O ciclo circadiano é um sistema adaptativo e vantajoso que permite a antecipação dos organismos e sincronização de suas atividades fisiológicas frente às variações ambientais que ocorrem ao longo do dia. Seu funcionamento molecular acontece pela geração dos ritmos circadianos, os quais surgem a partir da expressão cíclica dos genes do relógio em um feedback autoregulatório. Em insetos, os ritmos circadianos apresentam função importante em coordenar o timing do desenvolvimento e o comportamento. Nos últimos anos, estudos desvendaram que o relógio molecular de insetos sociais apresenta um funcionamento mais similar ao relógio de mamíferos do que com outros insetos como Drosophila melanogaster. Em especial, abelhas sociais têm sido ótimos modelos para investigar como os ritmos circadianos são modulados de acordo com as interações sociais entre os indivíduos, a plasticidade comportamental e a divisão social do trabalho entre as operárias. Operárias jovens (nutrizes) cuidam da cria no interior da colônia e geralmente apresentam uma atividade arrítimica ao longo de 24 horas, enquanto as abelhas mais velhas (forrageiras) são rítmicas e desenvolvem atividades complexas no ambiente externo. Nesse trabalho, nós caracterizamos os perfis de expressão dos genes do relógio period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) durante todo o desenvolvimento de abelhas operárias de Apis mellifera. Verificamos que os genes do relógio são expressos antes mesmo da formação do sistema nervoso central no embrião e que seus transcritos podem ser herdados maternalmente. No desenvolvimento de larvas e pupas, revelamos que estes genes são diferencialmente expressos entre as fases investigadas e, com exceção dos genes cwo e tim2, todos respondem ao tratamento com o Hormônio Juvenil (HJ) na fase de pupa de olho branco. A resposta positiva dos genes clk, cyc e pdp1 frente ao tratamento hormonal pode estar relacionada com o envolvimento destes nas vias que respondem à sinalização do HJ, interagindo com os genes Kruppel (Kr-h1) e Methoprene-tolerant (MET). No desenvolvimento adulto, vimos que os genes per e cry-m são potenciais marcadores da plasticidade comportamental e divisão social do trabalho. Em um experimento usando single-cohort colony, estes genes apresentam níveis transcricionais que não oscilam em cabeças de operárias jovens (3 e 7 dias) ao longo de 24 horas, comparado aos níveis de expressão que oscilam de forma robusta em abelhas mais velhas (15 e 25 dias). Ainda, reconstruímos redes de interação proteína-proteína e miRNA-mRNA onde foram identificadas potenciais moléculas que atuam modulando os genes do relógio em nível póstranscricional e traducional. Dentre elas, validamos as interações entre os miRNA-34 e seus sítios de ligação que estão presentes nas 3`UTRS dos genes cyc e cwo, através do ensaio por luciferase, revelando que este miRNA é um regulador negativo da expressão desses genes. Pela primeira vez, realizamos uma análise ampla dos genes do relógio em um inseto social, além de identificar novas moléculas que podem atuar modulando os ritmos circadianos. Nosso trabalho demonstra a importâcia das abelhas sociais como modelos ideais para desvendar os mecanismos moleculares que regem os ritmos circadianos não só em abelhas, como também em outros organismos, inclusive mamíferos. / The circadian clock is an advantageous adaptive system that enables organisms to anticipate and syncronize their biological activities during the daily environmental changes. The circadian clock acts through the ontogeny of circadian rhythms, which are generated by the cyclic expression of the clock genes in an autregulatory feedback loop. In insects, the circadian rhythms have important roles in the coordination of the developmental timing and behavior, interacting with the endocrine system. In the last years, researchers revealed that the molecular clock of social insects is more similar to mammals than to insects. In particular, the social honeybee is an excellent model to investigate how the circadian rhythms are modulated accordingly to the social context, behavioral plasticity, and taskrelated activities. While young bees (nurses) work arrhythmically around the clock inside the colony in brood-care activities, old bees (foragers) need to be strongly rhythmic to develop complex tasks. In this work, we characterized the expression patterns of the clock genes period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) in the entire development of Apis mellifera. Our