Introducción: La inducción de esputo es una técnica escasamente invasora para el estudio y la monitorización de la inflamación de la vía aérea. Objetivos: El objetivo principal del estudio fue comparar el perfil celular y los niveles de citoquinas Th1 y Th2 en esputo inducido entre niños asmáticos atópicos, asmáticos no atópicos y sanos. Métodos: La inducción de esputo fue realizada mediante inhalación de suero salino hipertónico a concentraciones crecientes (3%, 4% y 5%). Se determinó la fracción exhalada de óxido nítrico en los pacientes asmáticos y se midió la FEV1 al inicio y después de cada período de inhalación para garantizar la seguridad de los niños. El procesado del esputo se hizo siguiendo el método de Pizzichini y cols. Se separó el esputo de la saliva y se añadió un volumen de solución de ditiotreitol igual a 4 veces el peso del esputo. Se agitó la mezcla y después de colocarla en banco mecedor durante 10 minutos se añadieron 4 volúmenes de PBS de Dulbecco. La suspensión resultante se filtró a través de una gasa de nylon de 48 micras, centrifugándose a continuación durante 10 minutos a 2.500 rpm para obtener un pellet (sedimento) celular donde se determinaron el recuento celular total y la viabilidad celular y un sobrenadante que se guardó a -80ºC para la determinación de citoquinas. Se consideró una buena muestra si la viabilidad celular era > 60% y la contaminación por células escamosas < 20%. Mediante citocentrífuga se obtuvieron las preparaciones y tras tinción de May-Grünwald-Giemsa se realizó el recuento celular diferencial con microscopio óptico. Los niveles de IFN-gamma, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1beta, TNF-alfa, e IL-12p70 en el sobrenadante se determinaron mediante citometría de flujo (Bender Medsystem, USA). El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS15.0. Se aplicaron los siguientes tests paramétricos o no paramétricos según los grupos seguían o no una distribución normal (prueba de normalidad de Kolmogorow-Smirnov), y según fuera apropiado: t de Student para datos no apareados, análisis de la varianza de una vía, test no paramétricos de la U de Mann-Witney, y de Kruskal-Wallis, Chi-cuadrado, prueba exacta de Fisher y correlación lineal de Pearson. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Los resultados se expresaron como media y desviación estándar (DE) o mediana y rango intercuartílico. Resultados: Se realizó inducción de esputo a 77 niños asmáticos (52 varones) y a 31 sanos (17 varones) de 7 a 15 años. Entre los asmáticos, 51 no recibían tratamiento y 26 recibían corticoides inhalados. Diecisiete pacientes presentaban un asma no atópica y 60 asma atópica. Se obtuvieron 64 muestras en los asmáticos (83,1% de las inducciones) y 24 muestras en los niños sanos (77,4%) de las que 49 y 18 adecuadas respectivamente. La mediana de eosinófilos en esputo inducido de los asmáticos atópicos (1,5%) fue mayor que en los no atópicos (0%) (p=0,02) y que en los niños sanos (0%) (p=0,003). Las citoquinas Th2 (IL-4 e IL-5) y Th1 (IFNgamma, IL-2 e IL-12p70) fueron superiores en los asmáticos atópicos que en los sanos y en los asmáticos no atópicos (p<0,0001). La IL-8 fue mayor en los niños asmáticos (atópicos y no atópicos) que en los controles (p<0,0001). La IL-10 fue mayor en los controles que en los asmáticos atópicos (p=0,03). No existieron diferencias en el resto de citoquinas (IL-6, IL-1beta y TNF-alfa). Conclusiones: El perfil inflamatorio de los niños asmáticos muestra un aumento en las citoquinas proinflamatorias en el esputo inducido respecto a los niños sanos. Existen diferencias en el perfil de citoquinas en esputo inducido entre los niños asmáticos atópicos y no atópicos. / Introduction: Sputum induction is a semi-invasive technique for the study and monitorization of airway inflammation. Objectives: The aim of the present study was to compare the cellular profile and the Th1 and Th2 cytokine levels in induced sputum between atopic asthmatic, non atopic asthmatic and healthy children. Methods: Sputum induction was performed by inhalation of a hypertonic saline solution at increasing concentrations (3%, 4% and 5%). Fractional exhaled nitric oxide was determinate in asthmatic patients and FEV1 was measured at the start and after each period of inhalation to ensure children’s safety. Sputum examination was performed as described by Pizzichini et al. Sputum was separated from contaminating saliva and a weighed aliquot was dispersed with four volumes of freshly prepared dithiothreitol solution. The mixture was vortexed, and after being rocked for 10 minutes, 4 volumes of Dulbecco’s PBS was added. The suspension was then filtered through 48-µm nylon gauze and centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. This resulted in the formation of a cell pellet and supernatant solution. The supernatant was stored at -80º C for analysis of cytokines. Total cell count and cell viability was determined in the cell pellet. We considered good sample if there was cell viability ≥ 60% and contamination by squamous cells < 20%. Cytospin cell preparations were made using a cytocentrifuge and slides were stained with May-Grünwald-Giemsa to determine the differential cell count using optic microscopy. In sputum sample supernatants IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IL-4, IL-5, IL-1β, TNF-α, and IL-12p70 levels were determined by flow cytometry (Bender Medsystem, USA). Statistical analyse was performed with SPSS® 15.0 program. Parametric and non-parametric tests were applied according to normal distribution (Kolmogorov-Smirnov test): Student’s t-test for independent samples, ANOVA, Mann-Whitney U test and Kruskal-Wallis as non-parametric tests, Chi-square test and Pearson’s correlation. Values of p < 0.05 were considered significant. Results are expressed as mean and standard deviation (SD) or median and interquartile range. Results: Sputum induction was performed in 77 asthmatic children (52 boys) and in 31 healthy children (17 boys) from 7 to 15 years old. Fifty one of asthmatic children were with no treatment and 26 were receiving inhaled corticosteroids. Seventeen patients had non atopic asthma and 60 had atopic asthma. We obtained 64 samples in patients (83.1% of inductions) and 24 samples in healthy children (77.4%). We considered 49 and 18 good samples respectively. Median eosinophil count in atopic asthma (1.5%) was higher than in nonatopic asthma (0%) (p=0.02) or healthy children (0%) (p=0.003). Th2 cytokines (IL-4 and IL-5) and Th1 cytokines (IFNγ, IL-2 and IL-12p70) were higher in atopic asthmatic children than in healthy and non atopic asthmatic children (p<0,0001). IL-8 was higher in asthmatic children (atopic and non atopic) than controls (p<0,0001). IL-10 was higher in controls than atopic asthmatic children (p=0,03). There were no differences in the other cytokines (IL-6, IL-1β and TNF-α). Conclusions: The inflammatory profil of asthmatic children shows an increase in proinflammatory cytokines in induced sputum respect to healthy children. There are differences in cytokine profile of induced sputum in atopic and non atopic asthmatic children.

