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Vision impairment and blindness are in industrialized countries primarily caused by the degeneration of the retina, the light sensing tissue inside the eye. The degeneration, occurring in diseases like age-related macular degeneration (AMD) or retinitis pigmentosa (RP), can be caused by environmental factors as well as genetic defects and thus shows diverse pathologies. In all conditions, the light detecting photoreceptors (rods and/or cones) are dying caused by either direct photoreceptor damage or as a secondary effect following degeneration of supporting cells. Although promising treatment approaches are currently under investigation, up to date it is not possible to cure these diseases. Amongst these therapeutic strategies, pre-clinical studies evaluating the replacement of degenerated cells by transplantation of new photoreceptors demonstrated promising results. First studies conducted the specific enrichment and transplantation of primary photoreceptors derived from postnatal mice and their sufficient integration and differentiation into mature photoreceptors in wild-type as well as degenerated mouse retinae. Recent experiments additionally proved the recovery of some dim-light vision after transplantation in mice lacking night sight. The in vitro differentiation of whole eye cups containing photoreceptors, out of human or mouse ES or iPS cells, peaked in the transplantation of ES-derived photoreceptors into wild-type as well as degenerated mice and the integration and maturation of these cells. These observations are encouraging, but prior to a save implementation of this strategy into a clinical routine, several further hurdles need to be challenged. Collection of photoreceptors out of whole retinal tissues prior to transplantation was shown to be an important step to reach high integration rates. Additionally, transplantation of photoreceptors derived from stem cells comprises the risk of tumor formation after transplantation and thus also requires depletion of inadvertent cells. Therefore, we established the enrichment of photoreceptors using the cell surface marker dependent method magnetic-activated cell sorting (MACS). For identification of suitable target-specific surface markers, we characterized young transplantable mouse photoreceptors using microarray analysis and screened their transcriptome. Amongst others, ecto-5´nucleotidase (Nt5e, termed CD73) was identified being a rod photoreceptor specific cell surface protein. Thus, we enriched young photoreceptors with CD73-dependent MACS with sufficient purity and transplanted these cells into the subretinal space of wild-type mice. In contrast to unsorted retinal cells, enriched photoreceptors integrated in significantly higher number into the host retina, proving that MACS is a suitable alternative for specific photoreceptor enrichment. Testing other proteins, identified as photoreceptor specific, for MACS suitability and the translation of this approach to photoreceptors, derived from mouse as well as human iPS or ES cells, should be the focus of consecutive investigations. The integration of grafted cells into the retina is a complex process dependent on a variety of influencing factors. Transplantation experiments in aging wild-type mice and a rod-depleted mouse model, containing a retina composed of cone and cone-like photoreceptors, indicated that the activation of Müller glia cells facilitates integration of transplanted photoreceptors. Besides that, reduced outer limiting membrane (OLM) integrity, increased subretinal graft distribution or reduced retinal cell density are further suggested as potential cell engraftment enhancers. These factors might open up important possibilities of host retina manipulation to increase cell integration rates. Although retinal transplantation experiments were in addition to mice also performed using pigs or rats as hosts, the transplantation of enriched single photoreceptors, following the protocols successfully established in mice, has not been performed in other species. Nevertheless, transferring this technique is important and would allow better predictions for future application in human patients. Therefore, we transferred our protocol, using CD73 based MACS, to the rat and successfully enriched rat photoreceptors