results revealed that the clock genes are expressed before the formation of the central nervous system in embryos and that their transcripts might be inherited maternally. The clock genes are diferentially modulated during the larval and pupal development and, except for tim2 and cwo, all of them respond to the treatment with Juvenile Hormone (JH) in white-eyed pupae. The positive response to JH by clk, cyc and pdp1 might be related to the involvement of these genes on the pathways of the JH signaling, interacting with Kruppel (Kr-h1) and Methoprene-tolerant (MET) genes. In the adult development, the clock genes per and cry-m are potential molecular markers of the behavioral plasticity and division of labor in a single-cohort colony, once they did not exhibit transcriptional oscillations in heads of young bees (3 and 7 days-old) during 24h, compared to the robust transcriptional oscillation in old bees (15 and 25 days-old). Additionally, we reconstructed protein-protein and miRNA-mRNA interaction networks and identified putative molecules involved in the post-transcriptional and translational regulation of the clock genes. Among those molecules, we validated interactions between the miR-34 and its binding sites in the 3`UTR of cyc and cwo by luciferase assay, showing that this miRNA is a negative regulator of both clock genes. We showed for the first time a broad analysis of the circadian clock elements in a social insect, and also identified news molecules with potential to act as modulators of the circadian rhythms. This work expands the knowledge about the biological roles of the circadian clock in honeybees. Our work also contributes to highlight the importance of honeybees as an ideal model to uncover the molecular mechanisms that govern the circadian rhythms, not only in bees, but in other organisms, including mammals.

Em 1967, a definição do segundo passou a ser baseada nas propriedades atômicas dos átomos de 133Cs. O instrumento utilizado para reproduzir esta definição é um relógio atômico. Neste trabalho iremos apresentar os progressos feitos no programa brasileiro de metrologia científica de tempo e freqüência. A proposta deste trabalho de dissertação é a caracterização do nosso padrão. Nós estudaremos os deslocamentos presentes em um relógio atômico, como o efeito Zeeman Quadrático, Δ ν/ ν0 =5,4×10-13 o ?Cavity Pulling?, Δ ν/ ν0 = 1,27×10-13 e o ?Rabi Pulling?, Δν/ν0 =1,3×10?13 entre outros, que são induzidas na freqüência hiperfina do césio. Os resultados obtidos neste trabalho podem ser resumidos da seguinte forma: uma incerteza global de 1,44×10-12 e uma estabilidade a curto prazo dada pela raíz quadrada da variância de Allan 1,8×10-10Τ-0,5. Estes resultados foram medidos após as seguintes mudanças efetuadas em nosso padrão: determinamos a potência ótima injetada na cavidade afim de aumentar o sinal e assegurar que os átomos sofram uma transição π/2; melhoramos o controle do campo magnético estático aplicado ao longo da cavidade de interrogação resultando em um campo magnético mais homogêneo; e, diminuímos a temperatura de operação do forno do relógio tal que a velocidade média dos átomos presente no feixo atômico diminui significativamente. Todas estas mudanças resultaram no ganho de uma ordem de grandeza na acuracia e na estabilidade de nosso relógio. / Since 1967, the definition of the second is based on the atomic properties of the 133Cs atom. The device that realises this definition is an atomic clock. In this work, we present the progress made in the last year on Brazilian scientific time and frequency program. The aim of this dissertation work is the caracterization of our standard. We report the major sifts present in our atomic clock due to Quadratic Zeeman effect, Δν/ν0 =5,4×10-13 Cavity Pulling, Δν/ν0 =1,27×10-13 Rabi Pulling, Δν/ν0 =1,3×10-13 and other ones, which induced a shift in the hiperfine levels frequency of the performances: a global uncertainty of 1,44×10-12 and a short term stability of 1,8×10-10Τ-0,5 .The results were obtained after these changes: we have determined the optimum microwave power injected into the cavity in order to increase the signal and assure that the atoms suffer a π/2 pulse; we have also minimizes the field inhomogeneity by improving the control of the static magntic field along the interaction region; we have decreased the temperature of the clock oven in order to obtain a slower atomic beam. All this changes has increased our accuracy and our stability of about one order.

