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Resposta imune inata em sistema nervoso central de camundongos experimentalmente infectados com amostras de vírus rábico isoladas de diferentes espécies / Imune inate and adaptative viral response in central nervous system of mice experimentally infected with rabies virus strains isolated forom different speciesAllendorf, Susan Dora [UNESP] 01 July 2014 (has links) (PDF)
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000829408.pdf: 2465739 bytes, checksum: 3b6cd69550973141a95f15638eea0959 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O controle da raiva é mundialmente reconhecido como um dos grandes desafios mundiais. As diferentes variantes virais isoladas das diversas espécies animais apresentam características imunogênicas distintas assim como na sequência de nucleotídeos, o que permite sua classificação em variantes e genótipos. Além disso, diferenças na patogenicidade também foram observadas através de inoculação experimental em camundongos e cultivo celular. Os mecanismos pelos quais o vírus rábico (RABV) infecta um indivíduo e se perpetua na natureza ainda não foram totalmente esclarecidos. Entretanto alguns fatores que levam ao sucesso da infecção já foram estabelecidos, entre os mais importantes podemos citar a capacidade de induzir a apoptose das células de defesa e preservar a integridade e funcionalidade dos neurônios. Estes eventos são mediados por citocinas que regulam diversos genes envolvidos nesse complexo processo ainda pouco compreendido. Considerando a diversidade de linhagens virais circulantes e a complexidade dos eventos envolvidos na neuroinvasão do RABV o presente projeto avaliou os genes mais importantes envolvidos na expressão gênica do processo de resposta immune inata e adaptativa após infecção e avaliou a patogenicidade de diferentes amostras virais através da inoculação experimental em camundongos SPF (Specific Pathogen Free) realizando a quantificação viral por qRT-PCR e imunofluorescência das amostras coletadas / Rabies control is considered a worldwide challenge. Different virus strains (RABV) are isolated from different species, they have distinct immunogenic characteristics as well in their nucleotides sequence, allowing their classification into variants and genotypes. Furthermore, differences in pathogenicity have also been observed through experimental inoculation in mice and cell cultures. The mechanisms by which RABV infects an individual and perpetuated the infection in nature have not been fully clarified. However some factors that lead to successful infection are already established, among the most important we can mention the ability to induce apoptosis of T cells and maintain the integrity and functionality of neurons. These events are mediated by cytokines that regulate several genes involved in this complex process still poorly understood. Considering the diversity of viral strains circulating and the complexity of events involved in the neuroinvasiveness of RABV this project aims to study the gene expression pathway, innate and adaptative immune response and pathogenicity of different virus strain by means of experimental inoculation in mice, clinical evaluation and avaliating viral replication by DFA and qRT-PCR / FAPESP: 2012/00895-5
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Resposta imune inata em sistema nervoso central de camundongos experimentalmente infectados com amostras de vírus rábico isoladas de diferentes espécies /Allendorf, Susan Dora. January 2014 (has links)
Orientador: Jane Megido / Banca: Hélio Langoni / Banca: Maria Luiza Carrieri / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Banca: Paulo Eduardo Brandão / Resumo: O controle da raiva é mundialmente reconhecido como um dos grandes desafios mundiais. As diferentes variantes virais isoladas das diversas espécies animais apresentam características imunogênicas distintas assim como na sequência de nucleotídeos, o que permite sua classificação em variantes e genótipos. Além disso, diferenças na patogenicidade também foram observadas através de inoculação experimental em camundongos e cultivo celular. Os mecanismos pelos quais o vírus rábico (RABV) infecta um indivíduo e se perpetua na natureza ainda não foram totalmente esclarecidos. Entretanto alguns fatores que levam ao sucesso da infecção já foram estabelecidos, entre os mais importantes podemos citar a capacidade de induzir a apoptose das células de defesa e preservar a integridade e funcionalidade dos neurônios. Estes eventos são mediados por citocinas que regulam diversos genes envolvidos nesse complexo processo ainda pouco compreendido. Considerando a diversidade de linhagens virais circulantes e a complexidade dos eventos envolvidos na neuroinvasão do RABV o presente projeto avaliou os genes mais importantes envolvidos na expressão gênica do processo de resposta immune inata e adaptativa após