with sufficient purity. We subsequently transplanted these cells into the subretinal space of rats as well as mice and observed limited integration capacity of grafted cells. Only few transplanted rat photoreceptors were localized in the rat retina, lacking proper photoreceptor morphology. Especially regarding a perspective clinical application in humans, these data are remarkable. They imply the question, whether low integration in rat represents a general problem and might thus also be relevant for treatment in humans, or whether the rat retina forms just an exception. Thus, further detailed analysis of the cellular and molecular mechanisms underlying the integration process of transplanted photoreceptors represent an essential prerequisite for the development of a safe and efficient therapy, aiming to treat retinal degenerative diseases characterized by photoreceptor loss. / Degenerationserkrankungen der Netzhaut (Retina) sind in Industrieländern die Hauptursache für verminderte Sehfähigkeit und Blindheit. Sowohl Umweltfaktoren als auch vererbte Mutationen können Defekte wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) oder Retinitis pigmentosa (RP) auslösen und führen zu einem sehr variablen Krankheitsbild. Eine Gemeinsamkeit aller Formen ist das Absterben der lichtdetektierenden Fotorezeptoren (Stäbchen und/oder Zapfen). Dieses kann entweder durch direkte Schädigung, oder als Sekundäreffekt nach Degeneration der unterstützenden Zellen erfolgen. Obwohl im Moment vielversprechende Behandlungsansätze untersucht werden, ist es zurzeit nicht möglich, retinale Degenerationserkrankungen dieser Art zu heilen. Ein erfolgversprechender Ansatz könnte jedoch der Ersatz der degenerierten Zellen durch transplantierte Fotorezeptoren sein. Erste Studien demonstrierten die spezifische Anreicherung von primären Fotorezeptoren aus der Netzhaut neugeborener Mäuse und deren subretinale Transplantation in Wildtyp-Mäuse und Mausmodelle mit retinaler Degeneration. Die transplantierten Zellen integrierten in die Empfängernetzhaut und entwickelten sich in ausgereifte Fotorezeptoren und konnten unter anderem bei nachtblinden Mäusen die Sehfähigkeit bei Dunkelheit verbessern. Die Differenzierung von humanen oder murinen ES- und iPS-Zellen in vitro in vollständige Retinae und die Transplantation daraus gewonnener Fotorezeptoren in Mäuse, bilden vorläufig den Höhepunkt dieser Entwicklung. Obwohl die Fortschritte der jüngsten Vergangenheit beeindruckend sind, sollten vor der sicheren und effektiven Anwendung einer retinalen Zellersatztherapie als therapeutische Maßnahme beim Menschen noch einige wissenschaftliche Fragestellungen beantwortet werden. Studien zeigen, dass Zellpopulationen, die direkt aus der Spendernetzhaut entnommen und transplantiert wurden, auf Grund ihrer Heterogenität in geringeren Zahlen in die Empfängerretina einwandern als angereicherte Fotorezeptoren. Zusätzlich besteht bei unsortierten Zellen, die aus Stammzellpopulationen gewonnen wurden, das Risiko einer Tumorbildung. Daher haben wir die magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) zur Anreicherung junger Fotorezeptoren etabliert. Die dabei benötigten, für Fotorezeptoren spezifischen, Oberflächenproteine wurden mit Hilfe von Microarray-Analysen des Transkriptoms junger Stäbchen von Mäusen identifiziert. Dabei wurde unter anderem die 5\'-Nukleotidase (Nt5e, CD73) entdeckt, die uns die erfolgreiche Anreicherung junger Mausfotorezeptoren mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS erlaubte. Die Transplantation dieser angereicherten Zellpopulation in die Netzhaut von Empfängertieren resultierte in einer signifikant erhöhten Integrationsrate im Vergleich zu nicht-angereicherten retinalen Zellen. Die Überprüfung der Nutzbarkeit weiterer identifizierter Oberflächenproteine zur Zellanreicherung bzw. die Übertragung der etablierten Protokolle zur Zellsortierung und Transplantation auf Fotorezeptoren aus ES- und iPS-Zellkulturen, sollten im Fokus nachfolgender Experimente stehen. Die Integration transplantierter Zellen in die Empfängernetzhaut ist ein komplexer Prozess und von unterschiedlichen Einflussfaktoren abhängig. Durch Transplantationsexperimente in alternden Wildtyp-Mäusen und einem Mausmodell, dessen Fotorezeptorschicht keine Stäbchen und stattdessen nur Zapfen und zapfenähnlichen