Thesis (doctoral)--Katholieke Universiteit te Nijmegen.

In der Vitamin A-Forschung spielen Tiermodelle eine wichtige Rolle. Das am häufigsten verwendete Tiermodell in der VA-Forschung sind Ratten, die wie der Mensch einen spezifischen VA-Transport durch das Retinol-Bindungsprotein (RBP) im Blut besitzen. Im Gegensatz dazu wurden Frettchen bisher nur in der Carotinoidforschung eingesetzt. Die Frettchen besitzen aber hinsichtlich des VA-Stoffwechsels physiologische Ähnlichkeiten mit anderen Fleischfressern. Bei Fleischfressern existiert neben dem spezifischen VA-Transport durch das RBP auch ein unspezifischer VA-Transport durch Lipoproteine des Blutserums. Dadurch könnten Frettchen ein geeignetes Tiermodell für Studien zum unspezifischen VA-Transport sein. Ein Vergleich von Parametern des VA-Stoffwechsels von Ratten und Frettchen könnte die physiologischen Besonderheiten dieser Tiere näher charakterisieren.

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Ziel der vorliegenden Studie war erstmals die systematische Untersuchung der intraindividuellen und seitenspezifischen Unterschiede verschiedener Rattenextremitäten (Femur, Tibia und Humerus) in Abhängigkeit der Knochenmineraldichte, gemessen mit der Zwei-Energie-Röntgenabsorptiometrie (DXA). Zudem sollte die Varianz bestehender Frakturmodelle verkleinert werden.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Densitometrie 2.1.1 Zweienergie-Röntgen Absorptiometrie (DXA) 2.1.1.1 Evaluation der DXA – Technik 2.1.2 pQCT (periphere Quantitative Computertomographie) 2.1.3 QUS (Quantitativer Ultraschall) 2.2 Osteodensitometrie im Versuchsmodell 2.2.1 Einsatz von DXA beim Menschen 2.2.2 Einsatz von DXA bei Tieren 2.2.3 Einsatz von DXA bei Ratten 2.3 Biomechanische Testverfahren 2.3.1 Der Biegetest 2.3.1.1 Der 4–Punkt Biegetest 2.3.1.2 Der 3–Punkt Biegetest 2.3.1.3 Der Kompressionstest 2.3.1.4 Der Torsionstest 2.3.2 Biomechanische Tests in der Evaluation osteodensitometrischer Verfahren 3. Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial 3.2 Präparatentnahme 3.3 Knochenmessungen mit DXA 3.4 Biomechanische Testung 3.5 Statistische Analyse 4. Ergebnisse 4.1 Werte des Gesamtkollektivs mit seitenspezifischem Unterschied Knochendichte, Versagenslasten und Steifigkeit 4.2 Werte des Gesamtkollektivs ohne seitenspezifischen Unterschied Knochendichte, Versagenslasten und Steifigkeit 4.3 Korrelationen des Gesamtkollektivs untereinander und mit den Versagenslasten und der Steifigkeit 4.4 Korrelationen der Parameter der Versagenslasten 4.5 Korrelationen der Parameter der Steifigkeiten 4.6 Werte des Gesamtkollektivs mit gewichtsspezifischen Unterschieden 4.7 Korrelationen der Parameter im direkten seitenspezifischen Vergleich 5. Diskussion 5.1 Bedeutung der Fragestellung 5.2 Diskussion der Methoden 5.2.1 Osteodensitometrische Testverfahren 5.2.2 Biomechanische Testverfahren 5.3 Ergebnisdiskussion 5.4 Beantwortung der konkreten Fragestellung 5.5 Fazit 5.6 Ausblick 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Abbildungsverzeichnis 9. Tabellenverzeichnis 10. Literaturverzeichnis 11. Danksagung

Es werden in einer kumulativen Dissertationsschrift zwei wissenschaftliche Arbeiten zusammengefasst. Die erste Arbeit beschreibt die Etablierung der Kontrastmittelechokardiografie zur Charakterisierung des Herzinfarktmodells an der Ratte im zeitlichen Verlauf. Es wird der Ablauf der geometrischen Änderungen am linken Herz nach Herzinfarkt gezeigt. Zusätzlich wird die Methode mit anderen etablierten echokardiografischen Methoden verglichen. Hier wird die Messung der linksventrikulären Querschnittsfläche der Volumenbestimmung nach der modifizierten Simpson-Methode gegenübergestellt. Es wird gezeigt, dass die Flächenmessungen, bei Nichtverfügbarkeit der Kontrastmittelechokardiografie eine valide Methode zur Verlaufsbeobachtung im Modell darstellt. Die zweite Arbeit untersucht im Rattenversuch den Einfluss von mesenchymalen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut auf die Entwicklung des Herzversagens nach Herzinfarkt. Die Injektion der Zellen erfolgt direkt in das Herzmuskelgewebe am Rand des Infarktareals. Zusätzlich zur Phänotypisierung mittels Echokardiografie wurden hämodynamische Messungen, sowie immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen vorgenommen. Es konnte in einem Multigruppendesign gezeigt werden, dass im vorliegenden Versuch durch die Injektion von Vorläuferzellen kein Einfluss auf die geometrischen und biomechanischen Änderungen nach Herzinfarkt genommen werden konnte. Es konnten jedoch zusätzlich Differenzen zwischen den Versuchsgruppen in der Genexpression von Signalmolekülen der extrazellulären Matrix gezeigt werden, welche Spekulationen über den Einfluss der Zellen auf parakrine Mechanismen im Herzgewebe zulassen.

