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Vision impairment and blindness are in industrialized countries primarily caused by the degeneration of the retina, the light sensing tissue inside the eye. The degeneration, occurring in diseases like age-related macular degeneration (AMD) or retinitis pigmentosa (RP), can be caused by environmental factors as well as genetic defects and thus shows diverse pathologies. In all conditions, the light detecting photoreceptors (rods and/or cones) are dying caused by either direct photoreceptor damage or as a secondary effect following degeneration of supporting cells. Although promising treatment approaches are currently under investigation, up to date it is not possible to cure these diseases. Amongst these therapeutic strategies, pre-clinical studies evaluating the replacement of degenerated cells by transplantation of new photoreceptors demonstrated promising results. First studies conducted the specific enrichment and transplantation of primary photoreceptors derived from postnatal mice and their sufficient integration and differentiation into mature photoreceptors in wild-type as well as degenerated mouse retinae. Recent experiments additionally proved the recovery of some dim-light vision after transplantation in mice lacking night sight. The in vitro differentiation of whole eye cups containing photoreceptors, out of human or mouse ES or iPS cells, peaked in the transplantation of ES-derived photoreceptors into wild-type as well as degenerated mice and the integration and maturation of these cells. These observations are encouraging, but prior to a save implementation of this strategy into a clinical routine, several further hurdles need to be challenged. Collection of photoreceptors out of whole retinal tissues prior to transplantation was shown to be an important step to reach high integration rates. Additionally, transplantation of photoreceptors derived from stem cells comprises the risk of tumor formation after transplantation and thus also requires depletion of inadvertent cells. Therefore, we established the enrichment of photoreceptors using the cell surface marker dependent method magnetic-activated cell sorting (MACS). For identification of suitable target-specific surface markers, we characterized young transplantable mouse photoreceptors using microarray analysis and screened their transcriptome. Amongst others, ecto-5´nucleotidase (Nt5e, termed CD73) was identified being a rod photoreceptor specific cell surface protein. Thus, we enriched young photoreceptors with CD73-dependent MACS with sufficient purity and transplanted these cells into the subretinal space of wild-type mice. In contrast to unsorted retinal cells, enriched photoreceptors integrated in significantly higher number into the host retina, proving that MACS is a suitable alternative for specific photoreceptor enrichment. Testing other proteins, identified as photoreceptor specific, for MACS suitability and the translation of this approach to photoreceptors, derived from mouse as well as human iPS or ES cells, should be the focus of consecutive investigations. The integration of grafted cells into the retina is a complex process dependent on a variety of influencing factors. Transplantation experiments in aging wild-type mice and a rod-depleted mouse model, containing a retina composed of cone and cone-like photoreceptors, indicated that the activation of Müller glia cells facilitates integration of transplanted photoreceptors. Besides that, reduced outer limiting membrane (OLM) integrity, increased subretinal graft distribution or reduced retinal cell density are further suggested as potential cell engraftment enhancers. These factors might open up important possibilities of host retina manipulation to increase cell integration rates. Although retinal transplantation experiments were in addition to mice also performed using pigs or rats as hosts, the transplantation of enriched single photoreceptors, following the protocols successfully established in mice, has not been performed in other species. Nevertheless, transferring this technique is important and would allow better predictions for future application in human patients. Therefore, we transferred our protocol, using CD73 based MACS, to the rat and successfully enriched rat photoreceptors with sufficient purity. We subsequently transplanted these cells into the subretinal space of rats as well as mice and observed limited integration capacity of grafted cells. Only few transplanted rat photoreceptors were localized in the rat retina, lacking proper photoreceptor morphology. Especially regarding a perspective clinical application in humans, these data are remarkable. They imply the question, whether low integration in rat represents a general problem and might thus also be relevant for treatment in humans, or whether the rat retina forms just an exception. Thus, further detailed analysis of the cellular and molecular mechanisms underlying the integration process of transplanted photoreceptors represent an essential prerequisite for the development of a safe and efficient therapy, aiming to treat retinal degenerative diseases characterized by photoreceptor loss. / Degenerationserkrankungen der Netzhaut (Retina) sind in Industrieländern die Hauptursache für verminderte Sehfähigkeit und Blindheit. Sowohl Umweltfaktoren als auch vererbte Mutationen können Defekte wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) oder