Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-10-23T17:03:01Z No. of bitstreams: 1 Lorena Magalhães. Resposta imunologica em camundongos...pdf: 2348914 bytes, checksum: 57fdb9c90a6454dd882c58e05aa0ba95 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-23T17:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena Magalhães. Resposta imunologica em camundongos...pdf: 2348914 bytes, checksum: 57fdb9c90a6454dd882c58e05aa0ba95 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Um fator determinante e importante que contribui para a gravidade da doença de Chagas é a ocorrência de múltiplas infecções pelo Trypanosoma cruzi nos indivíduos residentes em áreas endêmicas. Estudos experimentais comprovam o aumento da morbidade pelas reinfecções sucessivas com diferentes cepas e permitem caracterizar as cepas re-inoculadas e avaliar a influência das múltiplas infecções nas lesões tissulares. A presença de múltiplas infecções poderia também influenciar no grau de agravamento e reativação da doença de Chagas em pacientes portadores de HIV e/ou imunossuprimidos, em casos de transplantes, nos quais pode haver uma reativação de cepas virulentas levando a complicações nos indivíduos infectados. O presente estudo tem como objetivo avaliar a resposta imunopatológica em camundongos triplamente infectados com diferentes cepas do T. cruzi tratados com diferentes drogas imunossupressoras. Camundongos isogênicos da linhagem Balb/c foram infectados sucessivamente com cepas do T. cruzi de diferentes biodemas: 1- cepa Colombiana (Biodema Tipo III – T. cruzi I); 2- Cepa 21SF (Biodema Tipo II – T. cruzi II) 50 dias após; 3); 3- Cepa Y (Biodema Tipo I, Z2b) 20 dias depois; para cada cepa houve também um grupo experimental de infecção única, como controle. Após 20 dias da última infecção, os camundongos sobreviventes foram submetidos a dois esquemas de tratamento: Esquema 1: Betametasona (2mg/kg/dia) e Ciclofosfamida (250 mg/kg/dia) durante 4 semanas; Esquema 2: Azatioprina (2mg/kg), Betametasona (1mg/kg) e Ciclosporina (16mg/kg, 10mg/kg, 8mg/kg, 6mg/kg) durante 4 semanas. Como parâmetros foram analisados: parasitemia, mortalidade, estudo histopatológico; exame sorológico, dosagem de isótipos de imunoglobulinas (método de ELISA) e teste cutâneo (hipersensibilidade tardia). No presente estudo foi observada uma reativação da parasitemia e da mortalidade em camundongos com triplíce infecção e tratados com Betametasona e Ciclofosfamida. Concomitantemente, com a reagudização da infecção pelo T. cruzi neste grupo, observou-se uma intensificação do parasitismo tissular, um aumento do processo inflamatório mononuclear, espessamento da matriz extracelular e macrofagotropismo com o aparecimento de ninhos parasitários com formas amastigotas do T. cruzi no fígado e no baço. O tratamento combinado com Azatioprina, Ciclosporina e Betametasona em camundongos triplamente infectados, por cepas do T. cruzi de diferentes biodemas, não determinou um aumento significativo da parasitemia e da mortalidade. Entretanto, o estudo histopatológico destes animais mostrou um aumento da infiltração mononuclear perivascular no miocárdio e músculo esquelético, áreas focais de destruição tissular e presença de arterite e arteriolite. Os resultados do exame sorológico anti-T. cruzi demonstraram que o tratamento com imunossupressores (Betametasona e Ciclofosfamida; Azatioprina, Betametasona e Ciclosporina) em camundongos triplamente infectados determinou uma redução da titulação de anticorpos anti-T. cruzi nos dois grupos de tratamento, quando comparados ao grupo de animais triplamente infectados e não tratados. Os resultados demonstraram que camundongos triplamente infectados e tratados com Betametasona e Ciclofosfamida, apresentaram uma diminuição nos níveis de IgG1, IgG2a, IgM e IgG2b estatisticamente significante, quando comparados ao grupo infectado sem tratamento. Nos camundongos triplamente infectados e tratados com Azatioprina, Betametasona e Ciclosporina foi observado um aumento nos níveis de IgG2a e uma diminuição nos níveis de IgG2b quando comparados aos níveis deste isótipo nos outros grupos. O resultado do teste de hipersensibilidade tardia através o teste cutâneo com medição da espessura da pata apresentou diferença significante no ponto de 48h nos grupos de camundongos triplamente infectados