Apresentamos os aspectos mais relevantes para a construção e caracterização de um padrão primário de tempo e frequência compacto. Nesse sistema a amostra de átomos de referência é preparada a partir de uma armadilha magneto-óptica. Após a obtenção de uma amostra significativa de átomos os feixes laser são desligados e, durante a expansão livre, a nuvem atômica é submetida a uma sequência de pulsos de micro-ondas que caracterizam o método de Ramsey. Os pulsos de micro-ondas são aplicados em uma cavidade de micro-ondas, esculpida dentro da câmara de vácuo. Todo o ciclo de funcionamento é implementado dentro dessa cavidade e por esse motivo o padrão é considerado compacto. Quando os átomos são interrogados com pulsos de τ = 1 ms separados por Τ = 8 ms obtemos uma largura a meia altura da franja central de 52 Hz e uma estabilidade a curto prazo de 10-13. Alguns causadores de deslocamentos de frequência foram avaliados. / We present some relevant aspects for the construction and characterization of a compact primary frequency standard. In this system, the atomic ensemble is prepared with a magnetooptical trap. Once a significant number of cold atoms is obtained, the laser beams are turned off and, during the free expansion, the cloud is submitted to a sequence of two microwave pulses, characterizing the well-known Ramsey method. The microwave pulses are applied in a microwave cavity that was sculpted inside the vacuum chamber. All the working cycle takes place into this cavity. When the atoms are interrogated by two pulses of τ = 1 ms separated by Τ = 8 ms, the linewidth of the central fringe is 52 Hz and a short-term stability 10-13 is observed. Some frequency shifts were evaluated.

Esta dissertação descreve os recentes desenvolvimentos do Chafariz Atômico localizado no Instituto de Física de São Carlos. Ele consiste de um aparato experimental que provê uma referência de freqüência (e tempo) de altíssima precisão. Para conseguir tal qualidade metrológica, esse sistema trava a freqüência de um oscilador eletrônico, baseado em um cristal de quartzo, na freqüência relativa a uma transição atômica, de uma amostra de átomos resfriados. O átomo utilizado é o 133Cs e a transição utilizada corresponde aos dois níveis hiperfínos do seu estado fundamental. O ciclo de funcionamento é composto por uma etapa de aprisionamento a laser dos átomos e bombeamento óptico, para que todos os átomos se encontrem num mesmo e determinado nível de energia. Esses átomos são então lançados opticamente contra a gravidade através de uma cavidade de microondas. Em trajetória balística e livre de interferências externas, o conjunto de átomos sofre uma possível mudança de estado, dependendo das características de potência e freqüência do sinal de microondas injetado na cavidade. Esta probabilidade de transição é o sinal de erro utilizado para travar em malha fechada o gerador de microondas que alimenta a cavidade. Os melhores resultados obtidos neste experimento foram uma estabilidade de 5x10-12τ-1/2 resultante de um sinal com 3Hz de largura a meia altura (FWHM) da franja central. Fizemos também uma avaliação preliminar dos principais deslocamentos de freqüência e uma análise de interação espacial dos átomos com o campo de microondas. / This paper describes the recent developments of the Atomic Fountain located at the São Carlos Physics Institute. It provides a very high resolution frequency (and time) reference. This is achieved locking an electronic oscillator, based on a quartz crystal, to an atomic resonance of a cold atomic sample. Our laboratory uses the 133Cs atom, using as the referenced transition that corresponds to the two hyperfine energy levels of the ground state. The operating cycle comprises a stage of laser trapping atoms or optical pumping, so that all atoms are within the same atomic state. These atoms are then launched optically against gravity through a microwave cavity. In ballistic trajectory and free from external interference, the set of atoms undergoes a change of state, depending on the power and frequency of the microwave signal injected into the cavity. This transition probability is the error signal used to lock the microwave generator supplying the cavity in a closed loop. The best result obtained in this experiment was a stability of 5x10-12τ-1/2 resulting from signal with a 3 Hz half width (FWHM) of the central fringe. We also provide a preliminary assessment of the main frequency shifts and an analysis of spatial interaction of atoms with the microwave field.