicher Verhaltensänderungen durch Modafinil zu untersuchen. Das Medikament verbesserte signifikant die depressionsartigen Verhaltensveränderungen und die Aufmerksamkeitsleistung im FST und SND. Mittels Mikrodialyse wurde gezeigt, dass Modafinil die Dopamin-Konzentration im kortikolimbischen System erhöht, so dass dies zu den beobachteten Effekten beitragen könnte. Die vorliegenden Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass Modafinil antidepressiv-ähnliche und kognitionsverbessernde Wirkungen besitzt und damit eine mögliche Alternative bei der adjuvanten Behandlung menschlicher Depression sein könnte. In weiteren Studien gilt es zu klären, in wie weit die hier gewonnenen Ergebnisse auf die klinische Situation übertragbar sind.

Six isoflavones derived from Millettia griffoniana namely, 4’-methoxy-7-O-[(E)-3-methyl-7hydroxymethyl-2,6 octadienyl]isoflavone (7-O-DHF), Griffonianone C (Griff C), 7-O-geranylformononetin (7-O-GF), 3’,4’-dihydroxy-7-O-[(E)-3,7-dimethyl-2,6-octadienyl]isoflavone (7-O-GISO), Griffonianone E (Griff E), 4’-O-geranylisoliquiritigenin (4-O-GIQ) were tested for potential oestrogenic activities in three different oestrogen receptor alpha (ERα) dependent assays, namely a recombinant yeast assay, a reporter gene assay based on stably transfected MCF-7 cells (MVLN cells) and the induction of alkaline phosphatase in Ishikawa cells. The oestrogenic activities of isoflavones from Millettia griffoniana could be completely suppressed by the pure oestrogen antagonist, fulvestrant. The expression of Ki-67, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cyclin D1 (CD1) mRNA used as indicator of cell proliferation in MCF-7 cells was assayed. Based on these in vitro results, Griff C was further tested in vivo. The main objective of this part of the work was to study the mechanistic basis of the oestrogenicity Three different doses of Griff C (2, 10, or 20 mg/kg BW) of Griff C in ovariectomised Wistar rats. 17β-oestradiol (E2: 10 µg/kg BW) was used as positive control. They were treated daily for three consecutive days and sacrificed 24 hours after receiving the last dose. The whole uterus was removed and weight. Liver and vena cava fragments were also collected and stored together with uteri in liquid nitrogen for subsequent real-time PCR to evaluate the effects of Griff C on the regulation of some relevant oestrogen–responsive genes in the uterus, the liver and the vena cava. The role of Griff C in apoptosis or in cell survival, through mediation of the phosphatidylinositol 3 kinase-Akt (PI3K-Akt) signaling pathway, was also investigated. Western blot analysis revealed that Griff C slightly increased the phosphorylation of Akt at its serine 473 residue. In this work, oestrogenic properties of the isoflavones derived from Millettia griffoniana are described using reporter gene assays and the oestrogen-inducible alkaline phosphatase Ishikawa model for the first time. These in vitro data were verified in vivo showing the regulation of the expression of various relevant oestrogen-responsive genes by Griff C. The spectrum of its activity was clearly similar to that of 17β-oestradiol on uterine hepatic and vena cava tissues of ovariectomised rats except for the proliferative response. However Griff C remained 100 to 1000 times less effective than oestradiol. These findings confirmed that some of the biological effects attributed to Millettia griffoniana are closely related to oestrogen-mediated action.

