A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de alta morbimortalidade e por este motivo é crescente o interesse em se estudar novos biomarcadores da doença visando buscar caminhos para novas estratégias terapêuticas. Neste contexto, a análise do ar exalado pode ser promissora. Baseado nestes dados e na observação de que pacientes com insuficiência cardíaca grave exalam odor peculiar, ainda em estudo piloto, nós identificamos acetona no ar exalado de pacientes com insuficiência cardíaca. Assim, nosso estudo teve por objetivo primário avaliar o papel da acetona exalada como biomarcador do diagnóstico de insuficiência cardíaca e de insuficiência cardíaca descompensada. Como objetivo secundário, avaliar sua relação com a classe funcional segundo a classificação da New York Heart Assocation (NYHA) e sua correlação com o peptídeo natriurético do tipo B (BNP). Entre maio de 2009 e setembro de 2010, pacientes consecutivos com disfunção sistólica (grupo IC) admitidos na emergência (insuficiência cardíaca descompensada grupo ICDESCOMP) e pacientes estáveis nos últimos três meses encaminhados para o teste cardiopulmonar (insuficiência cardíaca compensada grupo ICCOMP) foram submetidos à coleta de ar exalado (extração em água) para posterior análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massas e quantificação por espectrofotometria de absorção, através da reação com salicilaldeído. Entre os 235 pacientes avaliados, 89 foram incluídos (59 com insuficiência cardíaca descompensada e 30 com insuficiência cardíaca compensada), 61% do sexo masculino e com mediana de idade de 52 anos. Vinte indivíduos saudáveis (grupo controle) pareados por idade participaram do estudo. O valor mediano (intervalo interquartil) de acetona exalada foi maior no grupo IC em relação ao controle [3,70 g/L (1,69-10,45 g/L) versus 0,39 g/L (0,30-0,79 g/L), p < 0,001]. O valor mediano de acetona em pacientes com insuficiência cardíaca descompensada foi maior do que no grupo com insuficiência cardíaca compensada [7,80 g/L (3,60-15,20 g/L) versus 1,22 g/L (0,682,19 g/L), p < 0,001]. A acurácia do método tanto para o diagnóstico de insuficiência cardíaca (acetona > 1,16 g/L; área sob a curva = 0,94) quanto para o diagnóstico de insuficiência cardíaca descompensada (acetona > 2,50 g/L; área sob a curva = 0,93) foi aproximadamente 85 %, semelhante à acurácia do BNP (BNP > 42 pg/mL; área sob a curva = 0,97 e BNP > 424 pg/mL; área sob a curva = 0,94, respectivamente). Houve correlação positiva entre acetona exalada e BNP (r = 0,772, p < 0,001). Observamos aumento progressivo nas concentrações de acetona exalada de acordo com a piora da classe funcional segundo NYHA (p < 0,001). Assim, podemos concluir que nosso estudo revelou a acetona exalada como um novo biomarcador do diagnóstico de insuficiência cardíaca e de insuficiência cardíaca descompensada, que está associado à maior gravidade da doença e que apresenta correlação positiva com BNP. Sua dosagem é um novo método de diagnóstico não invasivo que pode ser realizado à beira leito, cuja acurácia é semelhante à do BNP / Heart failure (HF) is a condition associated with high mortality and frequent hospital admissions. In this context, multiple biomarkers of heart failure severity have emerged recently. However, the usefulness of most of these biomarkers has not been fully established. Exhaled breath has been considered a suitable tool (biomarker) to evaluate different diseases. Based on the clinical observation that patients with acute decompensated heart failure (ADHF) exhale a distinct odor, in a pilot study we have identified acetone in exhaled breath of heart failure patients and this study aimed to evaluate the role of acetone as a new biomarker of heart failure and ADHF disease. As secondary aims, we intended to analyze the relation to New York Heart Association (NYHA) class and the correlation with B-Type Natriuretic Peptide (BNP). Patients with systolic dysfunction (HF group) admitted consecutively at the emergency room (ADHF group) and stable patients referred to the cardiopulmonary test (chronic HF CHF group) between May 2009 and September 2010 were submitted to exhaled breath collection (extraction into water). Acetone identification was done by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and its determination by absorption spectrophotometry after reaction with salicylaldehyde. Twenty healthy subjects matched for age were enrolled (control group). Among 235 patients with HF, 89 were included in the study (59 ADHF and 30 CHF), 61% male, with median age of 52 years. Median exhaled breath acetone value (interquartile range) was higher in the HF group when compared to control group [3.7 g/L (1.69-10.45 g/L) versus 0.39 g/L (0.30-0.79 g/L), p < 0.001] and also higher in ADHF when compared