não tratados, camundongos tratados com Betametasona e Ciclofosfamida e no grupo de camundongos tratados com Azatioprina, Betametasona e Ciclosporina. No presente estudo, a imunossupressão com Betametasona e Ciclofosfamida determinou uma reativação da fase aguda em camundongos, comparável ao visto em pacientes imunossuprimidos. Concomitantemente houve uma diminuição significante das imunoglobulinas do soro, indicando a importância da resposta humoral no controle da infecção. O tratamento com Azatioprina, Betametasona e Ciclosporina em camundongos cronicamente infectados pelo T. cruzi pode influenciar no agravamento das lesões imunopatológicas características de uma reação de hipersensibilidade tardia, principalmente no miocárdio, embora sem determinar a reagudização da infecção pelo T. cruzi. / An important factor that contributes to the severity of Chagas disease in people living in endemic areas is the occurrence of multiple infections with Trypanosoma cruzi. Experimental studies have shown the increased morbidity due to successive reinfections with different strains, with the possibility of to identify and characterize the re-inoculated strains and to evaluate the influence of multiple infections upon the tissue lesions. The occurrence of multiple infections could also influence reagudisation of the disease in patients with HIV infection (AIDs) or immunosuppressed in cases of organs transplantation. In such cases, a reactivation of virulent strains could occur with aggravation of the disease. The objective of the present study was to evaluate the immunopathological response in mice with triple infections with different T. cruzi strains and treated with different immunosuppressor drugs. Inbred Balb/c mice were successively infected with T. cruzi strains of different Biodemes : 1) the Colombian strain (Biodeme Type III – T. cruzi I); 2) 50 days after, the mice were re-infected with the 21SF strain (Biodeme Type II – T. cruzi II); 3) after 20 days the third infection was performed with Y strain (Biodeme Type I, Z2b). For each separate T. cruzi strain a group of mice with only a single infection was included as a control group. Twenty days after the last infection, surviving mice were divided into two different groups, submitted to different schedules of treatment with immunosuppressor drugs: Schedule 1 – Betamethasone (2mg/kg/day) plus Cyclophosphamide (250mg/kg/day), during four weeks ; Schedule 2 – Azathioprine (2mg/kg/day) plus Betamethasone (1mg/kg/day ) and Cyclosporine ( first week - initial dose of 16mg/kg/day, during one week, followed by dosis of 10mg/kg/day, 8mg/kg/day and 6mg/kg/day for the following 3 weeks). The mice from the several groups were evaluated by following the evolution of parasitemia and mortality, histopathology and serological specific responses. Evaluation of immunoglobulin isotypes (ELISA method) and skin test for delayed hypersensitivity (DTH) were performed. In the present study a reactivation of T. cruzi infection in mice with triple infection and treated with Betamethasone and Cyclophosphamide was detected; it was characterized by increased parasitemia levels, mortality rates and tissue parasitism. Presence of amastigotes in macrophages of the liver and spleen (macrophagotropism); intensification of the inflammatory infiltration and of extracellular matrix deposits. Combined treatment with Azathioprine, Betamethasone , Cyclosporine and in the triple infected mice did not influence neither parasitemia levels or mortality rates. However the histopathological study demonstrated aggravation of the necrotic inflammatory lesion with the presence of arterites and peri-arterites in the myocardium and skeletal muscles. A decrease of anti-T. cruzi serological titres was observed in triple infected mice treated with immunossupressor drugs in both schedules of treatment employed in the present study, as compared to the untreated control group. A significant decrease in the levels of IGg1, IGg2a, IGg2b and IgM was observed in the group of mice with triple infection, treated with Betamethasone and Cyclophosphamide (Schedule 1) as compared with the untreated controls. In the group with triple infection, treated with Azathioprine, Betamethasone and Cyclosporine (Schedule 2), increased levels of IgG2a and decreased levels of IgG2b