Vorangegangene Untersuchungen an Ratten zeigten unter normobarer Hypoxie eine linksventrikuläre systolische Dysfunktion und die Induktion eines Lungenödems. Weitere Analysen waren notwendig, um einerseits die Gründe der Depression des linken Ventrikels (LV) zu erforschen und zum anderen eine Beteiligung inflammatorischer Reaktionen an der Ödembildung in der Lunge nachzuweisen. Zentrale Fragestellungen waren dabei, inwiefern Hypoxie die myokardiale Energieversorgung beeinträchtigt bzw. Anzeichen für eine Inflammation in linkem oder rechtem Ventrikel zu erkennen sind. Im Lungengewebe sollte untersucht werden, ob es neben einer Inflammation zu einem Permeabilitätsödem infolge einer Zerstörung der alveolo-kapillären Barriere unter Hypoxie kommt. Besonderes Augenmerk lag auf der Erkennung frühzeitiger Schädigungsmechanismen unter akuter kurzzeitiger Hypoxieexposition. Adrenerge Mechanismen sind bei der Entstehung verschiedener Lungenödeme, wie das Neurogene Lungenödem (NPE) oder das Lungenödem beim Phäochromozytom, beteiligt. Auch im Tierexperiment verursacht Katecholaminstimulation ein sich sehr schnell entwickelndes Lungenödem unter Beteiligung sowohl α- als auch β-adrenerger Signalwege. Da Hypoxieexposition eine Sympathikusaktivierung hervorruft, stellte sich die Frage, ob Behandlungen mit adrenergen Agonisten oder Antagonisten vor allem die akuten pulmonalen Reaktionen auf Hypoxie abmildern können. Zusätzlich sollte durch die Verwendung unterschiedlicher Applikationsarten der Einfluss einer erhöhten Flüssigkeitszufuhr auf die kardialen und pulmonalen Schädigungen untersucht werden. Ratten wurden einer normobaren Hypoxie (10% O2) über 1,5 oder 6 h ausgesetzt und erhielten 0,9% NaCl oder adrenerge Blocker (Prazosin, Propranolol oder Prazosin und Propranolol) bzw. einen adrenergen Agonisten (Norepinephrin) entweder als Infusion (1 ml/h, erhöhte Flüssigkeitsbelastung) oder Injektion (0,5 ml, reduzierte Flüssigkeitsbelastung). Kontrolltiere verblieben in Normoxie und erhielten eine Infusion oder Injektion von 0,9% NaCl. Nach der Behandlungsdauer erfolgten die hämodynamischen Messungen und die Probenentnahmen von Herz- und Lungengeweben. Nach Gewebeextraktion erfolgte die RNA-Isolation für die mRNA-Anlaysen mittels Real-Time PCR (RT-PCR). Zur relativen Quantifizierung wurde das Housekeeping-Gen cyclic AMP phosphoprotein 19 (ARPP-19) verwendet. Bestimmungen der Gesamtproteinkonzentrationen erfolgten in Seren und bronchoalveolärerer Lavageflüssigkeit. Hämodynamisch induzierte akute Hypoxie eine systolische LV-Depression, vor allem unter Flüssigkeitsinfusion. Unter Injektion trat dieser Effekt deutlich schwächer auf. Die zusätzliche Gabe adrenerger Blocker aggravierte die LV-Funktionsbeeinträchtigung unter Hypoxie weiter, während adrenerge Stimulation sie nicht verhindern konnte. Die Funktion des rechten Ventrikels (RV) hingegen war unter Hypoxie unbeeinträchtigt. In der vorliegenden Arbeit wurden die mRNA-Expression der Hypoxiemarker aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 1 (ARNT1), hypoxia-inducible factor 1, α subunit (HIF1A), solute carrier family 2 facilitated glucose transporter member 1 (GLUT1), hypoxia-inducible gene domain family member 1A (HIGD1A) und vascular endothelial growth factor A (VEGF) sowie der Inflammationsmarker Interleukin 1α (IL-1α), IL-1ß, IL-6, tumor necrosis factor α-induced protein 1 (TNFAIP) und IL-10 in allen drei Geweben - Lunge, linkem und rechtem Ventrikel – untersucht. Die pulmonale mRNA-Expression inflammatorischer Marker (wie IL-6 oder TNFAIP) sollte Hinweise für die Beteiligung von Inflammationsprozessen am hypoxischen Lungenödem liefern. Mechanismen der Zelladaptation der Kardiomyozyten an Hypoxie sollten anhand der mRNA-Expressionsänderungen von Hypoxiemarkern (wie GLUT1 oder HIGD1A) abgeleitet werden, um mögliche Ursachen der linksventrikulären Funktionsverschlechterung und Aufschluss über die Energieversorgung des Myokards zu erhalten. Proteinkonzentrationen im Serum und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit sollten Aufschluss über eine gestörte kapilläre Permeabilität in der Lunge liefern. Aus den Ergebnissen der HIF-abhängigen Marker ARNT1, GLUT1, HIGD1A und VEGF ließen sich frühzeitig keine