INTRODUCCIÓN: Actualmente las infecciones causadas por Streptococcus Pneumoniae son una importante causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En la práctica clínica se dispone de dos tipos de vacunas antineumocócicas: una vacuna 23-valente basada en los polisacáridos capsulares (VNP23) para uso en adultos, y varias formulaciones de vacunas conjugadas con proteínas transportadoras (VNC7, VNC10 y VNC13). El presente trabajo evalúa la epidemiología de la enfermedad neumocócica, incidencia, factores de riesgo, distribución de serotipos e impacto de la vacunación. METODOLOGÍA Estudio de cohortes de base poblacional que incluyó todos los casos de enfermedad neumocócica en la población infantil y anciana del área de Tarragona. Los datos se obtuvieron de los registros de 19 centros de atención primaria (CAPs) y laboratorios de los dos hospitales de referencia en el área de estudio. Se utilizaron los registros de laboratorio para identificar los casos de infecciones por neumococo no detectadas en los códigos CIE-9. La serotipificación de los neumococos aislados se realizó por la reacción de Quellung o test de dot-blot. RESULTADOS: Durante el período total de estudio (2002-2009), se observaron 440 casos de infección neumocócica invasiva en la población general. Se observó una mayor tasa de incidencia de neumonías bacteriémicas en personas mayores de 65 años (TI 211,6 por 100 000 personas/año); y mayor número de bacteriemias primarias en el grupo de 0 a 14 años (TI 104,5 por 100 000 personas/año). En los tres grupos de edad durante todo el periodo de estudio, destacaron los serotipos 1 (18%), 14 (10%), 7F (10%), 19 A (8.6%) y 3 (7.1%). Destacó una mayor distribución del serotipo 1 y 14 entre los grupos 0-14 años (33,9% y 23.1% respectivamente). El serotipo 7F y 3 tuvo una distribución casi similar entre los grupos de 15-64 años y >65. El serotipo 19 A se presentó con mayor frecuencia en niños y en ancianos siendo ligeramente mayor en niños (10.8% frente al 9.4%). Cuando de compararon todos los casos de ENI debida a serotipos incluidos en la VNP23, VNC7, VNC10 y VNC13 según grupos de edad y período de estudio, se detectaron más casos por serotipos incluidos en la VNC13 y en la VNP23, con una mayor presentación en el primer período (2002-2005). Se evaluaron los factores de riesgo de ENI en la población adulta de Tarragona durante todo el período de estudio de los cuales destacaron el tabaquismo (22,3%), diabetes (11,4%) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (10,2%). CONCLUSIONES - Nuestro estudio refleja que una mayor frecuencia de neumonías neumocócicas en la población mayor de 65 años y bacteriemias primarias en la población infantil. - Durante todo el periodo de estudio se presentaron más número de casos por los serotipos 1, 14, 7F, 19 A y 3; los serotipos 1,14, 19 A se presentaron más en niños y en adultos el 19 A, 3,7F. Del total de casos se detectaron más casos por serotipos incluidos en la VNC13 y en la VNP23. / INTRODUCTION: Currently infections caused by Streptococcus pneumoniae are an important cause of morbidity and mortality worldwide. In clinical practice there are two types of pneumococcal vaccines: 23-valent capsular polysaccharides vaccine (PPV23) for use in adults, and several conjugate vaccine formulations with carrier proteins (PCV7, PCV10 and PCV13). This paper evaluates the epidemiology of pneumococcal disease, incidence, risk factors, serotype distribution and impact of vaccination. METHODOLOGY Population-based cohort study that included all cases of invasive pneumococcal diseases occurred in the Tarragona area population. The data were obtained from the records of 19 primary care centers (PCCs) and laboratories of the two referral hospitals in the study area. Laboratory records were used to identify cases of undetected pneumococcal infections in ICD-9. Pneumococci isolated were serotyped by the Quellung reaction or dot-blot test. RESULTS: During the entire study period (2002-2009), there were 440 cases of invasive pneumococcal infection within the general population. They reported a higher incidence of bacteremic pneumonia in people over 65 years (IR 211.6 per 100 000 persons/year) and highest number of bacteremia in the group of 0-14 years (IR 104.5 per 100 000 persons/year). In all three age groups throughout the study period the most prevalent serotypes are : serotypes 1 (61%), 14 (10%), 7F (10%), 19 A (8.6%) and 3 (7.1%). There was greater distribution of serotype 1 and 14 between groups 0-14 years (33.9% and 23.1% respectively). The serotype 7F and 3 had an almost similar distribution between groups of 15-64 years and> 65. Serotype 19A occurred more frequently in children and the elderly being slightly higher in children (10.8% vs. 9.4%). When comparing all cases of IPD due to serotypes included in the PPV23, PCV7, PCV10 and PCV 13 by age group and study period, cases were detected by serotypes included in PCV 13 and the PPV 23 were more prevalent in the first period (2002-2005). We assessed risk factors in IPD in the adult population of Tarragona during the entire period of study which highlighted the smoking with a 22.3%, diabetes with 11.4% and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) with 10.2%. CONCLUSIONS - Our study shows that a higher frequency of pneumococcal pneumonia in the elderly population aged 65 and bacteremia in children. - Throughout the study period there were more number of cases by serotypes 1, 14, 7F, 19 A and 3; serotypes 1, 14, 19 A were more frequent in children and in adults 19 A, 3.7 F. - Among all serotypes identified, the most frequent serotypes were those included in PPV23 and PCV 13.