were observed. The DTH cutaneous test, disclosed significant differences in the 48 hours point between untreated triple infected mice and the treated with either one of the treatment schedules. In the present study the immunosuppression with Betamethasone plus Cyclophosphamide, determined reactivation of the acute phase of the infection with T. cruzi, comparable to that observed in immunosuppressed patients, concomitantly with significant decrease of the immunoglobulins. This suggests an effective influence of the humoral response on the control of the infection. Treatment with Azathioprine, Betamethasone and Cyclosporine determined aggravation of the immunopathological lesions, characteristics of DTH alterations, without re-agudization of T. cruzi infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-16T19:49:06Z No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T19:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monica Cardozo Rebouças. Resposta a quimioterapia...2012.pdf: 2111449 bytes, checksum: c4c3f7eeb987c9afdfca54d06568dd45 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Populações que residem em áreas endêmicas da doença de Chagas são submetidas a múltiplas infecções pelo Trypanosoma cruzi e podem estar infectadas com cepas ou clones com diferentes graus de virulência e susceptibilidade à quimioterapia. Este é um fator importante para o desenvolvimento e morbidade da doença. As cepas de Trypanosoma cruzi representam complexas populações multiclonais, homogêneas ou heterogêneas, com predominância de um clone principal. São biologicamente classificados em Biodemas (Tipos I, II e III) que apresentam diferentes graus de resistência à quimioterapia. Cepas do Tipo I são muito suscetíveis ao tratamento; cepas do Tipo II possuem uma média susceptibilidade (cepa 21SF); cepas de Tipo III são muito resistentes (cepa Colombiana). No presente estudo, é avaliado o resultado do tratamento de camundongos triplamente infectados com clones da cepa 21SF, em comparação com os infectados com a cepa parental. 50 camundongos foram infectados com a cepa 21SF (infecção única). O inóculo foi de 5 x 104 formas tripomastigotas sanguícolas. 80 camundongos foram infectados, sucessivamente, com 3 clones da cepa 21SF (C6, C7 e C8), inóculo: 1x104 formas tripomastigotas (infecção tripla). A infecção simples com cada clone também foi feita. Os camundongos de ambos os grupos foram divididos em dois subgrupos: tratados com Benzonidazol – BZ (100 mg/kg/dia - 60 doses) e controles não tratados. Após 60 dias do final do tratamento, os camundongos sobreviventes foram eutanasiados, por exsanguinação, pós-anestesia; o sangue foi coletado para o exame sorológico de imunofluorescência indireta; testes de cura foram realizados (parasitemia, xenodiagnósticos, hemocultura) e seções do coração e músculo esquelético foram coletadas, fixadas e processadas para o estudo histopatológico em cortes corados com Hematoxilina & Eosina. A PCR foi também usada como uma técnica diagnóstica complementar. Os testes parasitológicos mostraram uma positividade variando de 54,4% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 33,4 a 66,7% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 26,7% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Os títulos sorológicos (TIFI) variaram de 1:20 a 1:280 nos infectados com cepa parental tratados com BZ e de 1:640 a 1:1280 para controles não tratados. Os títulos sorológicos na infecção única com cada clone variaram de 1:10 a 1:1280 em camundongos tratados e de 1:160 a 1:1280 nos controles não tratados. A PCR revelou positividade em todos os animais infectados, tratados. O resultado final foi obtido pela combinação dos testes parasitológicos com os títulos sorológicos revelando positividade de 6,6% nos camundongos infectados com a cepa parental e tratados; 0 a 18,2% nos animais com infecção única pelos diversos clones e tratados e 12% nos camundongos com infecção tríplice, tratados. Estudo histopatológico: Os camundongos infectados com a cepa parental apresentaram lesões que variavam de leves a moderadas, na maioria dos casos, predominante no miocárdio (animais tratados e controles não tratados) camundongos submetidos à infecção única por cada clone apresentaram lesões semelhantes aos demonstrados pela infecção com cepa parental. Os