Fotorezeptoren aufweist, konnte gezeigt werden, dass vor allem die Aktivierung von Müllerzellen die Integrationsrate der Fotorezeptoren erhöht. Neben dieser sogenannten Gliose werden weitere Faktoren, wie die reduzierte Stabilität der äußeren Grenzmembran, die flächenmäßig größere Verteilung der transplantierten Zellen im subretinalen Raum oder die reduzierte Dichte der Zellen in der äußeren Körnerschicht, als potentielle integrationsfördernde Komponenten in Betracht gezogen. Diese bilden interessante Schwerpunkte für weitere Forschungen, um eine ausreichende Zellintegration durch Manipulation der Empfängernetzhaut, auch in der klinischen Anwendung, zu erreichen. Obwohl Transplantationsexperimente zusätzlich zur Maus auch in anderen Empfängerspezies, wie Ratten und Schweinen, durchgeführt wurden, liegen bis jetzt keine Studien vor, die die in der Maus erfolgreich etablierten Protokolle der Zellanreicherung und Transplantation von Fotorezeptor-Suspensionen in diesen Spezies reproduzierte. Der Transfer dieser Technik und eine Generalisierung der Anwendbarkeit eines Fotorezeptorersatzes durch Transplantation in verschiedenen Säugetierarten geben jedoch wichtige Hinweise für eine mögliche Translation dieser Technologie für klinische Anwendungen. Deshalb haben wir unser bereits an der Maus getestetes Protokoll auf die Ratte übertragen und erfolgreich Fotorezeptoren der Ratte mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS angereichert. Nach deren Transplantation in die Netzhaut von Ratten und Mäusen zeigten die Rattenfotorezeptoren aber eine stark verminderte Integrationsfähigkeit und das Fehlen einer reifen Fotorezeptormorphologie. Speziell in Hinsicht auf eine zukünftige klinische Anwendung sind diese Ergebnisse relevant, da sie die Frage aufwerfen, ob die mangelnde Integration in der Ratte ein generelles Problem darstellt und daher auch beim Menschen zu erwarten ist, oder ob sie nur eine Ausnahme im Rattenmodell bildet. Aus diesem Grund bildet die weitere Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Integration transplantierter Fotorezeptoren eine wichtige Grundlage für die Entwicklung einer sicheren und effizienten Therapie mit dem Ziel, degenerative Netzhauterkrankungen zu heilen.

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Einleitung: Ischämische Schlaganfälle ziehen ausgeprägte Entzündungsprozesse im Gehirn sowie Immunreaktionen in der Körperperipherie nach sich, welche den Erkrankungsverlauf und die Regeneration maßgeblich beeinflussen. Die Modulation dieser Immunantwort stellt folglich einen vielversprechenden experimentellen Ansatz in der Schlaganfalltherapie dar. Der ischämische Schlaganfall ist außerdem mit verschiedenen Komorbiditäten und Risikofaktoren assoziiert, deren Auswirkungen auf die komplexen postischämischen pathophysiologischen Prozesse nur in Teilen aufgeklärt sind. So hat eine arterielle Hypertonie (Bluthochdruck) als wichtigster modifizierbarer Risikofaktor durch die Induktion von Gefäßschäden eine zentrale Bedeutung für die Pathogenese von ischämischen Schlaganfällen und geht außerdem mit einer Aktivierung des Immunsystems einher. Der konkrete Einfluss der Hypertonie auf die postischämische Entzündungsreaktion wurde bislang nicht hinreichend untersucht. Die Einbeziehung wichtiger Begleiterkrankungen, wie Bluthochdruck, in die präklinische Schlaganfallforschung gewinnt zunehmend an Bedeutung, da ein erweitertes Verständnis der pathophysiologischen Zusammenhänge auch eine bessere Übertragbarkeit neuer immunmodulatorischer Therapiekonzepte auf den Menschen in Aussicht stellt. Zielstellung: Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung pathofunktioneller Zusammenhänge zwischen der Immunantwort nach Schlaganfall und manifestem Bluthochdruck. Dafür wurde die zentrale und periphere Entzündungsreaktion nach experimentellem Schlaganfall in einem prämorbiden hypertensiven Tiermodell (spontan-hypertensive Ratte, SHR) im Vergleich mit normotensiven Tieren mithilfe von vorwiegend durchflusszytometrischen, histologischen und molekularbiologischen Methoden analysiert. Daneben sollte das verwendete hypertensive Tiermodell für die Untersuchung immunologischer Aspekte der translationalen Schlaganfallforschung evaluiert werden. Tiere, Material und Methoden: Für alle Tierversuche und Organentnahmen wurden ausschließlich männliche Ratten der