El treball d’aquesta tesi consisteix en proporcionar una visió global dels pacients amb Malaltia Pulmonar Obstructiva Crònica (MPOC) i avaluar l’efectivitat d’un programa d’educació mèdica integral dirigit als professionals sanitaris d’Atenció Primària de Salut (APS) comparat amb la pràctica habitual. Aquesta tesi fa una incursió en el diagnòstic, el maneig i l’estat de salut dels pacients amb MPOC i pretén aportar a través de tres estudis publicats en revistes d’impacte un coneixement més profund sobre l’ús de l’espirometria, l’impacte de programes d’educació integral en metges i infermeres dels pacients amb MPOC i l’evolució de la qualitat de vida dels pacients MPOC al llarg del temps dins l’àmbit d’APS. El primer estudi es dedica a conèixer l’estat d’utilització de l’espirometria en l’atenció dels malalts amb MPOC. Com a aportació més important indica la infrautilització de l’espirometria dins l’àmbit d’APS. La seva realització durant el seguiment no es va associar a unes pautes diferents de tractament ni a un abordatge més complet de la malaltia. A més, es va observar variabilitat significativa en la realització d’espirometries diagnòstiques entre els diferents centres d’APS. Tot i que darrerament s’ha difós molt l’ús de l’espirometria en el primer nivell assistencial, aquests resultats posen de manifest que l’espirometria continua sent infrautilitzada i que hi ha una necessitat d’Implementar programes per millorar l’ús de l’espirometria a l’APS. El segon estudi mostra que la implementació d’un programa d’educació integral en Atenció Primària dirigida als professionals de la salut, basat en l’aplicació de diferents estratègies i focalitzat en aspectes d’educació sanitaria recomanats per les Guies de Pràctica Clínica no va aconseguir els canvis esperats en la qualitat de vida dels pacients MPOC a l’any de seguiment. No obstant això, en aquest estudi es va observar un canvi de conducta en els professionals i en conseqüència una millora en el maneig clínic i en els estils de vida dels pacients tot i que no es va acompanyar de cap millora ni en l’evolució clínica ni en l’estat de salut dels malalts MPOC al cap d’un any de seguiment. Aquets resultats controvertits proporcionen nova evidencia sobre l’impacte en els pacients MPOC d’un programa d’intervenció dels metges i infermeres, i poden ajudar en el desenvolupament de futurs programes educatius per professionals sanitaris i pacients amb MPOC més efectius. Els resultats del tercer estudi indiquen que els pacients amb MPOC atesos a l’APS no presenten un deteriorament important en el seu estat de salut després d’un any de seguiment, quan es consideren globalment. Tot i així, hem detectat una gran variabilitat a nivell individual. Un terç dels pacients (36,7%) van presentar una millora clínicament rellevant de la seva QVRS, associada a l’inici de la polimedicació, visites al pneumòleg, dieta equilibrada, deixar de realitzar rehabilitació respiratòria, deixar de fumar, i no ser un exacerbador freqüent. D’altra banda, un altre terç (29,2%) dels pacients amb MPOC van presentar un empitjorament clínicament rellevant de la seva QVRS, associat a un increment dels símptomes i dels ingressos hospitalaris. El disseny de l’estudi va permetre observar que la incidència de determinats factors clínics i de tractament durant el seguiment influenciaven més la QVRS que no la seva persistència La valoració d’aquests canvis pot ajudar als professionals sanitaris a millorar l’atenció i satisfacció del pacient. / The main aim of this PhD Thesis is to provide an overview of the patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and to evaluate the effectiveness of a comprehensive health education programme for primary health care (PHC) professionals compared with standard clinical practice. This thesis includes the results from 3 published articles that analyze three essential elements of COPD: diagnosis, management and health status of patients with COPD. The articles evaluate the actual use of spirometry, the impact on patients with COPD of comprehensive education programmes for health professionals and the progression of quality of life (QoL) of patients with COPD in the PHC setting. The main observation of the first study, which examined the actual use of spirometry for patients with COPD, is the underuse of spirometry in PHC. Moreover, the use of spirometry during follow up was not associated with changes in clinical management or with a more comprehensive approach to the disease. Also, a significant variability in the use of diagnostic spirometry was observed between primary care centres. Despite the recent expansion in the use of spirometry in PHC, the results of this study highlight the underuse of this technique and the need to implement programmes to improve the use of spirometry in PHC. The results of the second study show that the implementation of a comprehensive education programme for PHC professionals based on different strategies and health education as recommended in the clinical practice guidelines did not achieve the expected improvement in QoL for patients with COPD at 1-year follow up. Indeed, the change in attitudes of professionals that resulted in better clinical care and better patient lifestyle was not associated with significant improvements in the clinical progression or health status of patients with COPD. These conflicting results underline the need for more effective educational programmes for health professionals and COPD patients. The results of the third study indicate that the health status of patients with COPD does not significantly deteriorate after a year of follow up in PHC. However, a great individual variability was detected. Indeed, a third of the patients showed a significant improvement in their health-related quality of life (HRQoL), which was associated with the start of polymedication, visits to the respiratory medicine specialist and of a balanced diet and with stopping respiratory rehabilitation, quitting smoking and not being a frequent exacerbator. Another third of COPD patients showed a significant worsening in their HRQoL associated with an increase in symptoms and hospital admissions. The design of the study demonstrated that the incidence of some clinical symptoms had a greater impact on the HRQoL than their persistence. The results of this study will help health professionals to improve care and satisfaction for the patient with COPD.

Las motivaciones para iniciar el desarrollo de esta tesis se basaron en un estudio previo, con pocos pacientes, que exponía que los individuos residentes en la ciudad de Barcelona presentan un determinado depósito pulmonar de amianto. Quisimos también establecer los niveles de cuantificación de amianto en pulmón, en población española, mediante microscopia óptica (MO) de manera que fueran precisos y reproducibles con tal de poder realizar análisis de cuerpos de amianto (CA) de forma rutinaria. Después estandarizar la técnica en nuestro laboratorio quisimos estudiar si unas patologías respiratorias presentaban un mayor depósito de CA pulmonares; así que estudiamos pacientes con carcinoma pulmonar y asbestosis, y comparamos sus resultados con los de individuos sanos no expuestos. Finalmente, y tras haber realizado estudios en pacientes de distintos hospitales españoles, quisimos profundizar más y estudiamos el tipo de amianto pulmonar más prevalente en población española. Las primeras investigaciones llevadas a cabo en el desarrollo de esta tesis nos han permitido determinar que la prevalencia de este mineral en población urbana española es de entre 0 y 300 CA/g tejido pulmonar seco, teniendo en cuenta que niveles superiores a 1000 CA/g se consideran internacionalmente como potencialmente causantes de patrología. Al estudiar la distribución de amianto en las distintas zonas pulmonares, no encontramos diferencias significativas; aunque pudimos observar que las concentraciones más elevadas se encontraron en el lóbulo inferior en el 48% de los casos. Al establecer un método reproducible de análisis de CA en pulmón, nos posicionamos como laboratorio de referencia en España. Demostramos que la lectura de los CA por un único observador era suficiente de manera sistemática, y que únicamente en aquellos casos con niveles alrededor de los 1000 CA/g tejido seco era necesaria doble lectura. El proyecto de investigación destinado a estudiar las enfermedades relacionadas con el amianto en trabajadores expuestos al amianto en el desarrollo de su trabajo nos permitió estudiar la relación entre los años de exposición a este mineral y el hábito tabáquico. Observamos que los trabajadores de los astilleros del Ferrol tenían unos elevados niveles de amianto pulmonar; y concluimos que el amianto debería considerarse como causa potencial de enfermedad pulmonar en trabajadores de los astilleros. Al caracterizar las distintas fibras de amianto encontradas en los pulmones de población española, con exposición al amianto y sin ella, pudimos ver que la crocidolita era el tipo de amianto más frecuente. Observamos la ausencia de crisotilo en las muestras analizadas y ello nos llevó a sugerir que se producía una eliminación de las fibras de crisotilo después de su inhalación. / The idea for this thesis emerged from the results of a previous study with a small patient sample which assessed the deposition of asbestos in the lung in residents of the city of Barcelona. Using light microscopy (LM), we also aimed to establish accurate, reproducible reference levels of asbestos in the lung in the Spanish population, in order to allow routine analyses of asbestos bodies (AB). After standardizing the technique in our laboratory, we aimed to assess whether certain respiratory diseases had a higher lung deposition of AB. To do so, we studied patients with lung cancer and asbestosis and compared their results with those of healthy, unexposed individuals. Finally, after performing studies in patients from different Spanish hospitals, we aimed to identify the most prevalent type of asbestos deposited in the lung in the Spanish population. The initial studies carried out as part of this thesis established that the prevalence of asbestos in the Spanish urban population was between 0 and 300 AB / g dry lung tissue. Levels over 1000 AB / g are regarded internationally as potential causes of pathology. Studying the distribution of asbestos in various areas of the lung, no significant differences were observed, although the highest concentrations were found in the lower lobe in 48% of cases. Thanks to our team’s development of a reproducible method for the analysis of lung AB, our laboratory is now established as a reference centre in Spain. We demonstrated that a single observer’s reading of AB was sufficient, and that a second reading was only necessary in patients with levels around 1000 AB / g dry tissue. The research project aimed to studying asbestos-related disease in workers exposed to the mineral in the course of their occupational activity. We were able to study the relationship between years of asbestos exposure and smoking. We found that the shipyard workers of El Ferrol had high levels of asbestos in the lung, and concluded that asbestos should be considered as a potential cause of lung disease in this population. In our characterization of the various types of asbestos fibre found in the lungs of Spanish population with and without exposure to asbestos, crocidolite was the most frequently identified. Chrysotile was not recorded in the samples analysed, suggesting that this form of the mineral is eliminated after inhalation.