to CHF group [7.80 g/L (3.60-15.20 g/L) versus 1.22 g/L (0.682.19 g/L), p < 0,001]. The accuracy of the method to diagnose CHF (Acetone > 1.16 g/L; AUC = 0.94) and ADHF (Acetone > 2.5 g/L; AUC = 0.93) was similar to the accuracy of BNP (BNP > 42 pg/mL; AUC = 0.97 and BNP > 424 pg/mL; AUC = 0.94, respectively). There was a positive correlation between exhaled breath acetone and plasmatic BNP (r = 0.772, p < 0.001). Levels of exhaled breath acetone were different among the four different NYHA classes (p<0.001). In summary, we can conclude that our study showed exhaled breath acetone as a new biomarker of heart failure and ADHF. It is associated with heart failure severity and has a good correlation with BNP. This is a promising non-invasive diagnostic method of heart failure, whose accuracy is equivalent to BNP

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 &mu;l de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. / The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 &mu;l of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.

INTRODUÇÃO: A apnéia obstrutiva do sono é uma doença altamente prevalente na população adulta e associada à morbidade significante. A polissonografia noturna é o método padrão ouro para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. Entretanto seu custo é elevado e a disponibilidade de leitos para polissonografia é muito inferior a demanda. Por esta razão, estratégias para otimizar o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono são urgentes e necessárias. O objetivo deste estudo foi o de comparar um exame diurno de polissonografia, de curta duração e através de sono induzido por benzodiazepínico com a polissonografia noturna para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. MÉTODOS: Foram estudamos 40 pacientes divididos em dois grupos baseados no resultado da polissonografia noturna (Índice de Apnéia e Hipopnéia = 15 eventos/hora). Os dezoito Indivíduos portadores de apnéia obstrutiva do sono (id= 46 + 9 anos) e os vinte e dois controles (id= 38 + 10 anos) foram submetidos a uma polissonografia diurna, de curta duração, com indução de sono através de infusão intravenosa lenta de midazolam. RESULTADOS: O sono induzido foi obtido em todos indivíduos. O tempo total de sono foi de 41,5 + 18,9 minutos. A maioria dos eventos respiratórios durante o sono induzido forma obstrutivos e similares aos observados durante a polissonografia noturna. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o índice de apnéia e hipopnéia bem como com a saturação mínima de oxigênio obtido pela polissonografia noturna e com sono induzido nos grupos estudados (p>0,05). Reunindo os dois grupos, o índice de apnéia e hipopnéia e a menor saturação de oxigênio obtidos pelos dois métodos tiveram correlação significativa (r=0,67 e r=0,77, respectivamente). A sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono através do sono induzido foi 0,83 e 0,72 respectivamente. Nenhuma complicação foi observada durante o sono induzido. CONCLUSÃO: A polissonografia com sono induzido é um método rápido e seguro que pode ser uma alternativa a polissonografia noturna para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. / Polysomnography is the gold standard method for diagnosing obstructive sleep apnea. However, the gap between demand and capacity in performig polysomnography is a major healthcare problem. We sought to compare a short day-time induced sleep with full overnight standard PSG (full PSG) monitoring for the diagnosis of obstructive sleep apnea. We studied 40 patients classified into subjects with obstructive sleep apnea (n=18, age= 46.8 + 9.1yr) and controls (n=22, age= 38.5 + 10,7yr) groups, based on the results of a full polysomnography (apnea-hypopnea index >= 15 events/hour). All subjects underwent a short day-time polysomnography. Sleep was induced by slow intravenous drip infusion of midazolam and achived in all subjects. Total time of induced sleep was 41.5 ± 18.9 min. The majority of the respiratory events during induced sleep were obstructive and similar to that observed during full polysomnography. There was no difference between apnea-hypopnea index obtained by full and short polysomnography in obstructive sleep apnea and control groups (p>0,05). The same occured to lowest O2 saturation. Taken all together, apnea-hypopnea index and lowest O2 saturation during short polysomnography correlated well with full polysomnography (r=0,67 and r=0,77, respectively). Sensitivity and specificity for the diagnosis of obstructive sleep apnea by induced sleep was 0,83 and 0,72, respectively. No complications were observed. Induced sleep PSG by midazolan is a short and safe study that may represent an alternative for full polysomnography in the diagnosis of obstructive sleep apnea.