Stämme Wistar-Kyoto und SHR im Alter von 12 bis 14 Wochen verwendet. Die Induktion des ischämischen Infarkts erfolgte mithilfe eines permanenten, transkraniellen Schlaganfallmodells oder mittels photochemischer Thrombose. In Abhängigkeit von der Untersuchungsgruppe wurden die Tiere 1 oder 4 Tage nach Infarktinduktion bzw. Sham-Operation schmerzfrei getötet. Neben wenigen neuroanatomischen und neurofunktionellen Ausleseparametern wurde als Hauptzielgröße die Immunzellverteilung im Gehirn und im Blut erfasst. Dafür wurden Hirnzellisolate und Vollblutproben mit maximal 8 fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in verschiedenen Kombinationen markiert und in einem 3-Laser-Durchflusszytometer (FACSCanto II) gemessen und ausgewertet. Zudem wurden in kryokonservierten Hirnschnitten relevante Immunzellpopulationen und Adhäsionsmoleküle mittels Immunfluorezenztechniken markiert und für die Darstellung der räumlichen Verteilung mit einem Konfokal-Mikroskop (LSM710, Zeiss) analysiert. Zusätzlich wurde die Gen-und Proteinexpression selektiver Zytokine und Adhäsionsmoleküle in dissoziiertem Hirngewebe ermittelt. Die statistische Auswertung wurde je nach erfasster Zielgröße mittels zweiseitigem t-Test, Wilcoxon Rangsummentest, Pearson-Korrelation oder Varianzanalyse-Verfahren durchgeführt. Ein Signifikanzniveau von p<0,05 wurde für alle statistischen Verfahren festgelegt. Ergebnisse: Neben einer vergrößerten Läsion konnte in hypertensiven Tieren insbesondere eine gesteigerte Infiltration von Zellen des angeborenen Immunsystems in das ischämische Hirn gezeigt werden. Eine Verschiebung des Makrophagen-Granulozyten-Verhältnisses wies darüber hinaus auf eine veränderte Entzündungskinetik bei Vorliegen von Bluthochdruck hin. Weiterhin wurde in Tieren mit arterieller Hypertonie eine erhöhte Zahl von zirkulierenden Monozyten und Granulozyten beobachtet. Im Hirngewebe von spontan-hypertensiven Ratten nach Schlaganfall wurden außerdem eine verminderte Expression des antiinflammatorisch wirksamen Zytokins Interleukin 10, erhöhte Expressionsraten selektiver Leukozyten-rekrutierender Chemokine sowie eine vermehrte Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 auf infiltrierenden Leukozyten erfasst. Daneben konnten modellabhängige Einflüsse der verschiedenen Induktionsmethoden auf die Immunreaktion identifiziert werden. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse weisen deutlich auf einen Zusammenhang zwischen einem bestehenden arteriellen Hypertonus und einer gesteigerten entzündlichen Reaktion im Gehirn nach experimentellem Schlaganfall hin und zeigen mögliche zugrundeliegende Mechanismen auf. Gleichzeitig unterstreicht die Arbeit durch eine differenzierte Analyse methodischer und modellabhängiger Einflüsse die Unerlässlichkeit, präklinische Ergebnisse kritisch zu hinterfragen und in unterschiedlichen Modellen zu überprüfen. Auf Grundlage der Untersuchungen kann die spontan-hypertensive Ratte zudem als ein für die translationale Schlaganfallforschung geeignetes prämorbides Tiermodell beurteilt werden, in welchem sich der Einfluss des Risikofaktors Bluthochdruck auf die Entwicklung und den Verlauf der postischämischen Entzündung gut abbilden lässt.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Humaner Schlaganfall - Grundlagen 2.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Bedeutung 2.1.2 Allgemeine Definition und Ätiologie 2.2 Postischämische Entzündung und systemische Immunantwort 2.2.1 Allgemein 2.2.2 Initialer Pathomechanismus der sterilen Entzündung im Gehirn 2.2.3 Immunzellen in der postischämischen Entzündung 2.2.4 Periphere Immunmodulation und postischämische Immunsuppression 2.2.5 Auflösung der Entzündungsreaktion 2.3 Schlaganfall und Hypertonie 2.4 Translation - Schlaganfall im Tiermodell 2.4.1 Tiermodelle 2.4.2 Methoden zur Induktion des experimentellen Schlaganfalls 2.4.3 Translationsproblematik 2.4.4 Die spontan-hypertensive Ratte als prämorbides Tiermodell 2.5 Therapieverfahren und therapeutische Ansätze 3 Zielstellung und Aufbau der Arbeit 4 Publikation 1 5 Publikation 2 6 Zusammenfassende Diskussion 6.1 Infarktvolumina und funktionelle Daten 6.2 Immunzytologie im Hirngewebe 6.3 Immunzytologie im peripheren Blut 6.4 Leukozytenrekrutierung ins ischämische Gewebe 6.5 Fazit, Limitationen und Ausblick 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis Danksagung / Introduction: Ischemic strokes lead to a sequence of immune responses, including pronounced tissue inflammation in the brain as well as distinct reactions of the peripheral immune system that consistently influence disease process and outcome. The modulation of these immune responses therefore represents a promising experimental approach in stroke therapy. Ischemic stroke is also associated with various comorbidities and risk factors whose effects on the complex postischemic pathology have only been partially elucidated. Being the most important modifiable risk factor this especially applies to arterial hypertension that has a central role in the pathogenesis of ischemic stroke by inducing vascular damage but is also associated with a strong activation of the immune system. However, the specific influence of hypertension on postischemic inflammation has not been sufficiently investigated. Besides, the integration of hypertension and other important concomitant diseases is becoming a more regular tool in preclinical stroke modelling in order to expand the understanding of pathophysiological interactions and overcome the translational gap of new immunomodulatory therapies. Aim: The main objective of this work is the identification of pathofunctional interations between the immune response after stroke and preexisting arterial hypertension. For this purpose, the central and peripheral inflammatory response after experimental stroke was investigated in a premorbid hypertensive animal model (spontaneously hypertensive rat, SHR) in comparison with normotensive animals by means of flow cytometric, histological and molecular biological methods. In addition, the hypertensive animal model was supposed to be assessed regarding its suitability for the investigation of immunological aspects in translational stroke research. Material and Methods: For all animal experiments and organ removal, only male rats of the Wistar Kyoto and SHR strains aged 12 to 14 weeks were used. Induction of experimental stroke was performed using either a permanent transcranial stroke model or photochemical thrombosis model. Depending on the study group, animals were killed painlessly 1 or 4 days after infarct induction or sham surgery respectively. In addition to few neuroanatomic and neurofunctional readout parameters, immune cell distribution in the brain and blood was captured as primary variable. Therefore, brain cell isolates and whole blood samples labeled with a maximum of 8 fluorescence-coupled antibodies in different combinations were measured and analyzed in a 3-laser flow cytometer (FACSCanto II). Furthermore, immunofluorescence techniques were applied on cryopreserved brain sections in order to image spatial distribution of relevant immune cell populations and adhesion molecules by means of confocal microscopy (LSM710, Zeiss). In addition, the mRNA and protein expression of selective cytokines and adhesion molecules was determined in dissociated brain tissue. Depending on the targeted parameter statistical analyses were performed by using two-sample t-test, Wilcoxon rank-sum test, Pearson correlation coefficient or analysis of variance. A significance level of p<0.05 was set for all statistical methods. Results: In addition to an enlarged lesion, in hypertensive animals an increased infiltration of cells of the innate immune system to the ischemic brain area was detected. A shift of the macrophage-granulocyte-ratio further indicated an altered inflammatory profile in hypertensive rats. Furthermore, an increased number of circulating monocytes and granulocytes were observed in animals with hypertension. In brain tissue of SHR after stroke, a decreased expression of the anti-inflammatory cytokine interleukin 10 were recorded along with increased expression levels of selective leukocyte-recruiting chemokines and an increased expression of the adhesion molecule ICAM-1 on infiltrating leukocytes. In addition, caused by different induction methods, model-dependent impact on the immune reaction could be identified. Conclusion: The results clearly indicate a relationship between existing arterial hypertension and an increased inflammatory response in the brain after experimental stroke and point out potential underlying mechanisms. At the same time, by adopting a differentiated view of methodological and model-dependent influences, the work underscores the need for critical reflection and constant verification of preclinical results in different models. Finally the work validates the SHR strain as a suitable premorbid preclinical system for further translational research since it well models the influence of hypertension on the development and course of postischemic inflammation.