Existeixen evidències de que els canvis en la funció de la circulació pulmonar, que tenen lloc en la malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC), tenen el seu origen a la lesió de la cèl.lula endotelial i estan causats pel consum de tabac. No obstant això, el desenvolupament d'hipertensió pulmonar s'associa a la presència de hipoxèmia en les fases més greus de la malaltia. La nostra hipòtesi és que el fum de tabac és el factor iniciador del procés i que la combinació del fum de tabac i hipòxia té un paper crític en la patogènesi de la hipertensió pulmonar a la MPOC. Tenint en compte aquests antecedents, el present projecte té dos objectius. 1: Desenvolupar un model experimental en cobai de malaltia pulmonar induïda per l'exposició al fum de tabac, dirigit a avaluar els mecanismes patogènics de les alteracions de la circulació pulmonar. 2: Estudiar els efectes de l'exposició a fum de tabac i la hipòxia crònica, com estímuls separats i / o combinats, sobre la pressió arterial pulmonar (PAP) i el remodelat vascular pulmonar en el mateix model animal. Per a això, es realitzaran 2 estudis: Estudi 1) 35 cobais exposats a 7 cigarrets / dia, 5 dies a la setmana per un període de 3 (n = 15) i 6 mesos (n = 20). Un grup control (n = 17) s'exposarà falsament durant el mateix temps i en les mateixes condicions. Les variables a estudiar són: funció endotelial en bany d'òrgans, morfometria de vasos pulmonars i emfisema. Estudi 2) 32 cobais exposats al fum de 5 cigarrets / dia, 5 dies / setmana durant 12 setmanes. Altres 32 cobais seran falsament exposats durant el mateix període de temps. 16 cobais de cada grup seran exposats a més a hipòxia crònica (12% O2) 24h/dia en una càmera normobàrica durant els darrers 15 dies. Les variables a estudiar són: PAP, relació del pes del ventricle dret / pes ventricle esquerre + septe i el grau de remodelat vascular pulmonar. Basant-nos en la hipòtesi que el fum de tabac és la primera causa de lesió en la circulació pulmonar esperem trobar una menor resposta vasodilatadora a agents vasoactius dependents de la síntesi d'òxid nítric en les artèries pulmonars dels animals exposats a fum de tabac versus els controls. Aquesta disfunció endotelial hauria de ser corroborada amb absència de resposta vasodilatadora de l'artèria en presència de L-NAME (inhibidor de l'enzim convertidor de l'òxid nítric). En concordança amb aquest resultat, l'expressió d'òxid nítric mesurada mitjançant PCR esperem que es vegi disminuïda en els animals exposats a fum de tabac explicant així l'alteració i la implicació del tabac en la via de l'òxid nítric. En els estudis morfològics esperem demostrar un increment del gruix de l'artèria pulmonar en els animals exposats a fum de tabac així com un increment del nombre de vasos α-actina + i amb presència de doble làmina elàstica en els animals exposats a fum de tabac. El marcatge positiu o negatiu per desmina determinarà el fenotip diferenciat o primitiu respectivament de les cèl.lules encarregades del remodelat vascular. Si el temps d'exposició a fum de tabac és l'adequat esperem trobar presència d'emfisema. D'aquesta manera també determinarem el time-course de la patologia pulmonar causada pel fum de tabac. El segon estudi es centra en l'efecte sinèrgic que presentaria la combinació de tabac i hipòxia sobre la hemodinàmica pulmonar, el remodelat vascular i la hipertròfia del ventricle dret. També definiria el paper individual del fum de tabac i de la hipòxia sobre la funció endotelial, que esperem sigui deleteri. Si els resultats del primer estudi pel que fa a remodelat vascular són els esperats, en aquest segon estudi s’hauria d’observar un augment de la presència de fibres elàstiques i de la proliferació de cèl.lules musculars en el grup tractat amb hipòxia, en el grup exposat a fum de tabac i en el grup que combina els dos factors. / PULMONARY VASCULAR ALTERATIONS INDUCED BY EXPOSURE TO CIGARETTE SMOKE IN AN ANIMAL MODEL OF COPD There are evidences that changes in the function of pulmonary circulation, which occur in chronic obstructive pulmonary disease (COPD), have their origins in the injury of endothelial cells and are caused by smoking. However, the development of pulmonary hypertension is associated with hypoxemia in the presence of more severe stages of the disease. Our hypothesis is that cigarette smoke is the key initiator of the process and that the combination of smoke and hypoxia plays a critical role in the pathogenesis of pulmonary hypertension in COPD. Given this background, this project has two objectives. 1: Develop an experimental guinea pig model of pulmonary disease induced by cigarette smoke exposure, addressed to evaluate the pathogenic mechanisms of pulmonary circulation alterations. 2: Study the effects of the exposure to cigarette smoke and chronic hypoxia as separated and / or combined stimuli, on pulmonary arterial pressure (PAP) and pulmonary vascular remodeling in the same animal model. To do this, there two studies will be performed: 1) 35 guinea pigs exposed to 7 cigarettes per day, 5 days a week for a period of 3 (n = 15) and 6 months (n = 20). A control group (n = 17) sham exposed for the same time and under the same conditions. The variables studied are: endothelial function in organ bath, vessel morphometry and pulmonary emphysema. 2) 32 guinea pigs exposed to the smoke of 5 cigarettes / day, 5 days / week for 12 weeks. Another 32 guinea pigs will be sham exposed during the same period of time. 16 guinea pigs from each group will also be exposed to chronic hypoxia (12% O2) in a normobaric chamber 24h/day over the last 15 days. The variables studied are: PAP, the weight ratio of right ventricle / left ventricle + septum weight and degree of pulmonary vascular remodeling.