A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de alta morbimortalidade e por este motivo é crescente o interesse em se estudar novos biomarcadores da doença visando buscar caminhos para novas estratégias terapêuticas. Neste contexto, a análise do ar exalado pode ser promissora. Baseado nestes dados e na observação de que pacientes com insuficiência cardíaca grave exalam odor peculiar, ainda em estudo piloto, nós identificamos acetona no ar exalado de pacientes com insuficiência cardíaca. Assim, nosso estudo teve por objetivo primário avaliar o papel da acetona exalada como biomarcador do diagnóstico de insuficiência cardíaca e de insuficiência cardíaca descompensada. Como objetivo secundário, avaliar sua relação com a classe funcional segundo a classificação da New York Heart Assocation (NYHA) e sua correlação com o peptídeo natriurético do tipo B (BNP). Entre maio de 2009 e setembro de 2010, pacientes consecutivos com disfunção sistólica (grupo IC) admitidos na emergência (insuficiência cardíaca descompensada grupo ICDESCOMP) e pacientes estáveis nos últimos três meses encaminhados para o teste cardiopulmonar (insuficiência cardíaca compensada grupo ICCOMP) foram submetidos à coleta de ar exalado (extração em água) para posterior análise qualitativa por cromatografia gasosa acoplado à espectrometria de massas e quantificação por espectrofotometria de absorção, através da reação com salicilaldeído. Entre os 235 pacientes avaliados, 89 foram incluídos (59 com insuficiência cardíaca descompensada e 30 com insuficiência cardíaca compensada), 61% do sexo masculino e com mediana de idade de 52 anos. Vinte indivíduos saudáveis (grupo controle) pareados por idade participaram do estudo. O valor mediano (intervalo interquartil) de acetona exalada foi maior no grupo IC em relação ao controle [3,70 g/L (1,69-10,45 g/L) versus 0,39 g/L (0,30-0,79 g/L), p < 0,001]. O valor mediano de acetona em pacientes com insuficiência cardíaca descompensada foi maior do que no grupo com insuficiência cardíaca compensada [7,80 g/L (3,60-15,20 g/L) versus 1,22 g/L (0,682,19 g/L), p < 0,001]. A acurácia do método tanto para o diagnóstico de insuficiência cardíaca (acetona > 1,16 g/L; área sob a curva = 0,94) quanto para o diagnóstico de insuficiência cardíaca descompensada (acetona > 2,50 g/L; área sob a curva = 0,93) foi aproximadamente 85 %, semelhante à acurácia do BNP (BNP > 42 pg/mL; área sob a curva = 0,97 e BNP > 424 pg/mL; área sob a curva = 0,94, respectivamente). Houve correlação positiva entre acetona exalada e BNP (r = 0,772, p < 0,001). Observamos aumento progressivo nas concentrações de acetona exalada de acordo com a piora da classe funcional segundo NYHA (p < 0,001). Assim, podemos concluir que nosso estudo revelou a acetona exalada como um novo biomarcador do diagnóstico de insuficiência cardíaca e de insuficiência cardíaca descompensada, que está associado à maior gravidade da doença e que apresenta correlação positiva com BNP. Sua dosagem é um novo método de diagnóstico não invasivo que pode ser realizado à beira leito, cuja acurácia é semelhante à do BNP / Heart failure (HF) is a condition associated with high mortality and frequent hospital admissions. In this context, multiple biomarkers of heart failure severity have emerged recently. However, the usefulness of most of these biomarkers has not been fully established. Exhaled breath has been considered a suitable tool (biomarker) to evaluate different diseases. Based on the clinical observation that patients with acute decompensated heart failure (ADHF) exhale a distinct odor, in a pilot study we have identified acetone in exhaled breath of heart failure patients and this study aimed to evaluate the role of acetone as a new biomarker of heart failure and ADHF disease. As secondary aims, we intended to analyze the relation to New York Heart Association (NYHA) class and the correlation with B-Type Natriuretic Peptide (BNP). Patients with systolic dysfunction (HF group) admitted consecutively at the emergency room (ADHF group) and stable patients referred to the cardiopulmonary test (chronic HF CHF group) between May 2009 and September 2010 were submitted to exhaled breath collection (extraction into water). Acetone identification was done by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and its determination by absorption spectrophotometry after reaction with salicylaldehyde. Twenty healthy subjects matched for age were enrolled (control group). Among 235 patients with HF, 89 were included in the study (59 ADHF and 30 CHF), 61% male, with median age of 52 years. Median exhaled breath acetone value (interquartile range) was higher in the HF group when