O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

O HLB tem sido uma das principais doenças responsáveis pelos prejuízos econômicos enfrentados na citricultura mundial. Essa doença é associada a três espécies de bactérias de colonização restrita ao floema das plantas, as quais são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. Uma vez que na?o ha? medidas curativas para a doenc?a, o manejo baseia-se em medidas preventivas incluindo o controle do inseto vetor. O silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) é uma nova ferramenta biotecnológica no controle de pragas, pois, proporciona uma ação eficiente e gene-espécie específica. Entretanto, essa tecnologia depende de análises de expressão gênica com genes de referência adequados e estáveis. Este trabalho buscou selecionar e validar a estabilidade da expressão de seis genes de referência potenciais de D. citri sob diferentes condições experimentais e avaliar a biologia deste inseto em plantas transgênicas de laranja doce expressando dsRNA do gene DcV-ATPase-A visando o seu controle. Para isso, foram avaliados: 1) a estabilidade de seis genes candidatos a referência: fator de elongação 1alfa (EF 1-α), actina (ACT), gliceradeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteina ribossomal L7 (RPL7), proteina ribossomal L17 (RPL17) e alfa tubulina (TUB), através de diferentes algorítimos matemáticos: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper e Genorm em cinco estádios de desenvolvimento (Ninfas de 1° e 2° ínstar; Ninfa de 3° ínstar; Ninfas de 4° e 5° ínstar , Adulto de 1 dia; Adulto de 10 dias) e dois hospedeiros (Citrus sinensis e Murraya paniculata). O ranquamento final dos genes foi obtido através do RefFinder e a validação dos mesmos através do gene V-ATPase-A; 2) a sobrevivência de psilídeos adultos alimentados em plantas transgênicas; a biologia da D. citri em plantas transgênicas expressando o dsRNA do gene DcV-ATPase-A; e a expressão relativa deste gene. Recomenda-se a utilização de dois genes de referência quando consideram-se diferentes hospedeiros e fases de desenvolvimento distintas. Para análise de expressão gênica, independentemente da fase de desenvolvimento do inseto, quando utiliza-se M. paniculata como hospedeiro de criação, recomenda-se a utilização dos genes GAPDH e RPL7, enquanto que para C. sinensis sugerem-se os genes GAPDH e EF 1-α. Os bioensaios demonstraram a internalização pelo inseto das moléculas de dsRNA/siRNA produzidas pelas plantas transgênicas e o potencial de redução da expressão do gene alvo pelo RNAi. Apesar da ausência de fenótipo letal em psilídeos adultos alimentados nas plantas transgênicas, alterações significativas na duração, sobrevivência e longevidade foram verificadas em D. citri quando esta desenvolveu seu ciclo biológico nas plantas que expressam dsRNA do gene DcVAPTase-A. / HLB has been one of the main diseases responsible for the economic losses faced in the citriculture worldwide. This disease is associated to three species of colonization bacteria restricted to the phloem of the plants, which are transmitted by the psyllid Diaphorina citri. Since there are no curative methos for the disease, management is based on preventive methods including vector insect control. Gene silencing by RNA interference (RNAi) has been presented as a new biotechnological tool in pest control, since it provides a efficient and especific gene-specie control. However, this technology depends on analyzes of gene expression with suitable and stable reference genes. Thus, this work aimed to select and validate the stability of the expression of six potential reference genes of D. citri under different experimental conditions and to evaluate the biology of this insect on sweet orange transgenic plants expressing dsRNA of DcV-ATPase-A gene aiming their control. In order to do this, it was evaluated: 1) the stability of six candidate reference genes: elongation factor 1 alpha (EF 1-α), actin (ACT), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ribosomal protein L7 (RPL7), ribosomal protein L17 (RPL17) e alpha tubulin (TUB), through different mathematical algorithms: Delta Ct, NormFinder, BestKeeper and Genorm in five developmental stages and two hosts (Citrus sinensis and Murraya paniculata). The final rank was obtained through the RefFinder and validated by the V-ATPase-A gene; 2) the survival of adult psyllids fed on transgenic plants; the biology of D. citri in transgenic plants expressing dsRNA of the DcV-ATPase-A gene; and the relative expression of this gene. According to our results, two reference genes are recommended when different hosts and different developmental stages are considered. For gene expression analysis, regardless the insect developmental stage, when using M. paniculata as a breeding host, it is recommended to use GAPDH and RPL7 genes, whereas for C. sinensis GAPDH and EF 1-α are indicated. The bioassays demonstrated the insect\'s internalization of the dsRNA / siRNA molecules produced by the transgenic plants and the potential for reducing the target gene expression by RNAi. Despite the absence of lethal phenotype in adult psyllids fed to transgenic plants, significant changes in duration, survival and longevity were observed for D. citri when it developed its biological cycle in plants that express dsRNA of the DcVAPTase-A gene.