1) INTRODUCCIÓN. Las complicaciones pulmonares en los pacientes con infección por el VIH son actualmente un problema de primer orden. Constituyen la primera causa de ingreso hospitalario de estos pacientes en nuestro medio. Además, la mayoría experimenta alguna complicación de este tipo a lo largo de su evolución. La epidemiología ha sufrido notables cambios en el tiempo. El primer gran hito se produjo tras la generalización del uso de la profilaxis, tanto primaria como secundaria, frente a Pneumocystis jiroveci (anteriormente denominado P. carinii). Más recientemente, la introducción del tratamiento antirretroviral de gran eficacia (TARGA) ha supuesto cambios considerables en la historia natural de la infección por el VIH y sus complicaciones; sin embargo no se conoce bien su impacto en el desarrollo de complicaciones pulmonares, particularmente las que no constituyen infecciones oportunistas.2) OBJETIVOS. Estudiar la incidencia, etiología y pronóstico de las complicaciones pulmonares en los pacientes VIH tras la introducción del TARGA. Evaluar la rentabilidad de las técnicas diagnósticas utilizadas, según el protocolo establecido. Estudiar el patrón de respuesta inflamatoria, mediante la medición plasmática de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias (IL-1&#946;, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-&#945;) y proteína C reactiva (PCR) en las complicaciones pulmonares más frecuentes; evaluar su correlación con la etiología y el pronóstico.3) PACIENTES Y MÉTODOS. Se realizó un estudio prospectivo de casos consecutivos de los pacientes VIH que ingresaron en el Hospital Clínic de Barcelona entre los años 1998-2000 y presentaban, a su ingreso o durante el mismo, infiltrados pulmonares radiológicos. Los pacientes se siguieron hasta la resolución del infiltrado. En todos los casos se realizó un protocolo estandarizado encaminado a la obtención del diagnóstico etiológico. Se extrajo una muestra de sangre al ingreso de los pacientes y al 4º-6º día para la determinación de PCR y citocinas plasmáticas.4) RESULTADOS. En la actualidad los infiltrados pulmonares en los pacientes con infección por el VIH suponen 25 episodios/100 ingresos hospitalarios y año en nuestro medio. La etiología más frecuente es la neumonía bacteriana, particularmente la producida por neumococo; en segundo lugar la neumonías por P. jiroveci y en tercer lugar las micobacteriosis, sobre todo la tuberculosis. La mortalidad global debida a estas complicaciones es del 10%. Los factores independientes asociados con una mayor mortalidad en estos pacientes son: la edad superior a 50 años, el requerimiento de ventilación mecánica y la no obtención de un diagnóstico etiológico. Los procedimientos diagnósticos más rentables en el estudio de estas complicaciones son el cultivo del esputo (51%) y de las muestras obtenidas mediante broncoscopia (56%). Al ingreso de los pacientes, la PCR y la IL-8 plasmática están más elevadas en los pacientes con neumonía bacteriana que en los que tienen otros diagnósticos (micobacteriosis y neumonía por P. jiroveci). El TNF-&#945; es significativamente superior en las micobacteriosis; un valor superior o igual a 60 &#961;g/ml tiene un valor predictivo negativo de micobacterioris del 97% frente a otros diagnósticos (neumonía bacteriana y neumonía por P. jiroveci). Un valor plasmático elevado de IL-8 al ingreso (superior a 61 &#961;g/ml) constituye un factor independiente asociado con mayor mortalidad en los pacientes VIH con infiltrados pulmonares.5. CONCLUSIONES.Los infiltrados pulmonares constituyen una causa frecuente de ingreso hospitalario de los pacientes VIH en nuestro medio en la actualidad, siendo las causas más frecuentes la neumonía bacteriana, la neumonía por P. jiroveci y las micobacteriosis, por este orden. La obtención de un diagnóstico etiológico tiene importancia pronóstica en estos pacientes. Los procedimientos diagnósticos más rentables son el cultivo de esputo y el lavado broncoalveolar. Los niveles de PCR y citocinas plamáticas pueden tener un papel en el diagnóstico y el pronóstico de las complicaciones pulmonares en pacintes VIH. / Pulmonary complications in human immunodeficiency virus-infected (HIV)-infected patients are at present a first-rate problem. They are the main cause of hospital admission of these patients in our country. Moreover, most HIV-patients have a pulmonary complication during the evolution of the infection. The main etiologic diagnosis is bacterial pneumonia, specialy neumococcal pneumonia; the second most frequent cause is "Pneumocystis jiroveci" (previously named "P. carinii") pneumonia and the third cause is mycobacteriosis, particularly "Mycobacterium tuberculosis". From early studies, important changes in the epidemiology of HIV-related pulmonary complications have occured. General prescription of "P. jiroveci" primary prophylaxis is probably one of the main causes, and, more recently, the use of highly active antiretroviral therapy may also be an underlying explanation. In this study, epidemiology, diagnosis and outcome of HIV-related pulmonary complications in our country are investigated. Additionally, the role of plasma proinflammatory cytokines, anti-inflammatory cytokines, and C-reactive protein in the diagnosis and outcome of HIV-infected pacients with pulmonary infections is evaluated.