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:36Z : No. of bitstreams: 1 Publico-035.pdf: 841601 bytes, checksum: 09b2f23ec93052490c588d4826e2d818 (MD5) / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os genes PER3 e CLOCK são importantes componentes do sistema molecular circadiano dos mamíferos. Vários estudos têm demonstrado existir uma associação entre polimorfismos nestes genes relógio e fenótipos circadianos nas diferentes populações. No entanto, as diferenças no padrão da freqüência alélica e a distribuição genotípica, são sistematicamente observadas nos estudos com diferentes grupos étnicos. Para investigar e comparar o padrão de distribuição em uma amostra de populações asiáticas e caucasianas que vivem no Brasil, utilizando a técnica de PCR, avaliou-se dois polimorfismos bem estudados nos genes relógio: o (VNTR) no gene PER3, um polimorfismo de número variável de repetições em tandem; e um polimorfismo com troca de um único nucleotídeo (SNP ) no gene CLOCK. O objetivo deste estudo foi, nos humanos, procurar pistas sobre os processos evolutivos relacionados aos ritmos circadianos, tendo sido selecionados 109 descendentes de asiáticos e 135 de caucasianos. As freqüências do alelo curto (4 repetições) no gene PER3 e do alelo T no gene CLOCK (respectivamente 0,86 e 0,84) entre os asiáticos foram significativamente maiores do que entre os caucasianos (respectivamente 0,69 e 0,71). Os resultados confirmaram diretamente a distribuição diferente destes polimorfismos entre os grupos étnicos caucasianos e asiáticos. Dadas as diferenças genéticas observadas entre os grupos, tornou-se evidente que, primeiro, as variações étnicas poderiam ter implicações para a interpretação dos resultados em estudos de associação do ritmo circadiano e, segundo, questiona quais foram as condições evolutivas que moldaram essas variações genéticas observadas nos genes relógio. / The Period 3 and Clock genes are important components of the mammalian molecular circadian system. Studies have shown association between polymorphisms in these clock genes and circadian phenotypes in different populations. Nevertheless, differences in the pattern of allele frequency and genotyping distribution are systematically observed in studies with different ethnic groups. To investigate and compare the pattern of distribution in a sample of Asian and Caucasian populations living in Brazil, we evaluated two well-studied polymorphisms in the clock genes: a variable number of tandem repeats (VNTR) in PER3 and a single nucleotide polymorphism (SNP) in CLOCK. The aim of this investigation was to search for clues about human evolutionary processes related to circadian rhythms. We selected 109 Asian and 135 Caucasian descendants. The frequencies of the shorter allele (4 repeats) in the PER3 gene and the T allele in the CLOCK gene among Asians (0.86 and 0.84, respectively) were significantly higher than among Caucasians (0.69 and 0.71, respectively). Our results directly confirmed the different distribution of these polymorphisms between the Asian and Caucasian ethnic groups. Given the genetic differences found between groups, two points became evident: first, ethnic variations may have implications for the interpretation of results in circadian rhythm association studies, and second, the question may be raised about which evolutionary conditions shaped these genetic clock variations. / FAPESP/CEPID: 98/14303-3 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Apresentamos os aspectos mais relevantes para a construção e caracterização de um padrão primário de tempo e frequência compacto. Nesse sistema a amostra de átomos de referência é preparada a partir de uma armadilha magneto-óptica. Após a obtenção de uma amostra significativa de átomos os feixes laser são desligados e, durante a expansão livre, a nuvem atômica é submetida a uma sequência de pulsos de micro-ondas que caracterizam o método de Ramsey. Os pulsos de micro-ondas são aplicados em uma cavidade de micro-ondas, esculpida dentro da câmara de vácuo. Todo o ciclo de funcionamento é implementado dentro dessa cavidade e por esse motivo o padrão é considerado compacto. Quando os átomos são interrogados com pulsos de τ = 1 ms separados por Τ = 8 ms obtemos uma largura a meia altura da franja central de 52 Hz e uma estabilidade a curto prazo de 10-13. Alguns causadores de deslocamentos de frequência foram avaliados. / We present some relevant aspects for the construction and characterization of a compact primary frequency standard. In this system, the atomic ensemble is prepared with a magnetooptical trap. Once a significant number of cold atoms is obtained, the laser beams are turned off and, during the free expansion, the cloud is submitted to a sequence of two microwave pulses, characterizing the well-known Ramsey method. The microwave pulses are applied in a microwave cavity that was sculpted inside the vacuum chamber. All the working cycle takes place into this cavity. When the atoms are interrogated by two pulses of τ = 1 ms separated by Τ = 8 ms, the linewidth of the central fringe is 52 Hz and a short-term stability 10-13 is observed. Some frequency shifts were evaluated.