Reticulitermes flavipes is one of the most common termite species in the world, and has been an intriguing research model due to its ecological and biological and economic significance. The fundamental biological question addressed by this study is to elucidate the role of miRNAs in termite development and how miRNA can influence labor division. miRNAs are short non-coding RNAs that have an important role in gene regulation at post-transcriptional level, and can potentially be involved in the regulation of caste polyphenism. Using a computational approach, I identified 167 conserved and 33 novel miRNAs in the dataset. miR-iab-4 and 19 other miRNAs showed highly differential expression between worker and soldier, and their possible roles in termite biology are discussed. To reliably quantify miRNA expression in experiments, I tested the stability of 10 miRNAs as reference gene using quantitative real-time PCR. miR-8_3, bantam and miR-276a-3p are the most stable miRNAs in different castes, pre-soldier formation, and different tissues, respectively. Lastly, the predicted miRNA expression is verified by the qRT-PCR for 8 miRNAs. Overall, this study shows that miRNA plays a role in mediating the work-soldier transition in R. flavipes.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.

Define-se como bócio um aumento benigno de volume da tireoide não relacionado a doenças autoimunes, infiltrativas ou neoplasias. A causa mais comum é carência de iodo, no entanto, mesmo em áreas com suficiência de iodo, os bócios ocorrem, por mecanismos desconhecidos, e são mais comuns nas mulheres. A presença dos receptores clássicos do estrogênio (ERα e ERβ) no tecido tireoidiano já foi descrita, bem como o efeito direto do estradiol na glândula. Porém, a presença do receptor de estrogênio acoplado a proteína G (GPER1) em bócio ainda não foi descrita. Esse estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica e protéica de GPER1 em tecido de tireoide humano normal e bócio, e estimar a prevalência de expressão gênica ou protéica do GPER1 nesses tecidos. As metodologias utilizadas para avaliar a expressão gênica e protéica do GPER1 foram a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real a partir de Transcrição Reversa (RT-qPCR) e o Western Blot, respectivamente. A fim de realizar uma acurada comparação dos níveis de mRNA em amostras de tecido de tireoide normal e bócio, realizou-se a escolha de um gene de referência para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. Dentre os seis genes avaliados, a beta-actina foi o mais estável, calculado pelo programa NormFinder, sendo adequada sua utilização como gene de referência, a fim de minimizar o efeito das variações experimentais inerentes ao método. Na análise da expressão gênica, o mRNA do GPER1 estava presente em todas as amostras avaliadas (normal=16 e bócio=19), com um nível de expressão maior em tecido normal de tireoide, quando comparado ao bócio (p=0,01). Na análise da expressão protéica, em todas as amostras de tecido normal avaliadas (n=15), verificou-se a presença da proteína do GPER1 (banda com peso molecular ~38 KDa). Porém, em 28% das amostras de bócio (n=13), não foi identificada a expressão protéica desse receptor. Além disso, os níveis de proteína do GPER1 foram significativamente menores no bócio, quando comparados aos do tecido normal de tireoide (p=0,002). Esses dados sugerem que o GPER1 está presente em células normais na tireoide, e que, o desenvolvimento do bócio pode desencadear, ou ser consequência, da perda de expressão desse receptor. / Goiter is an enlarged thyroid not related to autoimmune, infiltrative or neoplastic diseases. Iodine deficiency is its most common cause. But, even in areas with sufficient iodine, the goiter occurs by unknown mechanisms, and it is more frequent in women. The presence of classical estrogen receptors (ERα and ERβ) in thyroid tissue has been described, indicating a direct effect on the gland. However, in goiter, the presence of the G-protein coupled estrogen receptor (GPER1) has not been described. The aims of this study were to evaluate GPER1 gene and protein expressions in normal human thyroid tissue and goiter, and to estimate the prevalence of gene expression or protein GPER1 in these tissues. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) and Western blot were used to evaluate GPER1 gene and protein expressions, respectively. In order to perform an accurate comparison of mRNA levels in tissue samples from normal thyroid and goiter a reference gene was validated to normalize RT-qPCR. Among the six genes analyzed, beta-actin was the most stable, as calculated by the NormFinder program. In gene expression analysis, GPER1 mRNA was present in all samples (normal=16 and goiter=19), with a higher expression level in normal thyroid than in goiter (p= 0.01). In all normal samples tested (n=15) the presence of GPER1 protein (band with molecular weight ~ 38 kDa) was identified by Western blot. However, it was not found in 28% of goiter samples (n=13). Furthermore, GPER1 protein levels were significantly lower in goiter than in normal thyroid (p=0.002). These data suggest that GPER1 is present in normal thyroid cells, and goiter development could trigger or be a consequence of the loss of this receptor expression.