Retinitis pigmentosa (RP) auslösen und führen zu einem sehr variablen Krankheitsbild. Eine Gemeinsamkeit aller Formen ist das Absterben der lichtdetektierenden Fotorezeptoren (Stäbchen und/oder Zapfen). Dieses kann entweder durch direkte Schädigung, oder als Sekundäreffekt nach Degeneration der unterstützenden Zellen erfolgen. Obwohl im Moment vielversprechende Behandlungsansätze untersucht werden, ist es zurzeit nicht möglich, retinale Degenerationserkrankungen dieser Art zu heilen. Ein erfolgversprechender Ansatz könnte jedoch der Ersatz der degenerierten Zellen durch transplantierte Fotorezeptoren sein. Erste Studien demonstrierten die spezifische Anreicherung von primären Fotorezeptoren aus der Netzhaut neugeborener Mäuse und deren subretinale Transplantation in Wildtyp-Mäuse und Mausmodelle mit retinaler Degeneration. Die transplantierten Zellen integrierten in die Empfängernetzhaut und entwickelten sich in ausgereifte Fotorezeptoren und konnten unter anderem bei nachtblinden Mäusen die Sehfähigkeit bei Dunkelheit verbessern. Die Differenzierung von humanen oder murinen ES- und iPS-Zellen in vitro in vollständige Retinae und die Transplantation daraus gewonnener Fotorezeptoren in Mäuse, bilden vorläufig den Höhepunkt dieser Entwicklung. Obwohl die Fortschritte der jüngsten Vergangenheit beeindruckend sind, sollten vor der sicheren und effektiven Anwendung einer retinalen Zellersatztherapie als therapeutische Maßnahme beim Menschen noch einige wissenschaftliche Fragestellungen beantwortet werden. Studien zeigen, dass Zellpopulationen, die direkt aus der Spendernetzhaut entnommen und transplantiert wurden, auf Grund ihrer Heterogenität in geringeren Zahlen in die Empfängerretina einwandern als angereicherte Fotorezeptoren. Zusätzlich besteht bei unsortierten Zellen, die aus Stammzellpopulationen gewonnen wurden, das Risiko einer Tumorbildung. Daher haben wir die magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) zur Anreicherung junger Fotorezeptoren etabliert. Die dabei benötigten, für Fotorezeptoren spezifischen, Oberflächenproteine wurden mit Hilfe von Microarray-Analysen des Transkriptoms junger Stäbchen von Mäusen identifiziert. Dabei wurde unter anderem die 5\'-Nukleotidase (Nt5e, CD73) entdeckt, die uns die erfolgreiche Anreicherung junger Mausfotorezeptoren mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS erlaubte. Die Transplantation dieser angereicherten Zellpopulation in die Netzhaut von Empfängertieren resultierte in einer signifikant erhöhten Integrationsrate im Vergleich zu nicht-angereicherten retinalen Zellen. Die Überprüfung der Nutzbarkeit weiterer identifizierter Oberflächenproteine zur Zellanreicherung bzw. die Übertragung der etablierten Protokolle zur Zellsortierung und Transplantation auf Fotorezeptoren aus ES- und iPS-Zellkulturen, sollten im Fokus nachfolgender Experimente stehen. Die Integration transplantierter Zellen in die Empfängernetzhaut ist ein komplexer Prozess und von unterschiedlichen Einflussfaktoren abhängig. Durch Transplantationsexperimente in alternden Wildtyp-Mäusen und einem Mausmodell, dessen Fotorezeptorschicht keine Stäbchen und stattdessen nur Zapfen und zapfenähnlichen Fotorezeptoren aufweist, konnte gezeigt werden, dass vor allem die Aktivierung von Müllerzellen die Integrationsrate der Fotorezeptoren erhöht. Neben dieser sogenannten Gliose werden weitere Faktoren, wie die reduzierte Stabilität der äußeren Grenzmembran, die flächenmäßig größere Verteilung der transplantierten Zellen im subretinalen Raum oder die reduzierte Dichte der Zellen in der äußeren Körnerschicht, als potentielle integrationsfördernde Komponenten in Betracht gezogen. Diese bilden interessante Schwerpunkte für weitere Forschungen, um eine ausreichende Zellintegration durch Manipulation der Empfängernetzhaut, auch in der klinischen Anwendung, zu erreichen. Obwohl Transplantationsexperimente zusätzlich zur Maus auch in anderen Empfängerspezies, wie Ratten und Schweinen, durchgeführt wurden, liegen bis jetzt keine Studien vor, die die in der Maus erfolgreich etablierten Protokolle der Zellanreicherung und Transplantation von Fotorezeptor-Suspensionen in diesen Spezies reproduzierte. Der Transfer dieser Technik und eine Generalisierung der Anwendbarkeit eines Fotorezeptorersatzes durch Transplantation in verschiedenen Säugetierarten geben jedoch wichtige Hinweise für eine mögliche Translation dieser Technologie für klinische Anwendungen. Deshalb haben wir unser bereits an der Maus getestetes Protokoll auf die Ratte übertragen und erfolgreich Fotorezeptoren der Ratte mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS angereichert. Nach deren Transplantation in die Netzhaut von Ratten und Mäusen zeigten die Rattenfotorezeptoren aber eine stark verminderte Integrationsfähigkeit und das Fehlen einer reifen Fotorezeptormorphologie. Speziell in Hinsicht auf eine zukünftige klinische Anwendung sind diese Ergebnisse relevant, da sie die Frage aufwerfen, ob die mangelnde Integration in der Ratte ein generelles Problem darstellt und daher auch beim Menschen zu erwarten ist, oder ob sie nur eine Ausnahme im Rattenmodell bildet. Aus diesem Grund bildet die weitere Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Integration transplantierter Fotorezeptoren eine wichtige Grundlage für die Entwicklung einer sicheren und effizienten Therapie mit dem Ziel, degenerative Netzhauterkrankungen zu heilen.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.