La infección causada por el virus influenza A (VIA) causa una enfermedad aguda y recurrente con graves consecuencias sobre la salud pública mundial. El VIA es altamente contagioso y único entre las infecciones humanas presenta dos patrones epidemiológicos. Uno como epidemias estacionales anuales y otro como pandemias cada largo periodo de tiempo. En el 2009 se produjo la primera pandemia del siclo XXI, la cual presentó alta morbilidad causando más de 250.000 muertes alrededor del mundo. La mortalidad observada durante la pandemia fue similar a la observada en previas epidemias estacionales. Sin embargo, adultos jóvenes y niños resultaron desproporcionalmente afectados, resultando en un 60% de los casos descritos. Desde el inicio de la pandemia, el virus H1N1pandémico se ha establecido alrededor del mundo desplazando al anterior virus H1N1 estacional. Actualmente, la infección causada por el virus H1N1 pandémico resulta primordialmente en enfermedad leve, no obstante puede resultar en enfermedad grave en algunos casos. Los casos severos descritos se han relacionado con altos niveles de replicación viral acompañados de respuestas inflamatorias exacerbadas. La patogénesis causada por la infección del virus pandémico H1N1 es el resultado de varios procesos los cuales involucran tanto las capacidades infectivas virales como la respuesta inmunitaria del huésped. Por lo tanto, el entendimiento de ambas características y sus interacciones es importante para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas contra la infección. Varias investigaciones se han llevado a cabo para entender la patofisiología de la infección de los VIA. Entre los modelos animales utilizados, el hurón es uno de los modelos más atractivos ya que hurones y humanos comparten una fisiología pulmonar y una enfermedad clínica similar. Sin embargo, el hurón presenta varios inconvenientes, entre los cuales se encuentra la limitada caracterización de su sistema inmune. En el estudio I de esta tesis, se han caracterizado diferentes aspectos del sistema inmune del hurón para posteriormente utilizar el modelo de hurón en la infección experimental de diferentes aislados humanos del virus pandémico H1N1 para finalmente estudiar las interacciones ocurridas entre el virus y la respuesta inmune del huésped. En el estudio II, se han estudiado las diferentes virulencias de dos aislados virales con características víricas semejantes, pero que resultaron en patología de diferente gravedad, en los respectivos pacientes humanos (síntomas leves versus fallecimiento). En el estudio III, se han estudiado la diferentes virulencias de dos aislados virales con diferentes características víricas (un virus natural y un virus resistente a Oselamivir portador de la mutación “H275Y”), los cuales fueron aislados de pacientes humanos que desarrollaron infecciones fatales. La infección experimental en hurones con diferentes virus pandémicos H1N1 humanos se asoció a daño pulmonar de diferentes grados. En general, las lesiones pulmonares más severas correlacionaron con replicación viral en aéreas alveolares, elevada expresión de genes inductores de citoquinas a nivel pulmonar y presencia de infiltrados inflamatorios pulmonares. Nuestros resultados han revelado que la presencia de replicación viral en áreas alveolares no está únicamente relacionada con las capacidades infectivas virales sino también con el tipo de respuesta inmune inducida por el huésped. Animales infectados con cepas virales de similares características, desarrollaron diferentes grados patológicos dependiendo del tipo/magnitud de la respuesta inmune del huésped e independientemente de la cepa vírica inoculada. Por el contrario, en el caso de animales infectados experimentalmente con cepas virales con diferentes mutaciones afectando la velocidad de replicación viral, la patogenia observada en los animales se relacionó con la cinética viral del inoculo. Los hurones infectados con el virus resistente al antiviral Oseltamivir presentaron una patología más leve en comparación con los hurones infectados con un aislado vírico natural. En ambos estudios, las lesiones pulmonares severas correlacionaron con la presencia de replicación viral en pneumocitos y con un aumento en la expresión de los genes de la inmunidad innata TLR3, IL-6, CXCL10, CCL5, CCL3, IL-8 además de los marcadores apoptóticos (BAX y CASP8). Estos perfiles de expresión genética, a su vez se correlacionaron con el fenotipo de células inflamatorias observadas en los pulmones. El fenotipo celular se caracterizó por altos números de macrófagos y neutrófilos en apoptosis acompañados de elevados números de células T citotóxicas y células NK. Por el contario, las lesiones pulmonares leves se correlacionaron con la presencia de replicación viral restringida a áreas bronquiolares además de un aumento en la expresión génica de los genes de la inmunidad innata IFN tipo I y RIG-I, sugiriendo que la inducción de IFN tras la infección por VIA es beneficiaria para el huésped. La entrada de leucocitos a los pulmones está marcada por la señalización de moléculas de la inmunidad innata, como las citoquinas y las quemoquinas, las cuales inducen la migración de diferentes tipos celulares a los pulmones. En el estudio IV, hemos utilizando la técnica de microdisección de captura láser para estudiar la expresión génica y por lo tanto la señalización de la inmunidad innata en diferentes compartimentos anatómicos pulmonares (bronquiolar, alveolar y vascular), en respuesta a la infección por el virus pandémico H1N1 en hurones. Los resultados obtenidos han identificado a las áreas bronquiolares y alveolares como las primeras inductoras de la respuesta inmune innata tras la infección y por tanto responsables del primer influjo de células inflamatorias, a través de la expresión génica de IFNα, IFNγ, IL-6 y TNF. Sin embargo, la expresión de TLR3 y CCL2 fue principalmente observada en áreas vasculares durante la infección. Asimismo, las áreas vasculares también presentaron una elevada expresión de los genes IFNγ e IL-6, apuntando a su importante contribución en el influjo de células inflamatorias al pulmón y en la inducción de la respuesta innata en los primeros estadios de la infección. A pesar de que no se observó la presencia de antígeno vírico y por tanto de replicación activa del virus en áreas vasculares. Sí, se detectaron elevados niveles de ARN viral por RT-PCR a tiempo real en áreas vasculares. Estos resultados indican que las áreas vasculares pulmonares podrían contribuir a la inducción de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento de RNA viral o a través de la comunicación con células infectadas en otras áreas pulmonares. La presente tesis subraya la importancia de la localización de replicación viral junto con la correcta orquestación de la respuesta inflamatoria inmune temprana como factores determinantes en el desarrollo de patología severa, tras la infección con el VIA. Creemos que esta tesis proporciona datos nuevos para clarificar el rol del la respuesta inmune en la patogenia divergente observada tras la infección del virus H1N1 pandémico del 2009. El entendimiento de las interacciones entre las características víricas genéticas y la respuesta inmunológica del huésped son importantes para el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas contra la infección por el virus influenza. / Influenza A virus (IAV) infection is an acute and recurring respiratory disease which has an elevated effect on public health worldwide. IAV infection is highly contagious and unique among human viruses, having two epidemiological modes, as seasonal epidemics, or over longer time periods, as pandemics. The first pandemic of the 21st century occurred in 2009 by an H1N1 type virus, causing high rates of morbidity and more than 250.000 deaths around the world. Overall, the case fatality rate was similar to that of seasonal influenza. However, previously healthy young adults and children were disproportionally affected, accounting for more than 60% of the reported cases. The pandemic H1N1 virus has now been established itself worldwide, replacing the previous seasonal H1N1 virus. Currently, the infection causes predominantly mild disease, but it can develop onto severe illness in some cases. Severe pandemic H1N1 outcomes have been related to high viral replication capacities and exacerbated host inflammatory immune