eindeutigen Hinweise auf einen beeinträchtigen Energiemetabolismus oder eine gestörte mitochondriale Funktion im Myokard unter akuter Hypoxie ableiten. Beispielsweise kann die Herabregulation der GLUT1-Expression unter kurzzeitiger Hypoxie und stärkerer Flüssigkeitsbelastung mit einem schlechten metabolischen Zustand im Myokard in Verbindung gebracht werden. Somit können kausale Zusammenhänge zur hypoxischen LV-Depression vermutet, aber nicht sicher bestätigt werden. Da sich unter kurzzeitiger Hypoxieexposition aus den untersuchten Markern keine eindeutigen Veränderungen des Stoffwechsels oder Energiemetabolismus in den Zellen ableiten ließen, sollten künftige Untersuchungen der myokardialen und pulmonalen Funktion in Hypoxie unter prolongierter Hypoxieexposition und auf der Basis von Proteinanalysen durchgeführt werden. In der Lunge erzeugt alveoläre Hypoxie einen inflammatorischen Phänotyp, wie er auch bei Bergsteigern nach raschem Aufstieg in große Höhen beobachtet werden konnte. Zwar wird das Höhenlungenödem (HAPE) ähnlich wie das hypoxische Lungenödem in dieser Tierstudie vorrangig durch hämodynamische Veränderungen verursacht, aber von inflammatorischen Prozessen begleitet, aufrechterhalten oder gar verschlimmert. Im Gegensatz zum Myokard zeigten frühzeitige Anstiege der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNFAIP pulmonale Inflammationsprozesse in der Lunge an, die mutmaßlich an der Aufrechterhaltung der hypoxischen Lungenschädigung schon nach 6 h beteiligt sind. Der Inflammationsprozess beinhaltet dabei Norepinephrin-abhängige Mechanismen, über eine Aktivierung der IL-6 Expression, und Mechanismen, die unabhängig von sympathischer Aktivierung über TNF-α Signalwege vermittelt werden. Folglich schwächte adrenerge Blockade — anders als ursprünglich angenommen — das Ausmaß der hypoxischen Lungenschädigung nicht ab. Analysen der Proteinkonzentrationen in Seren und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit lieferten keine Anhaltspunkte für eine erhöhte pulmonale Kapillarpermeabilität und somit für die Ausbildung eines alveolären Ödems und bestätigte die Beobachtungen eines interstitiellen Ödems in der Lungenhistologie. Erhöhte Flüssigkeitsapplikation förderte zusätzlich zur LV-Depression die Entwicklung des Lungenödems. Die hypoxie-induzierte LV-Depression stellt neben der direkten Hypoxiewirkung einen zusätzlichen kausalen Faktor für die Entstehung des Lungenödems durch pulmonale Kongestion dar, welche durch Flüssigkeitsbelastung weiter verstärkt wird. Flüssigkeitsreduktion hatte dagegen protektive Effekte: Die hypoxie-induzierte LV-Depression trat nur bei Infusion auf, dagegen blieb die inotrope LV-Funktion bei geringerer Flüssigkeitsbelastung erhalten. Auch die hypoxische Lungenschädigung (sowohl Lungenödem als auch Inflammation) wurde durch reduzierte Flüssigkeitsbelastung abgeschwächt. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchung kann daher geschlussfolgert werden, dass die hypoxie-induzierte Sympathikusaktivierung einen eher geringen Beitrag zur hypoxischen Lungenschädigung leistet. Dagegen kommt einem angemessenen Flüssigkeitsmanagement eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der kardiopulmonalen Funktion unter Hypoxie zu.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Hypoxie 1 1.1.1 Definition Hypoxie 1 1.1.2 Hypobare und normobare Hypoxie 1 1.1.3 Erkennung von Hypoxämie 1 1.1.4 Anpassung an Hypoxie 2 1.1.4.1 Akute Reaktion des Körpers auf Hypoxie 2 1.1.4.2 Akklimatisierung 3 1.1.4.3 Höhenkrankheiten 4 1.1.4.3.1 Akute Höhenkrankheit und Höhenhirnödem 4 1.1.4.3.2 Höhenlungenödem 5 1.1.4.4 Hypoxiewirkungen auf das Herz 6 1.2 Katecholamin-induzierte Lungenödeme 7 1.2.1 Neurogenes Lungenödem (NPE) 7 1.2.2 Phäochromozytom 8 1.2.3 Medikamentös-induziertes Lungenödem 8 1.2.4 Experimentelles Lungenödem 9 1.3 Fragestellungen unseres Tiermodells 10 1.4 Untersuchte Marker 12 1.4.1 Hypoxiemarker 14 1.4.1.1 HIF1A und ARNT1 14 1.4.1.2 GLUT1 16 1.4.1.3 HIGD1A 17 1.4.1.4 VEGF 18 1.4.2 Inflammatorische Marker 19 1.4.2.1 Proinflammatorische Zytokine 19 1.4.2.1.1 IL-1α und IL-1β 19 1.4.2.1.2 IL-6 19 1.4.2.1.3 TNFAIP 20 1.4.2.2 Antiinflammatorisches Zytokin IL-10 20 1.4.3 Gesamtproteinkonzentrationen in Seren und