Estudos sobre extinção do condicionamento Pavloviano envolvendo estímulos aversivos (condicionamento de medo) são considerados como análogos experimentais das terapias por exposição, nas quais pacientes são confrontados com situações temidas (porém seguras) com o objetivo de reduzir respostas de medo. Nos experimentos sobre extinção, estímulos que eliciam respostas condicionais (estímulos condicionais, CSs) por terem sido previamente associados a estímulos aversivos incondicionais (estímulos incondicionais, US) são apresentados repetidamente na ausência do US. Como resultado, as respostas condicionais de medo diminuem. Um desafio nessa área é sustentar a redução do medo a longo prazo, visto que o retorno de respostas condicionais (retorno do medo) é comumente observado no laboratório e na clínica. Estudos recentes conseguiram impedir o retorno do medo por meio da extinção pós-recuperação (post-retrieval extinction, PRE), procedimento que consiste em extinção após a apresentação de um estímulo que estava presente durante o condicionamento (retrieval cue). Contudo, tentativas de replicação desse procedimento geraram resultados conflitantes. O objetivo desta tese é contribuir para o debate sobre as variáveis envolvidas no retorno do medo com o uso da PRE em humanos. Um experimento foi conduzido para verificar se o comportamento verbal emitido pelos participantes durante a PRE pode mudar a probabilidade de retorno do medo. Participantes adultos (n=57) foram submetidos a condicionamento Pavloviano diferencial no qual uma fotografia de uma face humana (CS+) foi pareada a um estímulo elétrico leve (US), enquanto que outra fotografia de face humana nunca foi pareada ao US. No dia seguinte, os participantes foram alocados em um de três grupos (n=19): Experimental atividade verbal relacionada (Exp R), Experimental atividade verbal não-relacionada (Exp N) e Controle. Todos os grupos passaram por extinção, mas para os grupos experimentais, esse procedimento foi antecedido em 10 min por uma pista (retrieval cue) que consistia na apresentação não-reforçada dos CSs. Durante o intervalo entre essa pista e a extinção, os participantes do grupo Exp R se engajaram numa atividade na qual tinham que fazer verbalizações relacionadas às contingências experimentais, enquanto que os participantes do grupo Exp N tinham que fazer verbalizações que não estavam relacionadas às contingências experimentais. O grupo controle foi submetido à extinção tradicional (sem apresentação de pista ou 10 min de intervalo antes da extinção). No terceiro dia, todos os participantes passaram por um teste que consistia em quatro apresentações do US seguidas de extinção (teste de restabelecimento). As respostas de condutância da pele frente ao CS e ao US foram usadas como medidas das respostas condicionais e incondicionais, respectivamente. Retorno do medo, medido pelo responder diferencial (discriminação entre CS+ e CS-) no teste, estava presente no grupo controle e em menor grau no grupo Exp R. Em comparação, sujeitos do grupo Exp N não apresentaram responder diferencial em função de diminuição nas respostas frente ao CS+ e aumento nas respostas frente ao CS-. Este estudo mostra que o comportamento verbal pode mudar os efeitos da PRE, o que tem implicações para a sua adaptação para uso clínico / Studies on extinction of Pavlovian conditioning involving aversive stimuli (fear conditioning) have been considered experimental analogues of exposure treatments in which patients are confronted with feared but safe situations in order to reduce fear responses. In extinction experiments, stimuli that elicit conditioned fear responses (conditioned stimuli, CS) because they have been previously associated with aversive stimuli (unconditioned stimuli, US) are repeatedly presented in the absence of the US. As a result, conditioned fear responses tend to diminish. The challenge in this area is how to maintain fear reduction in the long term, as return of conditioned fear responses (return of fear) is commonly observed in laboratory and clinical settings. Recent studies were able to prevent return of fear by means of post-retrieval extinction (PRE), a procedure consisting of extinction after the presentation of a stimulus that was present during conditioning (retrieval cue). However, replications of this procedure have yielded mixed results. With this thesis, I attempted to contribute to the debate on the variables that determine the probability of return of fear after PRE in humans. An experiment was conducted to test if verbal behavior emitted by participants during PRE can change the probability of return of fear. Adult participants (n=57) underwent differential Pavlovian conditioning in which one photograph of a human face (CS+) was paired with a mild electrical stimulus (US), whereas another photograph of human face was not paired with the US. On the next day, participants were designated to one of three groups (n=19): Experimental related verbal activity (Exp R), Experimental non-related verbal activity (Exp N), and Control. All groups underwent extinction but for experimental groups, a retrieval cue consisting of a single unreinforced presentation of the CSs was carried out 10-min prior to extinction. During the interval between retrieval cue and extinction, participants from the Exp R group were required to engage in an activity directing their overt verbal behavior towards the experimental contingencies, whereas participants from the Exp N group were required to engage