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Humaner Schlaganfall - Grundlagen 2.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Bedeutung 2.1.2 Allgemeine Definition und Ätiologie 2.2 Postischämische Entzündung und systemische Immunantwort 2.2.1 Allgemein 2.2.2 Initialer Pathomechanismus der sterilen Entzündung im Gehirn 2.2.3 Immunzellen in der postischämischen Entzündung 2.2.4 Periphere Immunmodulation und postischämische Immunsuppression 2.2.5 Auflösung der Entzündungsreaktion 2.3 Schlaganfall und Hypertonie 2.4 Translation - Schlaganfall im Tiermodell 2.4.1 Tiermodelle 2.4.2 Methoden zur Induktion des experimentellen Schlaganfalls 2.4.3 Translationsproblematik 2.4.4 Die spontan-hypertensive Ratte als prämorbides Tiermodell 2.5 Therapieverfahren und therapeutische Ansätze 3 Zielstellung und Aufbau der Arbeit 4 Publikation 1 5 Publikation 2 6 Zusammenfassende Diskussion 6.1 Infarktvolumina und funktionelle Daten 6.2 Immunzytologie im Hirngewebe 6.3 Immunzytologie im peripheren Blut 6.4 Leukozytenrekrutierung ins ischämische Gewebe 6.5 Fazit, Limitationen und Ausblick 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis Danksagung

Die vorliegende publikationsbasierte Dissertationsschrift erörtert auf der Basis experimenteller Untersuchungen im Tiermodell die Auswirkungen von Stress auf die Zytokinproduktion und depressionsähnliches Verhalten. Außerdem wird getestet, ob die Blockade des Zytokins Tumornekrosefaktor-α (TNF‑α) eine Möglichkeit zur antidepressiven Intervention darstellt. Einleitend werden die Zusammenhänge von Stress, Zytokinen und Depression referiert sowie das hypothetische Modell erläutert, das den publizierten Untersuchungen zugrunde liegt. Es wird hypothetisiert, dass Stress zur Erhöhung der Produktion proinflammatorischer Zytokine führt und dass die vermehrte Zytokinproduktion depressive Verhaltensweisen hervorruft. Aus dieser Annahme leitet sich die Möglichkeit ab, durch Blockade der Wirkung des proinflammatorischen Zytokins TNF‑α antidepressive Effekte zu erzielen. In den beiden Arbeiten „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ (Archives of Toxicology) und „Stress-induced cytokine changes in rats“ (European Cytokine Network) wurde der Einfluss von sozialer Isolation, chronischem, milden und akutem Stress auf die Zytokinproduktion untersucht. In diesen Untersuchungen führten die verschiedenen Stressarten zu einer Modulation der Produktion proinflammatorischer Zytokine. Die dritte Publikation „Antidepressant effects of TNF‑α blockade in an animal model of depression“ (Journal of Psychiatric Research) berichtet von einem Experiment, in dem untersucht wurde, ob der TNF‑α-Inhibitor Etanercept antidepressive Effekte aufweist. Tatsächlich zeigte sich unter Etanercept ein Rückgang des depressionsähnlichen Verhaltens im forced swim test (FST) analog zu Verhaltensänderungen durch das in Tierversuchen als Standard-Antidepressivum geltende Imipramin. Die Autoren schlussfolgern, dass das Zytokinsystem durch Stress moduliert wird und so in die pathophysiologische Entwicklung einer Depression involviert sein könnte. Zytokininhibitoren könnten eine neue Klasse der Antidepressiva bei Therapieresistenz werden, wenn sich die Ergebnisse dieser Tierversuche in Studien an Probanden und an Patienten replizieren lassen.:Abkürzungsverzeichnis 5 1. Einführung 6 1.1. Zytokine 6 1.1.1. Tumornekrosefaktor-α 7 1.1.2. Interleukin‑1β 9 1.1.3. Interleukin‑2 9 1.1.4. Interleukin‑4 10 1.1.5. Interleukin‑6 10 1.1.6. Interleukin‑10 10 1.1.7. Interleukin‑17 11 1.1.8. Interleukin‑22 11 1.1.9. Interferon‑γ 12 1.2. Stress 12 1.2.1. Sympathikus und Zytokine 12 1.2.2. Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse und Zytokine 12 1.3. Stress und Immunsystem 13 1.4. Stressarten und ihre Paradigmen im Tierversuch 14 1.4.1. Stress durch Isolation bei Ratten 14 1.4.2. Forced Swim Test: Paradigma zur Messung depressionsähnlichen Verhaltens und Modell für akuten Stress 15 1.4.3. Restraint Stress 16 1.5. Depression und Stress 16 1.6. Depression und Entzündung 17 1.7. Neue Therapieansätze gegen Depression 18 1.8. Theoretisches Modell und Fragestellung 19 1.9. Bibliografie zur Einführung 20 2. Originalarbeiten 34 „The impact of social isolation on immunological parameters in rats“ 35 „Stress-induced cytokine changes in rats“ 38 „Antidepressant effects of TNF-α blockade in an animal model of depression“ 45 3. Zusammenfassung 51 4. Anhang 55 Erklärung über die selbständige Abfassung der Arbeit 55 Lebenslauf 56 Publikationen 57 Danksagung 58