BALF 20 1.5 Eigene Fragestellungen 21 2 Material und Methoden 23 2.1 Material 23 2.1.1 Chemikalien 23 2.1.2 Pharmaka 23 2.1.3 Geräte 24 2.1.4 Software 24 2.1.5 Sonstiges 24 2.2 Methoden 25 2.2.1 Tierversuche 25 2.2.1.1 Versuchstiere 25 2.2.1.2 Behandlung 26 2.2.1.3 Hämodynamische Messungen 27 2.2.1.4 Probengewinnung 28 2.2.2 RNA-Isolation 28 2.2.3 Reverse Transkription 29 2.2.4 Polymerase-Kettenreaktion 29 2.2.5 DNA-Agarose-Gel 32 2.2.6 Proteinbestimmung 33 2.2.7 Statistische Analyse 34 3 Ergebnisse 35 3.1 Veränderungen im Herzen 35 3.1.1 Marker für Hypoxie, Zellstoffwechsel und Angiogenese im LV und RV 35 3.1.2 Pro- und antiinflammatorische Marker im LV und RV 41 3.2 Veränderungen in der Lunge 45 3.2.1 Marker für Hypoxie, Zellstoffwechsel und Angiogenese in der Lunge 45 3.2.2 Pro- und antiinflammatorische Marker in der Lunge 49 3.3 Proteinkonzentrationen im Serum und in der BALF 52 4 Diskussion 53 4.1 Kardiovaskuläre Funktion unter Hypoxie 53 4.1.1 Hämodynamische Veränderungen in unserem Tiermodell 53 4.1.2 HIF-abhängige Marker für zellulären Energiemetabolismus und Angiogenese 54 4.1.2.1 Adaptationen der LV Myozyten an Hypoxie 54 4.1.2.2 Adaptationen der RV Myozyten an Hypoxie 59 4.1.3 Inflammatorische Zytokine 60 4.2 Pulmonale Effekte von Hypoxie, Flüssigkeitsbelastung und adrenerger Behandlung 61 4.2.1 Hypoxie-spezifische Gene in der Lunge 61 4.2.2 Beteiligung inflammatorischer Prozesse am hypoxischen Lungenödem 62 4.2.3 Pulmonale Kapillarpermeabilität 64 4.3 Limitationen 65 4.4 Schlussfolgerungen 66

Experimentelle Studien zeigten, dass durch die perioperative, intraperitoneale Therapie antiadhärenter und zytotoxischer Substanzen das intra- und extraperitoneale Tumorwachstum nach Operationen vermindert werden kann. Nach intraperitonealen und subkutanen Applikationen von 104 Tumorzellen (DHD/K12/TRb) wurden BD IX Ratten in 14 Gruppen randomisiert: 7 Gruppen wurden mit CO2 laparoskopiert und 7 konventionell operiert. Die Operationszeiten betrugen 30 Minuten. Am Ende der Intervention wurde Ringerlösung, Taurolidin oder Taurolidin/Heparin intraperitoneal oder in die V. femoralis appliziert. Die Veränderungen des Differentialblutbildes auf das Operationstrauma und auf die Applikation der therapeutischen Substanzen wurden ermittelt. Taurolidin und die zusätzliche Therapie mit Heparin reduzierten im Tierexperiment nach intraperitonealer sowie simultaner intraperitonealer und intravenöser Therapie das intraperitoneale Tumorwachstum und die Inzidenz von Trokar- beziehungsweise Inzisionsmetastasen. Die intravenöse Therapie von Taurolidin und der Kombination aus Taurolidin/Heparin hatte keinen tumorsupprimierenden Effekt. Die Verschiebungen der Leukozytenzahlen des Differentialblutbildes wurden hauptsächlich durch das Operationstrauma bewirkt. In diesem Tierversuch wurden nach der Therapie mit Taurolidin und der Kombination mit Heparin keine Nebenwirkungen beobachtet. / Following subcutaneous and intraperitoneal injection of 104 colon adenocarcinoma cells (DHD/K12/TRb) the influences of both taurolidine or taurolidine/heparin on intraperitoneal and subcutaneous tumor growth was investigated in 210 rats undergoing midline laparotomy or insufflation with carbon dioxide. The animals were randomized into 14 groups. To investigate the intraperitoneal (local) influence of either taurolidine or heparin on tumor growth the substances were applied intraperitoneally. Systemic and intraperitoneal effects were evaluated after intravenous injection of the substances. Both application forms were also combined to analyze synergistic effects. Tumor weights, as well as the incidence of abdominal wound metastases were determined four weeks after the intervention. In order to evaluate the effects of the agents blood was taken to determine the peripheral leukocytes counts. Intraperitoneal therapy of either taurolidine or in combination with heparin inhibits local tumor growth and abdominal wound recurrences in rats undergoing midline laparotomy or insufflation with carbon dioxide. Neither the intraperitoneal nor the intravenous application or the combination of the two agents did influence the subcutaneous tumor growth. The substances did not alter the changes of peripheral leukocytes.