in an activity directing their overt verbal behavior away from the experimental contingencies. Control group underwent a standard extinction procedure (no retrieval cue or 10-min interval prior to extinction). On a third day, all participants underwent a test consisting of four presentations of the US alone followed by extinction (reinstatement test). Skin conductance responses to the presentations of the CSs and US were used as the dependent measure of conditioned and unconditioned responses, respectively. Return of fear, as measured through differential responding (discrimination between CS+ and CS-), was present in subjects from the control group and to a lesser extent in subjects from the Exp R group. In contrast, differential responding was abolished in subjects from the Exp N group, a result that was dependent both on decrease in responses to the CS+ as well as increase in responses to the CS-. This study shows that verbal behavior might change the effects of PRE, which can have implication for its adaptation for treating pathological fear

Estudos sobre extinção do condicionamento Pavloviano envolvendo estímulos aversivos (condicionamento de medo) são considerados como análogos experimentais das terapias por exposição, nas quais pacientes são confrontados com situações temidas (porém seguras) com o objetivo de reduzir respostas de medo. Nos experimentos sobre extinção, estímulos que eliciam respostas condicionais (estímulos condicionais, CSs) por terem sido previamente associados a estímulos aversivos incondicionais (estímulos incondicionais, US) são apresentados repetidamente na ausência do US. Como resultado, as respostas condicionais de medo diminuem. Um desafio nessa área é sustentar a redução do medo a longo prazo, visto que o retorno de respostas condicionais (retorno do medo) é comumente observado no laboratório e na clínica. Estudos recentes conseguiram impedir o retorno do medo por meio da extinção pós-recuperação (post-retrieval extinction, PRE), procedimento que consiste em extinção após a apresentação de um estímulo que estava presente durante o condicionamento (retrieval cue). Contudo, tentativas de replicação desse procedimento geraram resultados conflitantes. O objetivo desta tese é contribuir para o debate sobre as variáveis envolvidas no retorno do medo com o uso da PRE em humanos. Um experimento foi conduzido para verificar se o comportamento verbal emitido pelos participantes durante a PRE pode mudar a probabilidade de retorno do medo. Participantes adultos (n=57) foram submetidos a condicionamento Pavloviano diferencial no qual uma fotografia de uma face humana (CS+) foi pareada a um estímulo elétrico leve (US), enquanto que outra fotografia de face humana nunca foi pareada ao US. No dia seguinte, os participantes foram alocados em um de três grupos (n=19): Experimental atividade verbal relacionada (Exp R), Experimental atividade verbal não-relacionada (Exp N) e Controle. Todos os grupos passaram por extinção, mas para os grupos experimentais, esse procedimento foi antecedido em 10 min por uma pista (retrieval cue) que consistia na apresentação não-reforçada dos CSs. Durante o intervalo entre essa pista e a extinção, os participantes do grupo Exp R se engajaram numa atividade na qual tinham que fazer verbalizações relacionadas às contingências experimentais, enquanto que os participantes do grupo Exp N tinham que fazer verbalizações que não estavam relacionadas às contingências experimentais. O grupo controle foi submetido à extinção tradicional (sem apresentação de pista ou 10 min de intervalo antes da extinção). No terceiro dia, todos os participantes passaram por um teste que consistia em quatro apresentações do US seguidas de extinção (teste de restabelecimento). As respostas de condutância da pele frente ao CS e ao US foram usadas como medidas das respostas condicionais e incondicionais, respectivamente. Retorno do medo, medido pelo responder diferencial (discriminação entre CS+ e CS-) no teste, estava presente no grupo controle e em menor grau no grupo Exp R. Em comparação, sujeitos do grupo Exp N não apresentaram responder diferencial em função de diminuição nas respostas frente ao CS+ e aumento nas respostas frente ao CS-. Este estudo mostra que o comportamento verbal pode mudar os efeitos da PRE, o que tem implicações para a sua adaptação para uso clínico / Studies on extinction of Pavlovian conditioning involving aversive stimuli (fear conditioning) have been considered experimental analogues of exposure treatments in which patients are confronted with feared but safe situations in order to reduce fear responses. In extinction experiments, stimuli that elicit conditioned fear responses (conditioned stimuli, CS) because they have been previously associated with aversive stimuli (unconditioned stimuli, US) are repeatedly presented in the absence of the US. As a result, conditioned fear responses tend to diminish. The challenge in this area is how to maintain fear reduction in the long term, as return of conditioned fear responses (return of fear) is commonly observed in laboratory and clinical settings. Recent studies were able to prevent return of fear by means of post-retrieval extinction (PRE), a procedure consisting of extinction after the presentation of a stimulus that was present during conditioning (retrieval cue). However, replications of this procedure have yielded mixed results. With this thesis, I attempted to contribute to the debate on the variables that determine