infecção e avaliou a patogenicidade de diferentes amostras virais através da inoculação experimental em camundongos SPF (Specific Pathogen Free) realizando a quantificação viral por qRT-PCR e imunofluorescência das amostras coletadas / Abstract: Rabies control is considered a worldwide challenge. Different virus strains (RABV) are isolated from different species, they have distinct immunogenic characteristics as well in their nucleotides sequence, allowing their classification into variants and genotypes. Furthermore, differences in pathogenicity have also been observed through experimental inoculation in mice and cell cultures. The mechanisms by which RABV infects an individual and perpetuated the infection in nature have not been fully clarified. However some factors that lead to successful infection are already established, among the most important we can mention the ability to induce apoptosis of T cells and maintain the integrity and functionality of neurons. These events are mediated by cytokines that regulate several genes involved in this complex process still poorly understood. Considering the diversity of viral strains circulating and the complexity of events involved in the neuroinvasiveness of RABV this project aims to study the gene expression pathway, innate and adaptative immune response and pathogenicity of different virus strain by means of experimental inoculation in mice, clinical evaluation and avaliating viral replication by DFA and qRT-PCR / Doutor
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Desenvolvimento de plasmídeos replicativos artificiais para transformação de Mycoplasma pulmonis, M. capricolum e M. mycoïdes subsp. mycoïdes, e dirupção do gene da hemolisina A de M. pulmonis por recombinação homóloga / Development of artificial replicative plasmids for transformation of Mycoplasma pulmonis, M. capricolum and M. mycoïdes subsp. mycoïdes, and disruption of the M. pulmonis hemolysin A gene by homologous recombinationCaio Mauricio Mendes de Cordova 28 June 2002 (has links)
Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.
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Efeito do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) no ciclo de replicação do vírus da hepatite C (VHC) / Effects of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) on the replication cycle of the hepatitis C virusPereira, Isabel Veloso Alves 29 October 2014 (has links)
Estima-se que 170 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas com o vírus da hepatite C (VHC), o que está altamente relacionado à ocorrência de hepatite crônica e carcinoma hepatocelular. A prevalência de esteatose hepática em doentes com hepatite C crônica é muito maior do que na população geral variando entre 40 a 75%. A associação entre a infecção pelo VHC e esteatose hepática é multifatorial. Duas formas de esteatose hepática são encontradas em pacientes com hepatite C crônica: esteatose metabólica (fatores de risco) e citopática relacionada ao genótipo 3a. Os lipídios são essenciais para o ciclo de replicação do VHC, eles podem exercer seu efeito em diferentes níveis como: grupos prostéticos em proteínas virais e/ou cofatores celulares na replicação de VHC, componentes especializados na estrutura do VHC onde ocorre a replicação ou como constituinte das partículas lipovirais. Trabalhos experimentais realizados anteriormente por nosso grupo relataram que a administração do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) promove a inibição do desenvolvimento da esteatose, redução dos marcadores de estresse oxidativo, menor escore de inflamação, melhora nas concentrações de aminotransferases e diminuição da gordura visceral em um modelo animal de esteato-hepatite não alcoólica. A terapia padrão da hepatite C consiste em uma combinação de interferon peguilado alfa (PEG-IFN-alfa) que estimula o sistema imunológico do hospedeiro para combater a infecção e o composto antiviral ribavirina. Atualmente foram aprovados pelas agências de saúde os inibidores de protease Boceprevir, Telaprevir, Daclatasvir e Simeprevir. No entanto, sua eficiência varia entre os genótipos e as constantes mutações do vírus podem levar a resistência. A falta de uma vacina ou uma terapia definitiva faz com que diversos compostos com diferentes mecanismos de ação sejam testados como possíveis alternativas de tratamento. Tendo em vista a capacidade do YHK de reduzir a esteatose e a importância do metabolismo para a replicação do VHC, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do YHK no ciclo celular do VHC. Para isso foram utilizadas técnicas de cultura celular que permitem o estudo das diferenças fases do ciclo de replicação do VHC: entrada (VHCpp), replicação - replicons JFH1-NS3-5B e Con1, replicação e infecção- JC1-Fluc. De forma a elucidar a possibilidade de um único componente da fórmula YHK apresentar efeito sobre o VHC, foram utilizadas para comparação as