responses. The pathogenesis of pandemic H1N1 infection results from various processes involving the host immune system and their response to virus-induced changes. Understanding both virus and host response characteristics in severe and mild infection cases is important for the future development of therapeutic strategies. Several investigations have been carried out in order to understand the physiopathology of pandemic H1N1 infection. Among influenza animal models, the ferret is an attractive model due to the fact that they share similar lung physiology with humans and demonstrate a similar disease entity, without prior viral adaptation. However, the immune system of ferrets has not been very well characterised. In study I of this dissertation, we characterised different immune system cells in ferret tissues in order to then characterise viral-host interactions, occurring in the lungs of H1N1v infected ferrets. In study II, we used the ferret model to study the differences in virulence of two human viral isolates, presenting similar genetic characteristics, yet resulting in different disease outcomes in human patients (death vs. mild symptoms). In study III, we studied two human viral isolates with different genetic characteristics (one wild type virus and one virus with the H275Y mutation, conferring resistance to Oseltamivir antivirals) in patients who developed the same disease outcome (death). The experimental infection of ferrets with human H1N1 viral isolates was associated with different degrees of lung damage. More severe lung lesions correlated with viral replication in alveolar areas, higher proinflammatory cytokine release in the lungs, and higher lung inflammatory infiltrates, as observed in human patients. Our results revealed that the presence of viral replication in alveolar areas was not only related to viral capacities, but also to the type of host immune response triggered by the infection. In the case of viral strains with similar viral capacities, the development of severe or mild disease depended on the type of immune response triggered by the host. Infected animals showed different pathological outcomes, depending on the type/magnitude of the host immune response, and independently of the viral strain inoculums. On the contrary, in the presence of viral mutations affecting viral growth, pathogenicity was related to viral kinetics. Ferrets infected with the Oseltamivir resistant virus (presenting slower viral kinetics) presented milder pathological lesions, when compared with ferrets infected with the wild type isolate. In both studies, more severe lung lesions correlated with viral replication in alveolar areas and higher expression of the proinflammatory cytokines IL-6, CXCL10, CCL5, CCL3, IL-8, TLR3, and apoptotic markers (BAX and CASP8). These cytokine profiles correlated with the inflammatory phenotype observed in the lungs, characterised by high numbers of macrophages and neutrophils in apoptosis, accompanied by large numbers of cytotoxic T, and NK cells. In contrast, milder lung lesions correlated with viral replication, mainly occurring in bronchiolar areas, and with a higher induction of type I IFN and RIG-I genes, suggesting that IFN induction is beneficial for the host, after IAV infection. From the above mentioned observations, we hypothesized that the different expression of proinflammatory genes, and therefore, the income of leukocytes to the lungs, plays a role in the development of severe pathology after influenza infection. The income of leukocytes into the lungs is mediated through the signalling effects of innate immune molecules, like cytokines and chemokines, induced by different cell types in the lungs. In the study IV, we studied the induction of different innate immune molecules in different lung anatomic compartments (bronchiolar, alveolar and vascular), in response to pandemic H1N1 infection in the ferret model, by means of laser capture microdissection. Our results showed that bronchiolar areas initiate the innate immune response and the first influx of inflammatory cells after viral infection, through the expression of IFNα, IL-6, TNFα and IFNγ. However, TLR3 and CCL2 expression was mainly observed on vascular areas throughout infection, and vascular areas also presented an up-regulated expression of IL-6 and IFNγ, indicating its contribution to the innate immune response during early stages of infection. Interestingly, viral RNA was also detected by real time RT-PCR in vascular areas, but no viral replication by immunohistochemistry was observed. From these results, we hypothesized that vascular areas induce an innate immune response at early stages post infection, through the recognition of viral RNA or a crosstalk with infected cells. The present dissertation highlights the notion that viral replication location and the correct orchestration of the early inflammatory immune response are key factors in the development of severe influenza. We believe that this thesis provides new data which aids in clarifying the role of the host immune response in the divergent pathogenesis observed in pandemic H1N1 infection. Understanding the interactions between both viral genetic characteristics within the host immunogenetic context is of great importance to the development of future therapeutic strategies, against influenza infection.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Fundació Clinic per la Recerca Biomèdica / La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una patología prevenible caracterizada por una limitación al flujo aéreo progresiva y no completamente reversible, disnea, producción de esputo y tos crónica. La obstrucción al flujo aéreo se asocia a un proceso inflamatorio crónico en la vía aérea y el parénquima pulmonar en respuesta a partículas nocivas o gases inhalados, en particular al humo de cigarrillo (HC) (Figura. Esta respuesta inflamatoria crónica puede inducir la destrucción del parénquima pulmonar o enfisema y alteraciones estructurales de la vía aérea pequeña al alterar los mecanismos de reparación y defensa. De esta manera, se produce limitación progresiva al flujo aéreo debido a la menor retracción elástica y aumento de la distensibilidad pulmonar. La inflamación y el estrechamiento de la vía aérea periférica también contribuyen a la limitación del flujo aéreo produciendo una disminución del volumen de aire espirado en el primer segundo de la espiración forzada (FEV1) en la espirometría forzada. Además, alteraciones en las relaciones ventilación-perfusión (VA/Q) pueden dar lugar a hipoxemia e hipercapnia en estos pacientes. Por otro lado, la inflamación inducida por el HC lleva a la hipersecreción mucosa, que también se asocia con el declive del FEV1, debida al mayor número de células caliciformes en la epitelio bronquial y al aumento de las glándulas submucosas, resultando en tos productiva que es característica de la bronquitis crónica, entidad clínica independiente. En el curso evolutivo de la EPOC puede desarrollarse hipertensión pulmonar (HP) debida al remodelado vascular caracterizado por la hiperplasia de la capa íntima y la muscularización de arteriolas (8). Estos cambios se han atribuido a la acción directa del HC sobre el endotelio vascular, a la cual puede añadirse la vasoconstricción pulmonar hipóxica (VPH). Por otro lado, se postula que la perdida de lecho capilar pulmonar debido al enfisema podría contribuir al desarrollo de la HP asociada a la EPOC. También se ha demostrado infiltración por células inflamatorias y disfunción endotelial en las arterias pulmonares de pacientes con EPOC. Por su parte, la HP sostenida puede promover la hipertrofia del ventrículo derecho (VD) y llevar al desarrollo de “cor pulmonale” e insuficiencia cardiaca derecha. Los pacientes con EPOC también presentan comorbilidades a nivel sistémico, incluyendo enfermedades cardiovasculares, disfunción del musculo esquelético, y cáncer de pulmón. Vistos los antecedentes, la presente tesis doctoral se plantea en base a las siguientes hipótesis: 1. El modelo experimental de EPOC por exposición al HC en cobayos reproduce la destrucción del parénquima y las alteraciones en la vía aérea y vasos pulmonares características de la EPOC, en los que diferentes mediadores químicos y células inflamatorias tendrían un papel fisiopatológico destacable. Por este motivo, hipotetizamos que la exposición crónica al HC producirá en cobayos un proceso inflamatorio asociado con cambios morfológicos y funciónales en las estructuras pulmonares similares a lo que se observa en los pacientes con EPOC. 2. La adecuada caracterización del modelo experimental de EPOC en cobayos permitiría su uso en la evaluación de los efectos de nuevos fármacos y dianas terapéuticas en el tratamiento de la EPOC. En este sentido, se evalúan los efectos de bromuro de aclidinio, un antagonista muscarínico de acción prolongada, y sildenafilo, un inhibidor selectivo de la PDE5. Teniendo en cuenta todo ello, los objetivos que se plantearon en los tres artículos que conforman esta tesis doctoral fueron: 1.