Esta dissertação descreve os recentes desenvolvimentos do Chafariz Atômico localizado no Instituto de Física de São Carlos. Ele consiste de um aparato experimental que provê uma referência de freqüência (e tempo) de altíssima precisão. Para conseguir tal qualidade metrológica, esse sistema trava a freqüência de um oscilador eletrônico, baseado em um cristal de quartzo, na freqüência relativa a uma transição atômica, de uma amostra de átomos resfriados. O átomo utilizado é o 133Cs e a transição utilizada corresponde aos dois níveis hiperfínos do seu estado fundamental. O ciclo de funcionamento é composto por uma etapa de aprisionamento a laser dos átomos e bombeamento óptico, para que todos os átomos se encontrem num mesmo e determinado nível de energia. Esses átomos são então lançados opticamente contra a gravidade através de uma cavidade de microondas. Em trajetória balística e livre de interferências externas, o conjunto de átomos sofre uma possível mudança de estado, dependendo das características de potência e freqüência do sinal de microondas injetado na cavidade. Esta probabilidade de transição é o sinal de erro utilizado para travar em malha fechada o gerador de microondas que alimenta a cavidade. Os melhores resultados obtidos neste experimento foram uma estabilidade de 5x10-12τ-1/2 resultante de um sinal com 3Hz de largura a meia altura (FWHM) da franja central. Fizemos também uma avaliação preliminar dos principais deslocamentos de freqüência e uma análise de interação espacial dos átomos com o campo de microondas. / This paper describes the recent developments of the Atomic Fountain located at the São Carlos Physics Institute. It provides a very high resolution frequency (and time) reference. This is achieved locking an electronic oscillator, based on a quartz crystal, to an atomic resonance of a cold atomic sample. Our laboratory uses the 133Cs atom, using as the referenced transition that corresponds to the two hyperfine energy levels of the ground state. The operating cycle comprises a stage of laser trapping atoms or optical pumping, so that all atoms are within the same atomic state. These atoms are then launched optically against gravity through a microwave cavity. In ballistic trajectory and free from external interference, the set of atoms undergoes a change of state, depending on the power and frequency of the microwave signal injected into the cavity. This transition probability is the error signal used to lock the microwave generator supplying the cavity in a closed loop. The best result obtained in this experiment was a stability of 5x10-12τ-1/2 resulting from signal with a 3 Hz half width (FWHM) of the central fringe. We also provide a preliminary assessment of the main frequency shifts and an analysis of spatial interaction of atoms with the microwave field.