Der heute noch gängige Einsatz von Injektionsanästhetika bei Laborratten basiert zum großen Teil auf empirischen Daten. Auf der Grundlage des deutschen Tierschutzgesetzes sind Wissenschaftler verpflichtet, das nach dem derzeitigen Kenntnisstand schonendste Betäubungsmittel zu verwenden. Die wissenschaftlichen Daten zur intra- und postoperativen Belastung bei vielen Anästhetika sind lückenhaft. Daher wurden in dieser Studie im Sinne des „Refinements“ von Tierversuchen verschiedene Injektionsnarkosen bei 69 männlichen und weiblichen 6-8 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten im Rahmen einer stereotaktischen Gehirnoperation (OP) verglichen, bei der zumeist Injektionsnarkosen Verwendung finden. Die Ratten wurden entweder mit Chloralhydrat (CH: 3,6 %, 430 mg/kg intraperitoneal [i.p.] KGW), mit der vollständig antagonisierbaren Anästhesie (Medetomidin 0,15 mg/kg Körpergewicht [KGW], Midazolam 2 mg/kg KGW, Fentanyl 0,005 mg/kg KGW intramuskulär [i.m]) ohne (VAA-Gruppe) bzw. mit Antagonisierung (sog. VAA+A-Gruppe) zum OP-Ende (Atipamezol 0,75 mg/kg, Flumazenil 0,2 mg/kg, Naloxon 0,12 mg/kg subcutan [s.c.]) anästhesiert und nach Erreichen des Stadiums der chirurgischen Toleranz (cT), gekennzeichnet durch den Ausfall des Zwischenzehenreflexes an des Hintergliedmaße (ZZR hi.), einer 60-minütigen OP unterzogen. Eine weitere Gruppe erhielt eine i.p.-Bolusinjektion Propofol in einer Dosis von 120 mg/kg KGW, die sich im Rahmen von Vorversuchen als geeignet herausgestellt hatte, um bei Ratten eine Hypnose zu bewirken. Anschließend wurde Propofol zu Erzeugung und Aufrechterhaltung einer cT per Dauerinfusion i.v. (4 - 6 mg/kg/h) verabreicht. Kontrolltiere erhielten eine Injektion mit isotoner Kochsalzlösung (i.p.) ohne OP. Die Erfassung des KGWs erfolgte 3 Tage vor bis 2 Tage nach der OP. Im Vorfeld wurde jedes Tier über 3 Tage an das Tragen eines Pulsoximeterclips am Hals gewöhnt. Dies diente der Ermittlung von Basiswerte für die Atemfrequenz (AF), Herzfrequenz (AF) und die periphere Sauerstoffsättigung (SpO2)am wachen, freibeweglichen Tier am Tag der Anästhesie mittels MouseOx®-Pulsoximeter. In Narkose wurden die Tiere mittels Pulsoximeter, Reflextests (ZZR hi., Lid- [LR] und Cornealreflex [CR]) und Rektalthermometer überwacht. Die externe Wärmezufuhr wurde über eine elektrische Wärmeplatte (37 °C) vorgenommen Zu zwei Zeitpunkten erfolgten Blutabnahmen zur Bestimmung der Adrenalin- (A) und Noradrenalinwerte (NA) mittels HPLC. Der Verlust der cT wurde anhand festgelegter Kriterien bestimmt (ZZR hi. positiv, Zuckungen, lautes Vokalisieren, Zähneknirschen) und die Tiere ggf. nachdosiert. Prä- und postoperativ wurde immunreaktives Corticosteron (iCS) mittels ELISA aus Kotproben ermittelt. Zudem wurde die prä- vs. postoperative Belastung durch Etablierung eines nummerischen Scoresystems und Videoüberwachung der Tiere bewertet. 48 h nach der OP wurden die Ratten euthanasiert und relevante Organe und Gewebe für die histopathologische und immunhistochemische Untersuchung entnommen, um mögliche Anästhetika bedingte Irritationen sowie eine stressinduzierte Aktivierung von c-Fos-Proteinen in schmerz-assoziierten Gehirnregionen zu analysieren. Eine weitere Gruppe erhielt eine Inhalationsnarkose mit 3 % Isofluran (ISO) ohne OP und diente der Ermittlung von A und NA Basiswerten. Die AF lag bei 104 ± 1,05 Atemzüge/min, die HF bei 396 ± 2,10 Herzschläge/min und die SpO2 bei 95,7 ± 0,09 % (Angaben als Mittelwerte ± Standardfehler). Die Verwendung des MouseOx®-Pulsoximeters erwies sich als geeignete Methode zur Ermittlung von Wachwerten bei freibeweglichen Ratten. Alle CH-anästhesierten Tiere erreichten das cT-Stadium. Die Dauer der cT lag bei 49,14 ± 4,48 min, die Narkosedauer bei 155,66 ± 8,21 min. Während der Narkose zeigten die Tiere Tachykardie, Tachypnoe sowie eine geringgradig erniedrigte SpO2 und eine leichte Hypothermie. Erhöhte A/NA-Spiegel wiesen auf eine deutlich höhere intraoperative Stressbelastung in der CH-Gruppe hin. Auch iCS war in der CH-Gruppe im Vergleich zu VAA/VAA+A signifikant erhöht. Vom Tag der Anästhesie/OP auf den Folgetag verloren CH-Tiere durchschnittlich 9,4 g KGW. Postoperativ waren bei den Tieren keine bis geringe Anzeichen für Schmerz und/oder Disstress zu erkennen. Histopathologisch zeigten alle Ratten eine Peritonitis und Perihepatitis, 44 % der Tiere multifokale, akute Lebernekrosen und 22 % eine Perisplenitis. 