compared to control group [3.7 g/L (1.69-10.45 g/L) versus 0.39 g/L (0.30-0.79 g/L), p < 0.001] and also higher in ADHF when compared to CHF group [7.80 g/L (3.60-15.20 g/L) versus 1.22 g/L (0.682.19 g/L), p < 0,001]. The accuracy of the method to diagnose CHF (Acetone > 1.16 g/L; AUC = 0.94) and ADHF (Acetone > 2.5 g/L; AUC = 0.93) was similar to the accuracy of BNP (BNP > 42 pg/mL; AUC = 0.97 and BNP > 424 pg/mL; AUC = 0.94, respectively). There was a positive correlation between exhaled breath acetone and plasmatic BNP (r = 0.772, p < 0.001). Levels of exhaled breath acetone were different among the four different NYHA classes (p<0.001). In summary, we can conclude that our study showed exhaled breath acetone as a new biomarker of heart failure and ADHF. It is associated with heart failure severity and has a good correlation with BNP. This is a promising non-invasive diagnostic method of heart failure, whose accuracy is equivalent to BNP

INTRODUÇÃO: A apnéia obstrutiva do sono é uma doença altamente prevalente na população adulta e associada à morbidade significante. A polissonografia noturna é o método padrão ouro para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. Entretanto seu custo é elevado e a disponibilidade de leitos para polissonografia é muito inferior a demanda. Por esta razão, estratégias para otimizar o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono são urgentes e necessárias. O objetivo deste estudo foi o de comparar um exame diurno de polissonografia, de curta duração e através de sono induzido por benzodiazepínico com a polissonografia noturna para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. MÉTODOS: Foram estudamos 40 pacientes divididos em dois grupos baseados no resultado da polissonografia noturna (Índice de Apnéia e Hipopnéia = 15 eventos/hora). Os dezoito Indivíduos portadores de apnéia obstrutiva do sono (id= 46 + 9 anos) e os vinte e dois controles (id= 38 + 10 anos) foram submetidos a uma polissonografia diurna, de curta duração, com indução de sono através de infusão intravenosa lenta de midazolam. RESULTADOS: O sono induzido foi obtido em todos indivíduos. O tempo total de sono foi de 41,5 + 18,9 minutos. A maioria dos eventos respiratórios durante o sono induzido forma obstrutivos e similares aos observados durante a polissonografia noturna. Não houve diferença estatisticamente significativa entre o índice de apnéia e hipopnéia bem como com a saturação mínima de oxigênio obtido pela polissonografia noturna e com sono induzido nos grupos estudados (p>0,05). Reunindo os dois grupos, o índice de apnéia e hipopnéia e a menor saturação de oxigênio obtidos pelos dois métodos tiveram correlação significativa (r=0,67 e r=0,77, respectivamente). A sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono através do sono induzido foi 0,83 e 0,72 respectivamente. Nenhuma complicação foi observada durante o sono induzido. CONCLUSÃO: A polissonografia com sono induzido é um método rápido e seguro que pode ser uma alternativa a polissonografia noturna para o diagnóstico de apnéia obstrutiva do sono. / Polysomnography is the gold standard method for diagnosing obstructive sleep apnea. However, the gap between demand and capacity in performig polysomnography is a major healthcare problem. We sought to compare a short day-time induced sleep with full overnight standard PSG (full PSG) monitoring for the diagnosis of obstructive sleep apnea. We studied 40 patients classified into subjects with obstructive sleep apnea (n=18, age= 46.8 + 9.1yr) and controls (n=22, age= 38.5 + 10,7yr) groups, based on the results of a full polysomnography (apnea-hypopnea index >= 15 events/hour). All subjects underwent a short day-time polysomnography. Sleep was induced by slow intravenous drip infusion of midazolam and achived in all subjects. Total time of induced sleep was 41.5 ± 18.9 min. The majority of the respiratory events during induced sleep were obstructive and similar to that observed during full polysomnography. There was no difference between apnea-hypopnea index obtained by full and short polysomnography in obstructive sleep apnea and control groups (p>0,05). The same occured to lowest O2 saturation. Taken all together, apnea-hypopnea index and lowest O2 saturation during short polysomnography correlated well with full polysomnography (r=0,67 and r=0,77, respectively). Sensitivity and specificity for the diagnosis of obstructive sleep apnea by induced sleep was 0,83 and 0,72, respectively. No complications were observed. Induced sleep PSG by midazolan is a short and safe study that may represent an alternative for full polysomnography in the diagnosis of obstructive sleep apnea.