substâncias ativas de seus ingredientes isoladamente: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; Eucommia ulmoides -(±) Pinoresinol; Licorice root - Ácido Glicirrizínico. Os compostos não apresentaram efeitos na entrada, replicação e liberação de novas partículas virais. Devido à ausência de resultados bem delineados e tendo em vista os resultados das terapias anti-VHC atuais e futuras, é improvável que compostos naturais sejam utilizados ou chegarão ao desenvolvimento clínico nesta indicação / Worldwide is estimated that nearly 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV), highly correlated with the occurrence of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis C patients present higher prevalence of steatosis when compared with the general population, ranging between 40% and 75%. There are two forms of steatosis in HCV infected patients: metabolic steatosis (risk factors) and cytopathic associated with genotype 3. Lipids are essential for the HCV replication cycle. It acts on different functions: as prosthetic groups into viral proteins and / or cellular cofactors in the HCV replication, as specific HCV components or as a constituent of lipovirals particles. Our group previously reported that the administration of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) inhibits steatosis development, decreases markers of oxidative stress and inflammation, improves aminotransferases concentration and decreases the visceral fat. Standard therapy for hepatitis C is a combination of pegylated interferon alpha (PEG-IFN-alfa), stimulating the host immune system to fight infection and the antiviral compound named ribavirin. Nowadays, Telaprevir, Boceprevir, Sofosbovir and Simeprevir are approved as new anti-HCV drugs; they act as protease inhibitors. Its efficiency, however, varies between genotypes, and the constant mutations of the virus can lead to resistance. The lack of vaccines, or a definitive therapy, stimulates the research of new compounds and alternative treatments. In this study, we evaluated the effect of YHK in HCV replication cycle due to the effect of YHK and the importance of lipid metabolism for HCV. For this purpose we used cell culture techniques allowing the study of different stages of HCV replication cycle: entry (HCVpp), replication - replicons JFH1 NS3-5B and Con1, also replication and infection-JC1-Fluc. We also used active compounds of its ingredients: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; eucommia - (±) pinoresinol, Licorice root - Glycyrrhizinic Acid in order to elucidate a possible effect of a single component of the YHK formula in HCV. We could not observe any difference in HCV entry, replication and release in the presence of the four compounds. It is unlikely that natural compounds will be used or come to clinical development in this indication, due to the absence of well defined results and in view of the results of new anti-HCV therapies
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"Hepatite colestática associada ao vírus da hepatite C pós-transplante hepático: estudo virológico, histopatológico e imuno-histoquímico" / Severe recurrent cholestatic hepatitis after liver transplantation : virological, histological and immuno-histochemical evaluationPessôa, Mário Guimarães 20 February 2004 (has links)
A evolução da recorrência da hepatie C pós-transplante hepático pode ter um curso bastante variável. Raramente a doença pode progredir para uma forma conhecida como hepatite recorrente colestática grave, cuja patogenia ainda não é bem conhecida. Nós estudamos nesse trabalho alguns aspectos virológicos, histológicos e imunohistoquímicos de seis pacientes com essa forma rara de recorrência da doença, tendo como comparação um grupo pareado de seis pacientes transplantados com a forma leve de hepatite C recorrente, e como controle imunocompetente, cinco pacientes não transplantados com hepatite crônica pelo vírus C. Foram avaliados como possíveis fatores preditivos de gravidade da progressão da recorrência: viremia do VHC, evolução de quasispécies, parâmetros histopatológicos, e imunoreatividade para o antígeno core do VHC. / Following liver transplantation (OLT) HCV-related disease severity is highly variable, with a minority of cases progressing to an extremely severe form of cholestatic hepatitis, in which the pathogenesis is not yet understood. We aim to compare virological, histological and immunohistological changes in patients developing mild and severe post-OLT HCV recurrence. Twelve patients with recurrent HCV infection were studied (6 with severe and 6 with mild disease). Five HCV-infected immunocompetent patients were used as controls. We looked at viral load, quasispecies evolution of HCV, several histological parameters and immuno-reactivity of core antigens at three time-points (pre-OLT, early post-OLT and late post-OLT) as predictors of severity of recurrence post-OLT.
