Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-13. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:39Z : No. of bitstreams: 1 000844562.pdf: 1754971 bytes, checksum: aee278d0d3f4447cc9695a71adf5006a (MD5)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-18Bitstream added on 2014-06-13T20:01:20Z : No. of bitstreams: 1 ribeiro_pm_dr_sjc.pdf: 855430 bytes, checksum: 198f9ff557754ac8219dda6b2476ce7f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente trabalho foi identificar fenotipicamente e genotipicamente cepas de Candida dubliniensis entre os isolados e inicialmente identificados como Candida albicans pertencentes à coleção de amostras do laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia da UNESP/ São José dos Campos. Duzentas cepas de leveduras do gênero Candida, provenientes de trabalhos anteriores, isoladas de pacientes transplantados cardíacos sob terapia com imunossupressores, pacientes com tuberculose submetidos a antibioticoterapia prolongada, pacientes HIV positivos e indivíduos controle foram incluídas no estudo. As cepas foram submetidas aos seguintes testes fenotípicos: a) verificação da produção de tubo germinativo; b) formação e arranjo estrutural de clamidoconídeo em ágar fubá, em ágar tabaco, ágar girassol e ágar caseína; c) crescimento em temperatura de 45°C. Após a realização destes testes, todas as amostras foram submetidas à identificação genotípica por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), que demonstrou não haver C. dubliniensis entre as duzentas cepas testadas. Os resultados dos testes fenotípicos demonstraram que: a) todas as cepas produziram tubo germinativo; b) nos testes fenotípicos, o ágar fubá teve 76% de acordo de identificação com o método genotípico; o ágar tabaco, 92%; o ágar girassol, 92,5%; o ágar caseína, 85%; c) o crescimento a 45°C teve 86,5%. Concluiu-se que o ágar girassol foi o método fenotípico mais eficaz para diferenciação entre C. albicans e C. dubliniensis; nenhum dos métodos fenotípicos analisados se apresentou 100% eficaz; a identificação genotípica é necessária para diferenciação definitiva entre C. albicans e C. dubliniensis. / The aim of the present study was to identify phenotypically and genotypically Candida dubliniensis among the isolates initially identified as Candida albicans from the yeasts' collection of the laboratory of Microbiology of Faculdade de Odontologia - UNESP/ São José dos Campos. Two-hundred of Candida gender isolates from previous works obtained patients who underwent orthotopic cardiac transplantation under immunosuppressive therapy, tuberculosis patients submitted to antibiotic terapy, HIV-patients and healthy individuals were included in the study. The samples were submitted to the following phenotypic tests: 1) germ tube formation; 2) formation and structural arrangement of chlamydospores on cornmeal agar, tobacco agar, sunflower seed agar and casein agar; 3) inability to grow at 45°C. After these tests, all of the samples were analyzed by polymerase chain reactions (PCR) that demonstrated the absence of C. dubliniensis among the analyzed isolates. The results demonstrated that: 1) all isolates were positive for germ tube formation; 2) the porcentage of agreement in relation to the molecular method for each phenotipic test was respectively: on 76% cornmeal agar, 92% tobacco agar, 92.5% sunflower seed agar, 85% casein agar; 3) 86.5% inability to growth at 45°C. In conclusion, based on phenotypic characteristics, the sunflower seed agar was the more effective method for differentiation between C. albicans and C. dubliniensis; none of the phenotypic methods was 100% effective; molecular identification is necessary for definitive differentiation between C. albicans and C. dubliniensis.