Die Störung der intestinalen Mikrozirkulation gilt als ein kardinaler Mechanismus für die Entwicklung des Multiorganversagens bei Sepsis. Da das Intestinum für mikrozirkulatorische Studien klinisch kaum zugänglich ist, wurden die Auswirkungen einer Therapie mit den antioxidativen Substanzen Oxypurinol und U-74389G (Lazaroid) bzw. den vasoaktiven Substanzen Iloprost (Prostacyclin-Analogon) und Dopexamin auf die intestinale Mikrozirkulation und die systemische Mediatorfreisetzung in einem Tiermodell mit moderater und hoher Endotoxin-Belastung untersucht. Die intravitalmikroskopische Untersuchung der Kapillarperfusion in der Muskularisschicht bei Endotoxinämie erbrachte eine Verbesserung durch Oxypurinol- und Dopexamingabe. Die Perfusion der Mukosa konnte vor allem durch eine Iloprostapplikation gesteigert werden. Die Endotoxin-induzierte, intestinale Leukozytenadhärenz wurde insbesondere durch die Behandlung mit den antioxidativen Substanzen vermindert. Beide therapeutischen Optionen bewirkten eine ca. 60 %ige Reduktion der initialen Tumornekrosefaktor-alpha-Freisetzung in der Versuchsreihe mit der niedrigeren Endotoxin-Dosis. Parallel dazu konnte anhand von Malondialdehyd-Analysen gezeigt werden, dass Oxypurinol und U-74389G wirksam die intestinale, Radikal-induzierte Lipidperoxidation verringerten. Der intestinale mikrovaskuläre Blutfluss konnte durch beide vasoaktiven Substanzen - sowohl bei moderater als auch bei erhöhter Endotoxin-Dosierung - signifikant gesteigert werden. Die Ergebnisse beider Teilstudien bestätigten, dass sowohl reaktive Sauerstoffspezies als auch eine inadäquate Perfusion in der Mikrozirkulation wesentliche pathogenetische Faktoren bei Endotoxinämie bzw. Sepsis darstellen und entsprechende Therapieformen indiziert und effektiv sind. Eine kombinierte Gabe beider Substanzklassen erscheint daher sinnvoll und sollte in weiteren tierexperimentellen und klinischen Studien evaluiert werden. / The disturbance of the intestinal microcirculation is regarded as a pivotal mechanism in the development of multiorgan failure related to sepsis. Since the intestine is clinically not accessible for microcirculatory studies, the effects of a therapy with the antioxidants oxypurinol and U-74389G (lazaroid) as well as the vasoactive substances iloprost (a prostacyclin analogue) and dopexamine on the intestinal microcirculation and the systemic mediator release was studied in an animal model with moderate and high endotoxin challenge. The intravital microscopic examination of the capillary perfusion in the muscularis layer of the intestine during endotoxemia revealed an improvement by administration of oxypurinol and dopexamine. The perfusion of the mucosa could be increased by iloprost administration. The amount of the endotoxin induced, intestinal leukocyte adherence was especially decreased by the treatment with the antioxidants. Both therapeutic options caused a 60 % reduction in the initial tumor necrosis factor-alpha-release in the experiments with the lower endotoxin dose. Malondialdehyde analyses showed that oxypurinol and U-74389G reduced effectively the intestinal, radical-induced lipid peroxidation. The intestinal microvascular blood flow could be significantly increased by both vasoactive substances - as well as with moderately than also with elevated endotoxin-dosage. The results of the study confirmed that both reactive oxygen-species as well as an inadequate perfusion in the microcirculation represent essential pathogenetic factors during endotoxemia as well as sepsis and index corresponding therapy-forms and participates effective. A combined offering both substance-classes appears therefore meaningfully and should be evaluated in further experimental and clinical studies.