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Efeito do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) no ciclo de replicação do vírus da hepatite C (VHC) / Effects of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) on the replication cycle of the hepatitis C virusIsabel Veloso Alves Pereira 29 October 2014 (has links)
Estima-se que 170 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas com o vírus da hepatite C (VHC), o que está altamente relacionado à ocorrência de hepatite crônica e carcinoma hepatocelular. A prevalência de esteatose hepática em doentes com hepatite C crônica é muito maior do que na população geral variando entre 40 a 75%. A associação entre a infecção pelo VHC e esteatose hepática é multifatorial. Duas formas de esteatose hepática são encontradas em pacientes com hepatite C crônica: esteatose metabólica (fatores de risco) e citopática relacionada ao genótipo 3a. Os lipídios são essenciais para o ciclo de replicação do VHC, eles podem exercer seu efeito em diferentes níveis como: grupos prostéticos em proteínas virais e/ou cofatores celulares na replicação de VHC, componentes especializados na estrutura do VHC onde ocorre a replicação ou como constituinte das partículas lipovirais. Trabalhos experimentais realizados anteriormente por nosso grupo relataram que a administração do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) promove a inibição do desenvolvimento da esteatose, redução dos marcadores de estresse oxidativo, menor escore de inflamação, melhora nas concentrações de aminotransferases e diminuição da gordura visceral em um modelo animal de esteato-hepatite não alcoólica. A terapia padrão da hepatite C consiste em uma combinação de interferon peguilado alfa (PEG-IFN-alfa) que estimula o sistema imunológico do hospedeiro para combater a infecção e o composto antiviral ribavirina. Atualmente foram aprovados pelas agências de saúde os inibidores de protease Boceprevir, Telaprevir, Daclatasvir e Simeprevir. No entanto, sua eficiência varia entre os genótipos e as constantes mutações do vírus podem levar a resistência. A falta de uma vacina ou uma terapia definitiva faz com que diversos compostos com diferentes mecanismos de ação sejam testados como possíveis alternativas de tratamento. Tendo em vista a capacidade do YHK de reduzir a esteatose e a importância do metabolismo para a replicação do VHC, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do YHK no ciclo celular do VHC. Para isso foram utilizadas técnicas de cultura celular que permitem o estudo das diferenças fases do ciclo de replicação do VHC: entrada (VHCpp), replicação - replicons JFH1-NS3-5B e Con1, replicação e infecção- JC1-Fluc. De forma a elucidar a possibilidade de um único componente da fórmula YHK apresentar efeito sobre o VHC, foram utilizadas para comparação as substâncias ativas de seus ingredientes isoladamente: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; Eucommia ulmoides -(±) Pinoresinol; Licorice root - Ácido Glicirrizínico. Os compostos não apresentaram efeitos na entrada, replicação e liberação de novas partículas virais. Devido à ausência de resultados bem delineados e tendo em vista os resultados das terapias anti-VHC atuais e futuras, é improvável que compostos naturais sejam utilizados ou chegarão ao desenvolvimento clínico nesta indicação / Worldwide is estimated that nearly 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV), highly correlated with the occurrence of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis C patients present higher prevalence of steatosis when compared with the general population, ranging between 40% and 75%. There are two forms of steatosis in HCV infected patients: metabolic steatosis (risk factors) and cytopathic associated with genotype 3. Lipids are essential for the HCV replication cycle. It acts on different functions: as prosthetic groups into viral