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Reginaldo Bruno Gonçalves / Banca: Silvana Cai / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Cristiane Yumi Koga-Ito / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi identificar fenotipicamente e genotipicamente cepas de Candida dubliniensis entre os isolados e inicialmente identificados como Candida albicans pertencentes à coleção de amostras do laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia da UNESP/ São José dos Campos. Duzentas cepas de leveduras do gênero Candida, provenientes de trabalhos anteriores, isoladas de pacientes transplantados cardíacos sob terapia com imunossupressores, pacientes com tuberculose submetidos a antibioticoterapia prolongada, pacientes HIV positivos e indivíduos controle foram incluídas no estudo. As cepas foram submetidas aos seguintes testes fenotípicos: a) verificação da produção de tubo germinativo; b) formação e arranjo estrutural de clamidoconídeo em ágar fubá, em ágar tabaco, ágar girassol e ágar caseína; c) crescimento em temperatura de 45°C. Após a realização destes testes, todas as amostras foram submetidas à identificação genotípica por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), que demonstrou não haver C. dubliniensis entre as duzentas cepas testadas. Os resultados dos testes fenotípicos demonstraram que: a) todas as cepas produziram tubo germinativo; b) nos testes fenotípicos, o ágar fubá teve 76% de acordo de identificação com o método genotípico; o ágar tabaco, 92%; o ágar girassol, 92,5%; o ágar caseína, 85%; c) o crescimento a 45°C teve 86,5%. Concluiu-se que o ágar girassol foi o método fenotípico mais eficaz para diferenciação entre C. albicans e C. dubliniensis; nenhum dos métodos fenotípicos analisados se apresentou 100% eficaz; a identificação genotípica é necessária para diferenciação definitiva entre C. albicans e C. dubliniensis. / Abstract: The aim of the present study was to identify phenotypically and genotypically Candida dubliniensis among the isolates initially identified as Candida albicans from the yeasts' collection of the laboratory of Microbiology of Faculdade de Odontologia - UNESP/ São José dos Campos. Two-hundred of Candida gender isolates from previous works obtained patients who underwent orthotopic cardiac transplantation under immunosuppressive therapy, tuberculosis patients submitted to antibiotic terapy, HIV-patients and healthy individuals were included in the study. The samples were submitted to the following phenotypic tests: 1) germ tube formation; 2) formation and structural arrangement of chlamydospores on cornmeal agar, tobacco agar, sunflower seed agar and casein agar; 3) inability to grow at 45°C. After these tests, all of the samples were analyzed by polymerase chain reactions (PCR) that demonstrated the absence of C. dubliniensis among the analyzed isolates. The results demonstrated that: 1) all isolates were positive for germ tube formation; 2) the porcentage of agreement in relation to the molecular method for each phenotipic test was respectively: on 76% cornmeal agar, 92% tobacco agar, 92.5% sunflower seed agar, 85% casein agar; 3) 86.5% inability to growth at 45°C. In conclusion, based on phenotypic characteristics, the sunflower seed agar was the more effective method for differentiation between C. albicans and C. dubliniensis; none of the phenotypic methods was 100% effective; molecular identification is necessary for definitive differentiation between C. albicans and C. dubliniensis. / Doutor

Submitted by Lucelia Lucena (lucelia.lucena@ufpe.br) on 2015-03-13T19:32:24Z No. of bitstreams: 2 Nunes,_MJG-_Dissertação_final_2012.pdf: 4070100 bytes, checksum: bc731749f56a74be967907ff824bd9a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Nunes,_MJG-_Dissertação_final_2012.pdf: 4070100 bytes, checksum: bc731749f56a74be967907ff824bd9a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-15 / CAPES, FACEPE / A infecção pelo HPV (Papilomavírus humano) é o fator de risco mais comum para o desenvolvimento de Neoplasia Intraepitelial Anal (NIA). Além do fator viral deve-se considerar história de intercurso anal, infecção pelo HPV em outros sítios (vulvar, vaginal ou cervical) e tabagismo, bem como processos inflamatórios crônicos anorretais que, associados à imunodepressão, podem acelerar a divisão celular e dar origem à neoplasia. Objetivo: Identificar a presença do HPV e avaliar a expressão da proteína p16 em amostras anais de mulheres HIV negativas portadoras de lesões visíveis a anuscopia. Métodos: O estudo foi realizado com pacientes atendidas no Hospital de Câncer de Pernambuco, submetidas a anuscopia de magnificação. Diante da presença de lesões entre o canal anal e a zona de transição com o reto, realizava-se a coleta de células anais e biópsia. Foi extraído DNA para posterior análise da identificação do HPV através da Reação em Cadeia Polimerase (PCR), utilizando-se os primers GP5+/6+ e MY09/11 e genotipagem através do PapilloCheck®. Os fragmentos de tecido obtidos por biópsia foram submetidos a rotina histológica, corados pela Hematoxilina-Eosina e a reação imunohistoquímica para identificação da expressão da proteína p16. Resultados: Foram classificadas histologicamente 65 amostras e agrupadas como: I-Negativo para displasia: Ia-Normal, alterações benignas e/ou inflamatórias 52,31%, Ib-alterações proliferativas 41,54% e II-Neoplasias 6,15%. Entre os casos negativos para displasia 93.44% não apresentaram marcação para p16. Em 75% dos casos de neoplasias observou-se marcação nuclear e/ou citoplasmática, quanto ao padrão de marcação nesses casos verificou marcação em um terço e três terços do epitélio para NIA I e III, respectivamente. Todas as lesões com diagnóstico histológico de neoplasia apresentaram positividade para HPV para o método da PCR utilizando os primers GP5+/6+ e MY09/11. O primer GP5+/6+ mostrou-se mais eficiente para detecção do DNA-HPV em amostras anais do que o MY09/11. Foram genotipadas 82 amostras e destas 50% apresentaram positividade para 20 genótipos do HPV, sendo HPV6 (18.84%) o mais prevalente seguido por HPV16 (15.94%) e HPV53 (10.14%). Foi observada múltipla infecção em 24.64%, mostrando variação entre 2 – 8 tipos virais. Conclusões: O uso de ferramentas adicionais como método molecular (PCR e genotipagem) e imunohistoquímico associados ao exame histológico pode oferecer um diagnóstico do HPV mais preciso nas lesões intraepiteliais anais.

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. / The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 μl of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 μl de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. / The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 μl of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.