Em 1967, a definição do segundo passou a ser baseada nas propriedades atômicas dos átomos de 133Cs. O instrumento utilizado para reproduzir esta definição é um relógio atômico. Neste trabalho iremos apresentar os progressos feitos no programa brasileiro de metrologia científica de tempo e freqüência. A proposta deste trabalho de dissertação é a caracterização do nosso padrão. Nós estudaremos os deslocamentos presentes em um relógio atômico, como o efeito Zeeman Quadrático, Δ ν/ ν0 =5,4×10-13 o ?Cavity Pulling?, Δ ν/ ν0 = 1,27×10-13 e o ?Rabi Pulling?, Δν/ν0 =1,3×10?13 entre outros, que são induzidas na freqüência hiperfina do césio. Os resultados obtidos neste trabalho podem ser resumidos da seguinte forma: uma incerteza global de 1,44×10-12 e uma estabilidade a curto prazo dada pela raíz quadrada da variância de Allan 1,8×10-10Τ-0,5. Estes resultados foram medidos após as seguintes mudanças efetuadas em nosso padrão: determinamos a potência ótima injetada na cavidade afim de aumentar o sinal e assegurar que os átomos sofram uma transição π/2; melhoramos o controle do campo magnético estático aplicado ao longo da cavidade de interrogação resultando em um campo magnético mais homogêneo; e, diminuímos a temperatura de operação do forno do relógio tal que a velocidade média dos átomos presente no feixo atômico diminui significativamente. Todas estas mudanças resultaram no ganho de uma ordem de grandeza na acuracia e na estabilidade de nosso relógio. / Since 1967, the definition of the second is based on the atomic properties of the 133Cs atom. The device that realises this definition is an atomic clock. In this work, we present the progress made in the last year on Brazilian scientific time and frequency program. The aim of this dissertation work is the caracterization of our standard. We report the major sifts present in our atomic clock due to Quadratic Zeeman effect, Δν/ν0 =5,4×10-13 Cavity Pulling, Δν/ν0 =1,27×10-13 Rabi Pulling, Δν/ν0 =1,3×10-13 and other ones, which induced a shift in the hiperfine levels frequency of the performances: a global uncertainty of 1,44×10-12 and a short term stability of 1,8×10-10Τ-0,5 .The results were obtained after these changes: we have determined the optimum microwave power injected into the cavity in order to increase the signal and assure that the atoms suffer a π/2 pulse; we have also minimizes the field inhomogeneity by improving the control of the static magntic field along the interaction region; we have decreased the temperature of the clock oven in order to obtain a slower atomic beam. All this changes has increased our accuracy and our stability of about one order.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Melatonin is hormone regulated by the light/dark cycle. It is considered to be a signaling pathway of the circadian clock located in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus. Melatonin also regulates functions involving the energetic and behavioral metabolism of mammals. However, the melatonin synthesis can suffer influence from other hormones, like insulin and other glucocorticoids, in pathological conditions and stress. Studies have shown that glucocorticoids seem to modulate clock genes in peripheral tissues leading to metabolic diseases. The objective of the present study was to evaluate the functionality of the pineal gland and clock genes modulation in rats treated chronically with dexamethasone. Male Wistar rats (200-250g) were divided in to two groups: Control (CON) and Dexamethasone-treated (DEX). Animals from DEX group had 2mg/kg body weigh of dexamethasone administered intraperitoneally for 10 consecutive days and control animals received equal volume of saline solution also intraperitoneally. The circadian profile of blood glucose was evaluated and presented increased points of hyperglycemia during the night (p<0,05). The animals were sacrificed at each time point and had their pineal gland and plasma collected. The obtained data demonstrate a significant hyperinsulinemia in DEX animals (p<0,05). The findings show a reduction in the melationin content (p<0,05) associated with a decrease in the enzymatic activity of AANAT (p<0,05). Also, in these points, DEX animals presented a reduction in the glucose transporter (Glut1) in the pineal gland and insulin receptor (Insr) (p<0,05). The levels of mRNA of the clock genes Bmal1, Per1, Per2, Cry1, Cry2 and Rev-erbα in the isolated pineal glands demonstrated an increase in the gene expression (p<0,05). These results suggest that chronic treatment with dexamethasone is capable of modulating melatonin synthesis, as well as the clock genes. This evidence also suggests the possible presence of a responsive element to the functional glucocorticoid in the promoter region of these genes in the pineal gland. / A melatonina é um hormônio regulado pelo ciclo claro/escuro. Sendo considerado