95 % der mittels VAA anästhesierten Tiere erreichten die cT mit einer Dauer von 47,83 ± 7,05 min (VAA) bzw. 44,77 ± 5,27 min (VAA+A). Bei VAA-Tieren betrug die gesamte Narkosedauer 182,23 ± 20,58 min. Bei der VAA-Anästhesie insgesamt waren signifikante geschlechtsspezifische Unterschiede in der Latenzzeit bis zum Erreichen der 1. cT, der cT-Dauer und der Narkosedauer festzustellen. Die VAA-Anästhesie führte zu einer mittelgradiger Atemdepression und milden Hypothermie bei signifikant niedrigeren A/NA-Werten im Vergleich zu CH. Eine Nachdosierung ging mit einem vorrübergehenden signifikanten Abfall der SpO2 einher. Tiere der VAA+A-Gruppe erwachten 3,05 ± 0,21 min nach der s.c. Antagonisierung aus der Narkose. Anschließend zeigten sie starke Aufregung und Unruhe und ein verändertes Aktivitätsmuster, eine Stunde später teils Piloerektion sowie Ataxien. Die Körperkerntemperatur (KT) der VAA+A-Tiere sank innerhalb 1. Stunde nach der Antagonisierung signifikant ab. Einige Tiere wiesen eine Myositis als Folge der i.m. Applikation auf. Nach PROP-Anästhesie erreichten nur 36 % der Tiere das cT. Im Narkoseverlauf kam es bei diesen Tieren zu einer starken Beeinträchtigung der Atemfunktion. PROP-Tiere wiesen einen signifikanten Abfall der KT und Anzeichen verlängerter Sedation nach Wiedererwachen sowie die höchsten iCS-Gehalte auf. Insgesamt verstarben 4 von 11 Tieren wegen starker Atemdepression intra- oder postoperativ. Interessanterweise waren die nach ISO-Anästhesie ermittelten A/NA-Konzentrationen signifikant höher gegenüber allen Injektionsanästhesie-Gruppen. Die Ergebnisse dieser Studie belegen, dass die CH-Anästhesie mit gesteigerter Stresshormonfreisetzung einherging. Die Verwendung 3,6 %iger CH-Lösungen ist insbesondere wegen der massiven histopathologischen Befunde abzulehnen, obwohl die Tiere subjektiv ein scheinbar gutes Wohlbefinden aufwiesen. Die i.p. Applikation von Propofol erzeugte nur eine oberflächliche Anästhesie. Aufgrund der starken postanästhetischen Exzitationen sollte sie nur bedingt für kurze, nicht schmerzhafte Manipulation verwendet werden. Die initiale i.p. Propofol-Gabe mit anschließender i.v.-Infusion ist der reinen i.v. Gabe unterlegen und nicht empfehlenswert. Die VAA-Anästhesie ist für Ratten für stereotaktische OPs hingegen gut geeignet. Dabei ist eine exogene Wärmezufuhr auch nach der Antagonisierung zwingend notwendig, da das Thermoregulations-vermögen nach Wiedererwachen nicht ausreichend wiedererlangt wurde. Auf eine Belastung durch die unerwünschten Wirkungen der Antagonisierung wie Aufregung und Unruhe sowie durch die postanästhetische Hypothermie konnte nur anhand subjektiver Kriterien geschlossen werden. Hier sind weitere Untersuchungen nötig. Sofern kein Anästhesienotfall besteht, kann allerdings auf die Antagonisierung verzichtet werden, da in der Nachschlafzeit unter externer Wärmezufuhr (37 - 38 °C) kein wesentliches Risiko einer lebensbedrohlichen Hypothermie bzw. Kreislauf- und Atemdepression besteht. / Injectable anesthetics are still commonly used today, but mainly this is based on empirical data. In line with the German Animal Welfare Act, researches have to choose the least stressful anesthetic. However, scientific data about pain and distress during and after anesthesia are rare. To contribute to the refinement of animal experiments, we therefore investigated the suitability of different injectable anesthetics during a stereotactic surgery, for which kind of surgery injectable anesthetics are mostly used, in 69 male and female, 6 - 8 weeks old Sprague-Dawley rats. Rats were anesthetized with either chloral hydrate (CH: 3.6 %, 430 mg/kg intraperitoneal [i.p.]), with a complete reversible anesthesia (medetomidine 0.15, midazolam 2, fentanyl 0.0005 mg/kg intramuscular [i.m]) without (MMF) and with reversal (MMF with reversal) at the end of surgery (atipamezole 0.75, flumazenile 0.2, naloxone 0.12 mg/kg subcutaneous [s.c.]) or with propofol (PROP). The PROP-group received an i.p. bolus injection of propofol (120 mg/kg), shown to generate hypnosis in proceedings, followed by constant intravenous infusion (4 - 6 mg/kg/h) to achieve and maintain surgical tolerance (st). After reaching surgical anesthesia, indicated by loss of the pedal withdrawal reflex of the hind limb, a 60 minute surgery was undertaken. Rats with saline injection and without surgery served as control. Body weight of each rat was assessed 3 days before the surgery until 2 days after surgery. Over 3 days prior anesthesia and surgery, rats were adapted to wear a collar clip for MouseOx® pulse oximeter, used to gain basal of respiratory rate (RR), heart rate (HR) and peripheral oxygen saturation (pO2) values in awake and freely moving rats. During narcosis, monitoring was conducted via pulse oximeter, reflex tests (pedal withdrawal reflex, corneal and palpebral reflex) and rectal thermometer. All animals were placed on an electrical