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Osteoporose ist eine Krankheit, die weltweit Millionen Menschen betrifft und in Anbetracht der überalternden Gesellschaft in Zukunft weiter an Relevanz gewinnen wird. Dass sich eine Ganzkörpervibration vorteilhaft auf Osteoporose auswirken kann, wurde schon in vorausgegangenen Studien belegt (Rubin et al. 2001b; Flieger et al. 1998; Oxlund et al. 2003; Sehmisch et al. 2009; Stuermer et al. 2010a; Stuermer et al. 2010b). Jedoch konnte bisher keine Klarheit über die optimale Anwendung (Dauer, Häufigkeit, Frequenz, Ausrichtung, Amplitude) gewonnen werden. Die bisherigen Versuche unterschieden sich lediglich in den verwendeten Frequenzen und der Therapiedauer.  Um die unterschiedlichen Einflüsse von vertikaler und horizontaler Vibration auf die osteoporotische Frakturheilung zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Tierversuch mit 90 weiblichen Ratten durchgeführt. 15 wurden scheinoperiert und 75 wurden ovarektomiert. Innerhalb einer Latenzzeit von 8 Wochen entwickelten die ovarektomierten Versuchstiere eine Osteoporose. Im Folgenden wurden alle Tiere an der Tibiametaphyse standardisiert osteotomiert und mittels Plattenosteosynthese versorgt. Es wurden sechs Versuchsgruppen gebildet: Vier Gruppen wurden einer horizontalen bzw. vertikalen Ganzkörpervibration mit 35 Hz oder 70 Hz ausgesetzt (35Hz vert, 70Hz vert, 35Hz horiz und 70Hz horiz). Die übrigen zwei Gruppen erhielten keine Ganzkörpervibration, wobei eine Gruppe aus nicht ovarektomierten (SHAM) und die andere Gruppe aus Tieren nach Ovarektomie bestand (OVX). Die Ganzkörpervibration wurde zweimal täglich über einen Zeitraum von vier Wochen mit einer Amplitude von 0,5 mm durchgeführt. Nach Beendigung dieses Zeitraumes wurden die Tiere per Dekapitation getötet und die Tibiae entnommen. Anschließend wurden ein biomechanischer Test, eine μCT-Untersuchung, eine mikroradiographische Untersuchung sowie eine polychrome Sequenzmarkierung durchgeführt. Die ersten beiden Untersuchungen konnten am präparierten Knochen vorgenommen werden. Die letzteren erfolgten nach Einbettung der Knochen in Methylmetacrylat und der Anfertigung von ca. 120 µm dicken histologischen Schnitten. Der biomechanische Test zeigte keine signifikante Veränderung der Elastizität oder der Streckgrenze in allen Gruppen zueinander. Die biomechanischen Eigenschaften des Kallus konnten nur tendenziell bei den hohen Frequenzen von 70 Hz vertikal und 70 Hz horizontal verbessert werden. In der μCT-Untersuchung konnte weder durch horizontale noch durch vertikale Ganzkörpervibration ein signifikanter positiver Einfluss auf die Frakturheilung im Vergleich zur osteoporotischen Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Es zeigten sich jedoch positive Tendenzen durch die horizontale Vibration bei 70 Hz. Die mikroradiographische Untersuchung ergab einen positiven Einfluss der vertikalen und der horizontalen WBV bei 70 Hz. Die horizontale Vibration bei 70 Hz konnte im Vergleich zur osteoporotischen Kontrollgruppe die Kortikalisdicke distal ventral, den Knochendurchmesser proximal, die Kallusdicke ventral, die Knochendichte des ventralen und die des endostalen Kallus verbessern.  In der polychromen Sequenzmarkierung konnte insgesamt durch die WBV eine Verschlechterung der frühen und eine Verbesserung der mittleren und späten osteoporotischen Frakturheilung gezeigt werden. In der frühen Phase wirkten sich ventral sowie endostal alle Frequenzen nachteilig aus. In der mittleren Phase war die horizontale Vibration bei 70 Hz in Bezug auf die dorsale Kallusfläche signifikant vorteilhaft gegenüber der osteoporotischen Kontrollgruppe. In der späten Phase erreichte die Gruppe mit horizontaler 35 Hz-Therapie in Bezug auf die ventrale Kallusfläche gegenüber der osteoporotischen Gruppe und der Gruppe mit vertikaler 35 Hz-Therapie signifikante Steigerungen. Dorsal zeigten beide horizontalen Frequenzen signifikant größere Kallusflächen als die Gruppe mit vertikaler 35 Hz-Therapie.  In der Zusammenschau aller durchgeführten Untersuchungen dieser Arbeit kristallisierte sich die horizontale Ganzkörpervibration bei 70 Hz als die vorteilhafteste Frequenz heraus, um die osteoporotische Frakturheilung an der Tibiametaphyse positiv zu beeinflussen.

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