O desempenho de seis métodos de extração de DNA de oocistos de Cryptosporidium spp. em fezes foram avaliados pela nested PCR do gene SSU rRNA. Os métodos consistem na combinação com pequenas variações de duas técnicas para a liberação de esporozoítos (indução de excistamento/E ou choque térmico/C) e três técnicas de purificação de DNA (fenol-clorofórmio/F, GuSCN-sílica/S ou kit QIAmp DNA Stool Mini/K). Para a avaliação da sensibilidade analítica, os testes foram realizados a partir de diluições seriadas de oocistos purificados, na ausência e na presença de 100 &mu;l de fezes bovinas. A sensibilidade diagnóstica foi avaliada pela comparação com o método microscópico de centrífugo-flutuação em sacarose (padrão-ouro) em 15 amostras fecais de diferentes hospedeiros naturalmente infectados. Na ausência de fezes, foram avaliados apenas os métodos EF, ES, CF e CS, sendo que EF apresentou sensibilidade analítica superior, possibilitando a detecção de até 1 oocisto. Na presença de fezes, os métodos EF, EK e CK apresentaram desempenhos equivalentes, com sensibilidade de 104 oocistos. As maiores sensibilidades diagnósticas foram obtidas pelos métodos EK e CK, que possibilitaram a detecção de 13 (86,7%) das 15 amostras. Devido à alta sensibilidade analítica de EF em amostras purificadas, avaliou-se sua sensibilidade diagnóstica em amostras de oocistos purificados pelo método de centrífugo-flutuacão em sacarose, obtendo-se 100% de detecção. A presença de inibidores nas amostras fecais reduziu fortemente a sensibilidade das reações de PCR a partir de DNA extraído pelos métodos avaliados, sendo recomendável o emprego de técnicas de purificação de oocistos previamente à extração de DNA. Os resultados apontam para uma melhor eficiência dos métodos de indução de excistamento e kit QIAmp DNA Stool Mini. / The performance of six methods for DNA extraction from Cryptosporidium spp. oocysts in feces were evaluated by nested PCR of SSU rRNA gene. The methods are the combination with small variations of two techniques for the release of sporozoites (induction of excystation/E or thermal shock/C) and three techniques for DNA purification (phenol-chloroform/F, GuSCN-silica/S or QIAmp DNA Stool Mini kit/K). For the evaluation of analytical sensitivity, tests were made from serial dilutions of purified oocysts, in absence and in presence of 100 &mu;l of cattle feces. The diagnostic sensitivity was assessed by comparison with the microscopic method of centrifugalflotation in sucrose (gold standard) in 15 fecal samples from different naturally infected hosts. In the absence of feces, only methods EF, ES, FC, and CS were tested. EF had the highest analytical sensitivity, enabling the detection of up to 1 oocyst. In the presence of feces, methods EF, EK, and CK showed similar performance, with sensitivity of 104 oocysts. The highest sensitivities were obtained by methods EK and CK, which enabled the detection of 13 (86.7%) of 15 samples. Due to the high analytical sensitivity of EF in purified samples, its diagnostic sensitivity was evaluated in samples of purified oocysts by the method of centrifugal-flotation in sucrose, resulting in 100% detection. The presence of inhibitors in fecal samples greatly reduced the sensitivity of the PCR reactions from DNA extraction methods evaluated, and the use of techniques for purification of oocysts prior to DNA extraction is recommended. The results show a better performance of the methods of induction of excystation and QIAmp DNA Stool Mini kit.