the probability of return of fear after PRE in humans. An experiment was conducted to test if verbal behavior emitted by participants during PRE can change the probability of return of fear. Adult participants (n=57) underwent differential Pavlovian conditioning in which one photograph of a human face (CS+) was paired with a mild electrical stimulus (US), whereas another photograph of human face was not paired with the US. On the next day, participants were designated to one of three groups (n=19): Experimental related verbal activity (Exp R), Experimental non-related verbal activity (Exp N), and Control. All groups underwent extinction but for experimental groups, a retrieval cue consisting of a single unreinforced presentation of the CSs was carried out 10-min prior to extinction. During the interval between retrieval cue and extinction, participants from the Exp R group were required to engage in an activity directing their overt verbal behavior towards the experimental contingencies, whereas participants from the Exp N group were required to engage in an activity directing their overt verbal behavior away from the experimental contingencies. Control group underwent a standard extinction procedure (no retrieval cue or 10-min interval prior to extinction). On a third day, all participants underwent a test consisting of four presentations of the US alone followed by extinction (reinstatement test). Skin conductance responses to the presentations of the CSs and US were used as the dependent measure of conditioned and unconditioned responses, respectively. Return of fear, as measured through differential responding (discrimination between CS+ and CS-), was present in subjects from the control group and to a lesser extent in subjects from the Exp R group. In contrast, differential responding was abolished in subjects from the Exp N group, a result that was dependent both on decrease in responses to the CS+ as well as increase in responses to the CS-. This study shows that verbal behavior might change the effects of PRE, which can have implication for its adaptation for treating pathological fear

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The reactivation of a memory results in its destabilization, requiring a process of memory reconsolidation to maintain it. Spermidine is an endogenous aliphatic amine with polycationic structure that modulates N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity and improves memory. Recent evidence suggests that systemic administration of spermidine improves the reconsolidation of fear memory. Here we determined whether the calcium-dependent protein kinase (PKC) signaling pathway is involved in the improvement of fear memory reconsolidation induced by intrahippocampal (ih) administration of spermidine in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty-four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, spermidine (2-200 ρmol/site); the PKC inhibitor, 3-[1- (dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl) maleimide hydrochloride (GF 109203X, 0.3 - 30 ρg/site); the antagonist of the polyamine-binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.2 - 200 ρmol/site) or the PKC activator, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 0.02 - 2 nmol/site) were injected intra-hipocampally (i.h.). Testing was carried out in the same apparatus, twenty-four hours after reactivation. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While the post-reactivation administration of spermidine (20 and 200 ρmol/site) improved, GF 109203X (1, 10 and 30 ρg/site) impaired memory reconsolidation. GF 109203X (0.3 ρg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. The post-reactivation administration of arcaine (200 pmol/site) impaired and PMA (2 nmol/site) improved memory reconsolidation. PMA (0.2 nmol/site) prevented arcaine (200 ρmol/site)-induced impairment of memory reconsolidation. The protein synthesis inhibitor anisomycin (2 μg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation. These results suggest that the enhancement of memory reconsolidation induced by the administration of spermidine involves PKC activation. / A reativação de uma memória resulta na sua desestabilização, que exigem um processo de reconsolidação de memória para mantê-la. A espermidina é uma amina alifática endógena com estrutura policatiônica que modula a atividade do receptor Nmetil- D-aspartato (NMDA) e melhora a memória. Evidências recentes sugerem que a administração sistêmica de espermidina melhora a reconsolidação da memória de medo. No entanto não se sabe se a administração intra hipocampal de espermidina melhora a reconsolidação da memória e nem se a proteína cinase dependente de cálcio (PKC) e síntese proteica estão envolvidas neste efeito. Portanto, no presente estudo verificou-se o envolvimento da PKC e da síntese proteica na melhora da reconsolidação da memória do medo induzida pela administração intrahipocampal (ih) de espermidina em ratos. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual utilizando-se choque de 0,4 mA como estímulo incondicionado. Vinte e quatro horas após o treino, os animais foram re-expostos ao aparelho na ausência de choque (sessão reativação). Imediatamente após a sessão de reativação foram administradas, por via ih, espermidina (2-200 ρmol/sítio); o inibidor da PKC, 3- [1- (dimetilaminopropil) indol-3-il] -4- (indol-3-il) maleimida (GF 109203X, 0,3-30 ρg/sítio); o antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor de NMDA, arcaína (0,2-200 ρmol/sítio) ou o ativador de PKC, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 0,02-2 nmol/sítio). Os testes foram realizados no mesmo aparelho, 24 horas após a sessão de reativação. O tempo de imobilidade dos animais durante o teste foi considerado como medida de memória. Enquanto a administração de espermidina (20 e 200 ρmol/sítio) melhorou, GF 109203X (1, 10 e 30 ρg/sítio) prejudicou a reconsolidação da memória. O GF 109203X (0,3 ρg/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). A administração da arcaína (200 pmol/sítio) prejudicou e PMA (2 nmol/sítio) melhorou a reconsolidação da memória. O PMA (0,2 nmol/sítio) preveniu o prejuízo na reconsolidação da memória induzido por arcaína (200 ρmol/sítio). O inibidor de síntese de proteica, anisomicina (2 ug/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). Estas drogas não tiveram nenhum efeito sobre a memória quando foram administrados na ausência da sessão de reativação. Estes resultados sugerem que a melhora da reconsolidação da memória induzida pela administração ih de espermidina envolve a síntese proteica e a ativação de PKC.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The memory may be studied according with memory's phases, which is acquisition, consolidation and recall. Memories once consolidated, are no more susceptible to interventions, but when reactivated, some of these memories again become labile and vulnerable, and to persist need to have a new stabilization process called reconsolidation. Previous studies described that endogenous polyamines, spermine and spermidine, which bind and modulate the activity of NMDA receptors are involved in memory acquisition and consolidation. However there are no studies showing the effect of these drugs on memory reconsolidation. Accordingly, the aim of this study was investigate the effect of polyamines on fear memory reconsolidation in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, SPD (1 30 mg/kg, i.p.), the antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.1 10 mg/kg, i.p.) or spermidine plus arcaine were injected, and the animals were tested in the same apparatus 24 h later. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While SPD (3 and 10 mg/kg) improved, arcaine (1 and 10 mg/kg) impaired memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation, or 6 h after reactivation session. Arcaine (0.1 mg/kg, i.p.) prevented SPD (3 mg/kg)-induced improvement of memory reconsolidation. Accordingly, SPD (1 mg/kg) prevented arcaine (10 mg/kg)-induced impairment of memory reconsolidation. The amnesic effect of arcaine was not reversed by arcaine administration prior to test, ruling out state dependence in this effect. These results suggest that systemic administration of polyamine binding site ligands modulate memory reconsolidation, however further studies are required to elucidate the mechanism by which polyamines modulate memory reconsolidation. / A memória pode ser estudada de acordo com as suas fases, que são a aquisição, a consolidação e a evocação. As memórias, uma vez consolidadas, não podem mais ser modificadas, porém quando reativadas, ou seja, quando recuperadas, muitas destas voltam a se tornar instáveis e vulneráveis e para que persistam precisam passar por um novo processo de estabilização, chamado reconsolidação. Têm sido descrito que as poliaminas endógenas, espermidina e espermina, que se ligam e modulam a atividade do receptor NMDA, estão envolvidas na aquisição e na consolidação da memória. Contudo, não há trabalhos mostrando o efeito destas substâncias na reconsolidação da memória. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito das poliaminas na reconsolidação da memória de medo em ratos. Para isso, ratos machos adultos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual, onde receberam três choque de 0,4 mA, com intervalo de 40 seg entre cada choque e, 24 horas após, os animais foram recolocados no aparelho do treino por um período de 3 min, na ausência de choque, para reativar a memória. Após a reativação foi administrado, pela via intraperitoneal, salina, espermidina (1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou espermidina mais arcaína e vinte e quatro horas após, os animais foram testados, onde foi avaliado a imobilidade destes durante 6 min. Foram realizados experimentos controles para avaliar a especificidade das drogas no processo de reconsolidação. Além disso, foi avaliado se o possível efeito da arcaína na reconsolidação poderia ser explicado por dependência de estado. Assim, enquanto a espermidina (3 e 10 mg/kg) melhorou, a arcaína (1 e 10 mg/kg) piorou a reconsolidação da memória. Estas drogas não tiveram efeito sobre a memória quando foram administradas na ausência da reativação ou 6 horas após. A arcaína (0,1 mg/kg) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida pela espermidina (3 mg/kg) e por sua vez, a espermidina (1 mg/kg) preveniu o prejuízo da reconsolidação da memória induzido pela arcaína (10 mg/kg). O efeito amnésico da arcaína não foi revertido pela administração da mesma dose de arcaína antes do teste, descartando a hipótese de dependência de estado para o efeito da arcaína na reconsolidação. Estes resultados sugerem que a administração sistêmica dos ligantes do sítio de ligação das poliaminas do receptor NMDA modulam a reconsolidação da memória, todavia são necessários mais estudos a fim de elucidar o mecanismo pelo qual as poliaminas modulam a reconsolidação da memória.