heating pad (37 °C). Levels of adrenalin and noradrenalin (A/NA) were analyzed at two designated time points via HPLC. Movement of the body or the extremities, audible vocalizations and teeth grinding were classified as defined criteria for the loss of st. If animals lost st during surgery, they received an additional anesthetic dose. Immunoactive corticosteron (iCS) in feces was determined by ELISA immunoassay before and after surgery. Moreover, different signs of pain and distress were scored by using a numerical pain scale and including video recordings. Rats were sacrificed 48 h after surgery for histopathological and immunhistochemical examination to analyze potential irritation on abdominal organs and tissue as well as stress-induced activation of c-Fos-protein in brain regions associated with pain. Furthermore, 5 rats were deeply anesthetized with 3 % isoflurane (ISO) and immediately sacrificed for reference values of A and NA. The RR assessed by MouseOx® pulse oximeter was 104 ± 1.05 brpm with a HR of 396 ± 2.10 bpm and an pO2 of 95.7 ± 0.09 % (results present the mean ± standard error). The MouseOx® pulse oximeter was found in the present study to be suitable to measure accurate values for awake and freely moving rats. All rats undergoing CH anesthesia reached st. The duration of the st was 49.14 ± 4.48 min, duration of narcosis was 155.66 ± 8.21 min. During the whole narcosis animal showed tachypnoea, tachycardia as well as minimal depressed pO2-levels and a slightly hypothermia. Elevated levels of A/NA indicated a high intraoperative distress. In addition, iCS levels were significantly elevated in comparison to the MMF-group. CH-rats lost 9.4 g of bodyweight from day of surgery to the following day. Overall, post-surgical little or no signs of pain and distress were observed after awakening from anesthesia, but all CH-rats exhibited peritonitis and perihepatitis, 44 % acute multifocal liver necrosis and 22 % perisplenitis. 95 % in the MMF-group reached satisfactory surgical anesthesia with duration of 47.83 ± 7.05 min (MMF) or 44.77 ± 5.27 min (MMF with reversal). Without reversal, MMF anesthesia lasted 182.23 ± 20.58 min. Gender-differences were noted in the latency to st, duration of st as well as duration of narcosis. Rats undergoing MMF anesthesia showed moderate depression of respiratory function and mild hypothermia. The A/NA levels were lower than in the CH-rats. Rats that received additional doses of MMF to maintain st showed a transient significant decrease of pO2. Core body temperature decreased significantly during 1 h after reversal. Post-mortem examination revealed myositis in some of the MMF-rats. MMF-rats with reversal awaked from anesthesia after 3.05 ± 0.31 min. Afterwards the rats were restless and agitated. After 1 h some of the rats exhibited piloerection and ataxic movements. Only 36 % of PROP-rats reached sufficient surgical anesthesia, accompanied by a pronounced respiratory depression. PROP-rats exhibited a significant decrease of core body temperature and signs of prolonged sedation after awakening from anesthesia. 4 of 11 rats died from respiratory failure during or after surgery. Surprisingly, levels of A/NA after ISO inhalation anesthesia were significantly higher compared to the injection groups. The results of this study indicate that CH anesthesia is associated with an increased liberation of stress hormones. The use of a 3.6 % solution of CH has to be refused especially because of the pathohistological findings, despite animals showed subjectively a good well-being. Propofol administered as an i.p. bolus produced only hypnosis. Therefore, i.p. injections are marely useful for short and non-painful procedures. However, post-anesthetic excitations represent limitations. The initial i.p. propofol bolus followed by intravenous infusion is therefore less suitable than an absolute intravenous administration. Thus, i.p. injections cannot be recommended. The complete reversible combination MMF is considered as suitable for stereotactic surgeries of Sprague-Dawley rats. There is an urgent need to continue heating after awakening, because thermoregulation is insufficiently restored after reversal of MMF anesthesia. Distress through the undesirable effects of the reversal like agitation and restlessness and through hypothermia was presumed only by subjective criteria. Further investigations are needed here. If there is no emergency situation, reversal should be avoided. In case of permanent external heating (37 - 38 °C) there is no major risk of life-threatening hypothermia or depression of respiratory or cardiovascular function during sleeping time.