Mixed Linkage Glucan (MLG, or (1,3;1,4)-ß-D glucan) is a component of cell walls for major cereal crops and is significant to food and beverage industries. To better understand genetic factors affecting MLG content in oats, this study investigates the presence of glucosidases likely to participate in MLG production. A glucosidase showing co-expression with CslF6—the primary gene responsible for MLG synthesis—could indicate a hand in MLG production by association. Reference genes for expression analysis as well as glucosidase candidates were first selected using in silico methods. In both cases, barley was used as model species because it has abundant public bioinformatic resources for in silico data mining, and it generates large amounts of MLG, like oats. Actin, malate dehydrogenase, and elongation factor 2, were validated in oat and barley as top reference genes. They were then used to compare the expression activity of the top glucosidase candidate gene, ßglux, with CslF6. ßglux was found to have increased activity with CslF6 during caryopsis development. It is a strong candidate for future transgenic experiments regarding its effect on MLG production.

Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) has one of the highest antioxidant capacities and flavonoid concentrations of any fruit or vegetable, and regular consumption of blueberries has been connected to a wide range of health benefits. A diversity of flavonoids (flavonols, anthocyanins, proanthocyanidins) are likely responsible for many of the health benefits, and these compounds also significantly contribute to the organoleptic properties of ripe blueberries. Despite the potential importance of these flavonoids in diet, there has been little investigation into the molecular genetics of blueberry flavonoid biosynthesis. Therefore, I developed a real-time quantitative PCR protocol to monitor expression of flavonoid genes throughout development and ripening. Following evaluation of five reference genes, expression profiling of biosynthetic genes revealed that flavonoid synthesis is tightly controlled at the transcriptional level in a biphasic developmental pattern. These results are discussed in relation to flavonoid metabolite accumulation profiles, which were produced as part of a collaboration. Finally, in conjunction with a second group of collaborating scientists, some promising preliminary evidence is provided suggesting that the hormone abscisic acid might have a role in regulating ripening initiation in blueberry. / Graduate