proteins and / or cellular cofactors in the HCV replication, as specific HCV components or as a constituent of lipovirals particles. Our group previously reported that the administration of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) inhibits steatosis development, decreases markers of oxidative stress and inflammation, improves aminotransferases concentration and decreases the visceral fat. Standard therapy for hepatitis C is a combination of pegylated interferon alpha (PEG-IFN-alfa), stimulating the host immune system to fight infection and the antiviral compound named ribavirin. Nowadays, Telaprevir, Boceprevir, Sofosbovir and Simeprevir are approved as new anti-HCV drugs; they act as protease inhibitors. Its efficiency, however, varies between genotypes, and the constant mutations of the virus can lead to resistance. The lack of vaccines, or a definitive therapy, stimulates the research of new compounds and alternative treatments. In this study, we evaluated the effect of YHK in HCV replication cycle due to the effect of YHK and the importance of lipid metabolism for HCV. For this purpose we used cell culture techniques allowing the study of different stages of HCV replication cycle: entry (HCVpp), replication - replicons JFH1 NS3-5B and Con1, also replication and infection-JC1-Fluc. We also used active compounds of its ingredients: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; eucommia - (±) pinoresinol, Licorice root - Glycyrrhizinic Acid in order to elucidate a possible effect of a single component of the YHK formula in HCV. We could not observe any difference in HCV entry, replication and release in the presence of the four compounds. It is unlikely that natural compounds will be used or come to clinical development in this indication, due to the absence of well defined results and in view of the results of new anti-HCV therapies
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"Hepatite colestática associada ao vírus da hepatite C pós-transplante hepático: estudo virológico, histopatológico e imuno-histoquímico" / Severe recurrent cholestatic hepatitis after liver transplantation : virological, histological and immuno-histochemical evaluationMário Guimarães Pessôa 20 February 2004 (has links)
A evolução da recorrência da hepatie C pós-transplante hepático pode ter um curso bastante variável. Raramente a doença pode progredir para uma forma conhecida como hepatite recorrente colestática grave, cuja patogenia ainda não é bem conhecida. Nós estudamos nesse trabalho alguns aspectos virológicos, histológicos e imunohistoquímicos de seis pacientes com essa forma rara de recorrência da doença, tendo como comparação um grupo pareado de seis pacientes transplantados com a forma leve de hepatite C recorrente, e como controle imunocompetente, cinco pacientes não transplantados com hepatite crônica pelo vírus C. Foram avaliados como possíveis fatores preditivos de gravidade da progressão da recorrência: viremia do VHC, evolução de quasispécies, parâmetros histopatológicos, e imunoreatividade para o antígeno core do VHC. / Following liver transplantation (OLT) HCV-related disease severity is highly variable, with a minority of cases progressing to an extremely severe form of cholestatic hepatitis, in which the pathogenesis is not yet understood. We aim to compare virological, histological and immunohistological changes in patients developing mild and severe post-OLT HCV recurrence. Twelve patients with recurrent HCV infection were studied (6 with severe and 6 with mild disease). Five HCV-infected immunocompetent patients were used as controls. We looked at viral load, quasispecies evolution of HCV, several histological parameters and immuno-reactivity of core antigens at three time-points (pre-OLT, early post-OLT and late post-OLT) as predictors of severity of recurrence post-OLT.
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