camundongos com infecção tripla apresentaram uma exacerbação de lesões, evoluindo para a miocardite crônica. Nestes casos, havia intensas lesões no músculo esquelético; animais tratados apresentaram uma nítida redução das lesões no miocárdio e no músculo esquelético. Os resultados da quimioterapia com Benzonidazol em animais triplamente infectados, considerando os testes parasitológicos e sorológicos, revelaram baixos índices de cura e agravamento das lesões tissulares nos camundongos submetidos a múltiplas infecções com clones obtidos da cepa 21SF. / People living in endemic areas of Chagas disease are submitted to multiple infections during their lives and could be infected with strains or clones with different virulence and susceptibility to chemotherapy. This is an important factor in the development and morbidity of the disease. Strains of Trypanosoma cruzi represent complex multiclonal populations, which can be homogeneous or heterogenous with predominance of a principal clone. The strains are biologically classified in different Biodemes (Types I, II and III) which disclose different degrees of resistance to chemotherapy. Type I strains are very susceptible to treatment; Type II strains disclose medium susceptibility (21SF strain); strains of Type III are very resistant (Colombian strain). The clones isolated from different strains can also present different degrees of resistance. In the present study the results of treatment of mice triple infected with clones of the 21SF strain is evaluated, in comparison with the infected with the parental strain. For the present study, 50 Swiss mice were infected with the 21SF strain (single infection).The inoculum was of 5 x 104 blood trypomastigotes. 80 mice were infected successively with 3 clones of the 21SF strain (C6, C7 and C8) inoculum: 1x104 trypomastigotes (triple infection). Single infection with each Clone was also done. The mice of both groups were divided into 2 sub-groups: treated with Benzonidazol –BZ (100mg/kg/day – 60 doses) and untreated controls. After 60 days of the end of treatment, surviving mice were killed by exsanguinations after anesthesia; the blood was collected for indirect immunofluorescence serological test; cure tests were performed (parasitemia, xenodiagnosis, haemoculture) and sections of the heart and skeletal muscle were collected, fixed and then processed for the histopathological study in sections stained with Hematoxilin end Eosin. PCR reaction was also performed in blood samples as a complementary diagnostic technique. Parasitological tests have shown positive results that varied from 54.4% for the group of mice infected with the parental strain and treated with BZ; 33.4 to 66.7% for the mice with single infection, with each clone, treated with BZ, and 26.7% with triple infection with the three clones, treated with BZ. Serology titers (IIFT) varied from 1:20 a 1:280 for the mice infected with parental strain treated with BZ and from 1:640 to 1:1280 for untreated controls. Serology titers in the single infection with each clone varied from 1:10 to 1:1280 in treated mice and from 1:160 to 1:1280 in the untreated controls. PCR reaction was positive in all the infected mice, treated. Parasitological tests combined with the sorological titers have shown a positivity of 6.6% for the mice infected with the parental strain and treated with BZ; 0 to 18.2% for the mice with single infection with each clone and treated an 12% for the mice with triple infection and treated with BZ. Histopathological examination revealed in mice infected with the parental strain, mild to moderate inflammatory lesions. Mice submitted to single infection with clones of the 21SF strain presented similar lesions to those determined by infection with parental strain. Mice with triple infection present an intensification of lesions, and evolution to a chronic myocarditis and intense lesions in skeletal muscle; Treated animals presented clear reduction of lesions in myocardium and in skeletal muscle. Results of chemotherapy with BZ in mice with triple infection with clones of the 21 SF T. cruzi strain, considering the results of parasitological and serological tests, revealed low cure rates and aggravation of tissue lesions in those animals submitted to triple infections with clones of the parental strain.