BACKGROUND: In order to better understand the multifactorial nature of osteoporosis, animal models are utilized and compared to healthy controls. Female sheep are well established as a model for osteoporosis induced by ovariectomy, calcium and vitamin D low diet, application of steroids, or a combination of these treatments. Transcriptional studies can be performed by applying quantitative real time PCR (RT-qPCR). RT-qPCR estimates mRNA-levels of target genes in relation to reference genes. A chosen set of reference genes should not show variation under experimental conditions. Currently, no standard reference genes are accepted for all tissue types and experimental conditions. Studies examining reference genes for sheep are rare and only one study described stable reference in mandibular bone. However, this type of bone differs from trabecular bone where most osteoporotic fractures occur. The present study aimed at identifying a set of reference genes for relative quantification of transcriptional activity of ovine spine bone and ovine in vitro differentiated mesenchymal stromal cells (MSC) for reliable comparability. METHODS: Twelve candidate reference genes belonging to different functional classes were selected and their expression was measured from cultured ovMSCs (n = 18) and ovine bone samples (n = 16), respectively. RefFinder was used to rank the candidate genes. RESULTS: We identified B2M, GAPDH, RPL19 and YWHAZ as the best combination of reference genes for normalization of RT-qPCR results for transcriptional analyses of these ovine samples. CONCLUSION: This study demonstrates the importance of applying a set of reference genes for RT-qPCR analysis in sheep. Based on our data we recommend using four identified reference genes for relative quantification of gene expression studies in ovine bone or for in vitro experiments with osteogenically differentiated ovine MSCs.

Os mecanismos etiopatogênicos que levam ao desenvolvimento dos nódulos e tumores da tireoide ainda não são bem conhecidos. É fato estabelecido que a prevalência dessas lesões é maior nas mulheres. Dessa forma, o que nos motivou a realizar esta Tese foi avaliar se os hormônios sexuais femininos tem efeito direto sobre as células de tireoide humanas normais podendo contribuir para a sua etiopatogenia. Este estudo teve como objetivos padronizar um modelo de cultura primária de células foliculares de tireoide humana normal e nesse modelo validar um gene normalizador após tratamento com estradiol e progesterona, avaliar os efeitos da progesterona na expressão dos genes NIS, TG e TPO bem como avaliar a expressão gênica e proteíca e a possível localização intracelular do receptor de membrana GPR30 nestas células. Em nosso modelo de cultura primária em monocamada, as células foliculares mantiveram sua morfologia cubóide característica e permaneceram diferenciadas o que foi evidenciado pela dosagem de tireoglobulina e T4 livre, no sobrenadante do meio de cultura, e pela identificação das proteínas TG e TPO por imunocitoquímica. A estimulação com progesterona aumentou a expressão dos genes NIS, TG e TPO, respectivamente, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) e 1.64 (p=0.018) vezes, quando comparadas ao grupo tratado somente com TSH. Essa estimulação da progesterona foi inibida por mifepristona sugerindo que a progesterona tem efeito direto nas células foliculares da tireoide e que esse efeito é mediado por seu receptor nuclear. A normalização da expressão gênica foi realizada pelo gene β-actina, o qual demonstrou uma maior estabilidade entre os grupos analisados. Demonstramos também que as células normais da tireoide expressam tanto o gene como a proteína do receptor de membrana GPR30 com possível localização na membrana celular e no espaço perinuclear. / The mechanisms leading to the development of thyroid nodules and tumors are not well established. As these lesions are more common in women, female sex hormones could be involved in the pathogenesis of these disorders. The objectives of this study were to establish a model of primary culture of normal human thyroid follicular cells, to validate a normalizing gene for qRT-PCR after treatment with estradiol and progesterone, to evaluate the effects of progesterone on the expression of genes NIS, TG and TPO, and to evaluate the GPR30 gene and protein expression as well as its possible intracellular location, in these cells. In our model of primary monolayer culture, follicular cells maintained their characteristic cuboid differentiated morphology; and had evidence of differentiated thyroid function: the production of thyroglobulin and free T4, and identification of TG and TPO proteins by immunocytochemistry . Adding progesterone to TSH increased NIS, TG and TPO mRNA, respectively, 1.78 (p=0.003), 1.50 (p=0.034) and 1.64 (p=0.018) folds, compared to the group treated with only TSH. This stimulation was inhibited by mifepristone, suggesting that progesterone has a direct effect on the thyroid follicular cells. Normalization of gene expression was performed using β-actin as reference gene. We have also demonstrated that normal thyroid cells expressed GPR30 gene and protein, which is possibly localized in the plasma membrane and the perinuclear region.