um sinal de saída do relógio circadiano localizado no núcleo supraquiasmático do hipotálamo. A melatonina regula funções envolvendo o metabolismo energético e comportamental em mamíferos. A síntese de melatonina pode ser influenciada por outros hormônios, a exemplo da insulina e dos glicocorticoides em condições patológicas e estresse. Estudos têm demonstrado que os glicocorticoides parecem modular os genes relógio em tecido periférico ocasionando doenças metabólicas. O presente estudo teve como objetivo avaliar a funcionalidade da glândula pineal e a modulação dos genes relógio em ratos tratados cronicamente com dexametasona. Ratos Wistar (200-250g) foram divididos em 2 grupos: Controle (CON) e Tratados com dexametasona (DEX). Os animais DEX receberam 2mg/kg de peso de dexametasona intraperitonial durante 10 dias consecutivos e os animais CON receberam o volume correspondente de solução salina intraperitonialmente. Os animais de ambos os grupos tiveram o perfil de glicose avaliado e apresentaram pontos de hiperglicemia acentuada durante a noite (p<0,05). Os animais de ambos os grupos foram sacrificados nos ZT17 ao ZT22 e tiveram a glândula pineal e o plasma coletados. Os dados obtidos mostram um quadro de hiperinsulinemia nos animais DEX (p<0,05). Os animais do grupo DEX apresentaram uma redução no conteúdo de melatonina total (p<0,05) associada à diminuição da atividade enzimática da AANAT (p<0,05). Nesses mesmos pontos os animais DEX apresentaram uma redução do transportador de glicose (Glut1) na glândula pineal e receptor de insulina (Insr) (p<0,05). Os níveis de RNAm dos genes do relógio Bmal1, Per1, Per2, Cry1, Cry2 e Rev-erbα em pineais isoladas apresentaram aumento da expressão gênica (p<0,05). Estes resultados sugerem que o tratamento crônico com dexametasona é capaz de modular a síntese de melatonina, bem com também os genes relógio, estas evidências sugerem a possível presença de um elemento responsivo ao glicocorticoide funcional na região promotora desses genes na glândula pineal.

FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas / Estima-se que 50% dos genes codificadores de proteínas possuem oscilação rítmica em diferentes tecidos de mamíferos. Curiosamente, metade das proteínas desses genes possuem seus RNAm correspondentes com expressão constitutiva (arrítmica), ressaltando a relevância de eventos pós-transcricionais para a oscilação de proteínas. Os “High throughput Assays” (HTA) circadianos são extremamente importantes, pois fornecem informações acerca da expressão de milhares de transcritos e de proteínas, uma rica coleção cronobiológica que pode ajudar na resolução de diferentes problemas científicos, não apenas os abordados nas pesquisas originais. Embora altamente reprodutivos e informativos, ensaios de biologia molecular circadiana apresentam algumas divergências em seus resultados, ressaltando a necessidade do aprimoramento de métodos de normalização e análise dos diferentes ensaios de expressão. Até o momento, não se conhecem os impactos da normalização do RNA em ensaios de expressão de pequenos RNAs, como miRNAs. Este estudo objetivou: (1) analisar a co-expressão de miRNAs e RNAm e proteínas de genes alvos; (2) identificar e validar miRNAs candidatos ao sistema molecular circadiano; (3) analisar o impacto da normalização do RNA total em estudos circadianos de miRNAs. Através da sistematização de diferentes dados circadianos de HTA (RNA-seq, small RNA-seq, Chip-seq e proteoma), de bioinformática e de interações miRNA:RNAm validadas, identificamos uma lista de 152 microRNAs (miRNAs) candidatos ao controle pós-transcricional dos ritmos moleculares. Desses, os dois mais relevantes, miR29b-3p e miR-23b-3p, foram experimentalmente validados como importantes para a manutenção do período dos ritmos das células U2OS PER2:LUC. Análises de HTA também permitiram a identificação de diferenças nas fases de expressão de miRNAs 3p e 5p, com genes alvos divergentes. Interessantemente, a identificação de padrões de expressão de RNAm e proteínas de genes alvos de miRNAs, permite sugerir um mecanismo de ajuste das amplitudes dos ritmos das proteínas dependente da fase do RNAm. Por fim, através do controle de etapas experimentais, demonstramos oscilação circadiana na concentração do RNA total de diferentes regiões de cérebros de camundongos. A normalização desse ritmo, durante a síntese de cDNA, afeta o perfil de expressão de transcritos, incluindo os dos genes relógio Per1-2 e Bmal1. Ademais, através de análises com RNA exógeno, ou spike-ins, demonstramos que o ajuste da concentração do RNA compromete a análise de miRNAs, possivelmente por interferências nos rendimentos de extração e nas reações de síntese de cDNA. Este estudo apresenta dois novos miRNAs importantes para a manutenção da ritmicidade circadiana e uma nova estratégia de análise de qPCR para estudos cronobiológicos de miRNAs.