Die meisten Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie und kongenitalen Herzerkrankungen exprimieren die atriale essentielle leichte Myosinkette (ALC-1) im Ventrikel, wo sie teilweise die ventrikuläre essentielle leichte Myosinkette (VLC-1) ersetzt. Diese VLC-1/ALC-1 Isoformveränderung korrelierte mit einem Anstieg der Zykluskinetik der Myosin-Querbrücken in chemisch gehäuteten Herzfasern aus hypertrophierten Humanventrikeln. Um die funktionelle Bedeutung der ALC-1 im gesamten intakten Herzen zu untersuchen, habe ich in der vorliegenden Arbeit ein transgenes Rattenmodell charakterisiert, das die humane ALC-1 (hALC-1) im Herzen exprimiert (TGR/hALC-1). WKY-Ratten dienten als genetisch korrekter Kontrollstamm. Mittels rekombinanter hALC-1 als Standard wurde die exprimierte hALC-1-Menge in SDS-Extrakten linker Ventrikel der TGR/hALC-1 im Western-Blot untersucht. 12 Wochen alte TGR/hALC-1 exprimierten etwa 17 mug hALC-1/mg SDS-Extrakt. Das exprimierte Transgen konnte in der Immunfluoreszenz zwischen den Z-Linien der Sarkomere lokalisiert werden. Die gerichtete Integrations des Transgens in das kardiale Myosinmolekül wurde zusätzlich noch in hochgereinigten Myosinpräparationen nachgewiesen. Analyse des linksventrikulären Proteoms durch 2D-PAGE, das zur Identifikation von etwa 3000 Proteinen führte, zeigte vergleichbare Proteinmuster in WKY und TGR/hALC-1. Die Untersuchungen der Kontraktilität des intakten isoliert perfundierten Herzen wurden mit Langendorff-Präparationen durchgeführt. Die Expression des hALC-1-Transgen führte zu statistisch signifikanten (p / Most patients with hypertrophic cardiomyopathy and congenital heart diseases express the atrial essential myosin light chains (ALC-1) in their ventricles, partially replacing the ventricular essential light chains (VLC-1). This VLC-1/ALC-1 isoform shift is correlated with an increase in cross-bridge cycling kinetics as measured using chemically skinned fibers from the hypertrophied ventricles of human hearts. To study the functional importance of hALC-1 in the whole intact perfused-heart, a transgenic rat model overexpressing hALC-1 (TGR/hALC-1) in the heart was generated. WKY rats were used as the respective genetically correct control strain. Using hALC-1HIST protein as a standard, the amount of transgenic protein expression was quantified by Immunoblot analysis of the left ventricular tissue extracts of the transgenic rats. Twelve-week-old TGR/hALC-1 expressed around 17mug hALC-1 per mg of whole SDS-soluble protein. The transgene was localized in-between the Z-lines of the sarcomere by immunofluoresecnce microscopy. Furthermore, the proper integration of the transgene into the rat ventricular myosin was confirmed by purifying myosin from rat ventricular tissues. Whole ventricular proteome analysis by 2D-PAGE, resolved approximately 3000 proteins spots in each TGR/hALC-1 and WKY animal. The whole protein expression patterns in both animal groups showed no differences with the exception of the transgenic hALC-1 protein spot. The perfused heart contractility parameters were evaluated using the Langendorff preparation. Expression of hALC-1 was accompanied by statistically significant improvements (p

20S Proteasomen der Leber gehören ausschließlich zur Population der Intermediär-Proteasomen. Chromatographisch sind drei proteasomale Subpopulationen aufgrund unterschiedlicher Oberflächenhydrophobizität trennbar. Diese beinhalten unterschiedliche Mengen der Standard- und Immunountereinheiten und zeigen unterschiedliche spezifische Aktivitäten gegenüber kurzen fluorigenen Peptidsubstraten. Außerdem lassen sie sich deutlich anhand der Schnittfrequenzen bei Hydrolyse von Polypeptidsubstraten unterscheiden. Jede dieser Subpopulationen konnte aufgrund unterschiedlicher Oberflächenladung in bis zu 5 verschiedene 20S Proteasom-Subtypen unterteilt werden, die wiederum unterschiedliche Mengen an Standard- und Immununtereinheiten enthielten. Jeder dieser Subtypen zeigte unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der spezifischen Aktivitäten und Hydrolysegeschwindigkeiten von Polypeptidsubstraten. Unterschiede wurden auch bezüglich ihrer Peptid-Spleiß-Aktivitäten nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurden darüber hinaus Veränderungen der Spektren proteasomaler Subtypen- und ihrer Eigenschaften im Lebergewebe von 2, 8 und 23 Monate alten Ratten nachgewiesen. Während die Gesamtmenge der Leber-Proteasomen mit steigendem Alter abnahm, nahm die Menge der Subtypen mit integrierten Immununtereinheiten zu. Gleichzeitig kam es zu einer altersabhängigen Zunahme der Hydrolysegeschwindigkeit gegenüber Polypeptide-Substraten sowie veränderten Schnitthäufigkeiten. Die altersabhängigen intramolekularen Umgestaltungen von Leberproteasomen könnten eine funktionelle Anpassung an die altersbedingten zellulären Veränderungen in Verbindung mit Veränderungen der MHC Klasse I Antigen-Präsentation darstellen. / 20S proteasomes isolated from rat liver belong to the population of intermediate type proteasomes. Three subpopulations were separated by chromatography due to their differences in surface hydrophobicity. These subpopulations contain different types of intermediate type proteasomes with standard- and immunosubunits exhibiting distinct specific activities towards short fluorogenic substrates. However, depending on the substrate their hydrolyzing activity of long polypeptide substrates was significantly different. Additional separation of the three 20S proteasome subpopulations due to their different surface charges allowed further resolution of each subpopulation to at least five 20S proteasome subtypes. The subunit composition of these subtypes varied with regard to the content of exchangeable subunits. The pattern of proteolytic activities measured with short fluorogenic peptides differed between the various subtypes as well as the ability to hydrolyze polypeptide substrate. Above all, each subtype displayed a specific pattern regarding the peptide-splice-activity. Furthermore, the present work showed age-dependent alterations in the subtype patterns, which were analyzed in livers of 2, 8 and 23 month old rats. While the total amount of proteasome declines with age, in all subtypes from aged animals standard subunits were widely replaced by immunosubunits. This resulted in a relative increase of immunosubunit-containing proteasomes, paralleled by age-dependent changes regarding the hydrolyzing activity of long polypeptide substrates. Such modifications could have implications on protein homeostasis as well as on MHC class I antigen presentation as part of the immunosenescence process.