- Primer artículo. “Pulmonary inflammatory reaction and structural changes induced by cigarette smoke exposure in the Guinea pig.” A) Objetivo general: Evaluar la naturaleza y características de la reacción inflamatoria en el pulmón, y su implicación en los cambios estructurales que tienen lugar a nivel pulmonar en el modelo experimental de EPOC en cobayos expuestos crónicamente al HC. B) Objetivos concretos: I. Caracterizar el tipo de células inflamatorias y su distribución en las estructuras pulmonares (vía aérea, vasos y parénquima). II. Analizar el remodelado de la vía aérea y de los vasos pulmonares. III. Evaluar la presencia de fibrosis y la aparición de enfisema en el parénquima. IV. Explorar los mecanismos que interconectan la infiltración de células inflamatorias con las alteraciones estructurales características de la EPOC. V. Establecer la importancia, el orden secuencial y la dinámica de estas alteraciones en el desarrollo de la EPOC. 2.- Segundo artículo. “Effects of Aclidinium Bromide in a Cigarette Smoke-Exposed Guinea Pig Model of Chronic Obstructive Pulmonary Disease”. A) Objetivo general. Investigar los efectos del broncodilatador bromuro de aclidinio sobre los cambios histopatológicos y el infiltrado de células inflamatorias en los pulmones del modelo de EPOC en cobayos crónicamente expuestos al HC. B) Objetivos concretos. I. Evaluar el efecto de aclidinio sobre las alteraciones morfológicas, como potencial agente antirremodelado de la vía aérea. II. Evaluar el efecto de aclidinio sobre la infiltración de células inflamatorias en las estructuras pulmonares, como potencial agente antiinflamatorio. III. Evaluar el efecto de aclidinio sobre la función pulmonar y los signos respiratorios característicos de la EPOC, particularmente su efecto broncodilatador. IV. Evaluar el efecto de aclidinio sobre otras alteraciones típicas de la EPOC como la metaplasia de células caliciformes y el desarrollo de enfisema pulmonar. V. Explorar posibles mecanismos que interconectan los diferentes cambios observados con la administración de aclidinio. 3.- Tercer artículo. “Sildenafil in a cigarette smoke-induced model of COPD in the guinea pig”. A) Objetivo general. Evaluar los efectos del vasodilatador sildenáfilo sobre la hemodinámica pulmonar, función endotelial, y el remodelado vascular y del parénquima, en el modelo de EPOC en cobayos crónicamente expuestos al HC. B) Objetivos concretos. I. Evaluar el efecto de sildenafilo sobre la hemodinámica pulmonar, como agente vasodilatador de la circulación pulmonar. II. Evaluar el efecto de sildenafilo sobre la hipertrofia del VD y la función endotelial de arterias pulmonares. III. Evaluar el efecto de sildenafilo sobre las alteraciones morfológicas y el remodelado vascular pulmonar, como potencial agente antiproliferativo. IV. Evaluar el efecto de sildenafilo sobre el funcionalismo respiratorio. V. Integrar posibles mecanismos que expliquen los cambios producidos con la administración de sildenafilo.

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Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una pneumònia intersticial de causa desconeguda i de mal pronòstic, amb una supervivència mitjana de 2 a 5 anys des del moment del diagnòstic. La hipòtesi fisiopatològica més acceptada en l’actualitat és que una lesió reiterada a l’epiteli alveolar causaria l’apoptosi massiva de les cèl·lules epitelials, l’alliberament de factors solubles pro-fibròtics com el TGF-β1 i el descens de la producció de factors anti-fibròtics com la prostaglandina E2 (PGE2). En aquestes circumstàncies s’induiria la formació de focus fibroblàstics, formats per fibroblastes, miofibroblastes i matriu extracel·lular excessiva. La PGE2 prové de la via de l’àcid araquidònic a través dels enzims ciclooxigenasa (COX). La COX-2 és induïble per estímuls pro-inflamatoris com la interleuquina-1b (IL-1b). En primer lloc, vam obtenir un cultiu enriquit de miofibroblastes in vitro tractant fibroblastes primaris de pulmó humà control i amb FPI amb TGF-b1 durant 72h. En aquestes condicions es va induir la transició fibroblast a miofibroblast i també la transició epiteli-mesenquimal (EMT) en cèl·lules de la línia A549. Els cultius de miofibroblastes van presentar un increment en l’expressió d’alfa actina del múscul llis (α-SMA), proteïna característica d’aquest fenotip, i en la síntesi de col·lagen. Analitzant la capacitat de migració i proliferació d’aquestes cèl·lules realitzant una ferida al cultiu in vitro, vam observar que els cultius de miofibroblastes procedents de pacients amb FPI presentaven una capacitat invasiva superior als controls. Aquesta no era deguda a la proliferació, ja que la seva inhibició no comportava diferències. La proliferació dels miofibroblastes era baixa tant en cultius control com en FPI. Vam avaluar la capacitat de tancament d’una ferida in vitro per par d’aquestes cèl·lules i vam observar que els fibroblastes són el fenotip principal encarregat del tancament d’una ferida in vitro i que la proliferació és una component important en aquest tancament. Vam analitzar l’expressió de α-SMA, COX-2 i secreció de PGE2 en cultius control i FPI i en cultius enriquits de miofibroblastes. Els cultius FPI van presentar una major expressió d’α-SMA respecte els controls i alhora una menor capacitat d’inducció de l’expressió de COX-2 per part d’IL-1β. En els cultius enriquits de miofibroblastes, aquest efecte va ser encara més marcat, fins al punt de no haver-hi coincidència entre l’expressió de COX-2 i la d’α-SMA. La deficiència en la inducció de COX-2 va implicar una disminució de l’expressió de PGE2. Tot plegat va afectar a la capacitat de migració i proliferació d’aquestes cèl·lules. Els mateixos resultats es van observar en el fenotip tipus-miofibroblast procedent de la EMT de les cèl·lules epitelials A549. En tincions immunohistoquímiques de teixit normal i de FPI no vam observar coincidència entre el marcatge de COX-2 i d’α-SMA en els focus fibroblàstics. Així doncs, els resultats observats in vitro es corroborarien in vivo. Finalment, vam analitzar l’expressió del receptor d’interleuquina-1 tipus 1 (IL-R1) com a possible causa de la deficient inducció de COX-2 en aquestes cèl·lules. IL-1RI és el receptor específic pel qual la IL-1β realitza les seves accions pro-inflamatòries. Els fibroblastes FPI van presentar una menor expressió basal de IL-1RI en comparació amb els control. La IL-1β va ser capaç d’induir l’expressió del seu propi receptor. En miofibroblastes en canvi, el TGF-β va inhibir-ne l’expressió i va eliminar la capacitat d’inducció per part de la IL-1β. Així doncs, en un ambient pro-fibròtic, el TGF-β induiria de manera permanent la transició de fibroblastes i cèl·lules epitelials del pulmó cap a miofibroblastes. El fenotip miofibroblast estaria associat a una deficiència del receptor IL-1RI que impediria a la IL-1β induir l’expressió de COX-2 i la secreció de PGE2. La baixa PGE2 afavoriria la migració i proliferació d’aquestes cèl·lules i per tant la progressió de la fibrosi pulmonar. Aquest pot ser un mecanisme destacat en el manteniment de la FPI i presenta una possible diana terapèutica per aturar i arribar a reverir el procés fibròtic. / Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an interstitial lung disease with bad prognosis and mean survival from 2 to 5 years from the diagnosis. The most accepted hypothesis of its cause is that a repeated epithelial lung damage would cause epithelial cells apoptosis and the release of pro-fibrotic factors, like TGF-b1 and the diminishing of anti-fibrotic factors, like prostaglandin E2 (PGE2). In this profibrotic environment fibroblast foci are formed by fibroblasts, myofibroblasts and extracellular matrix deposits. PGE2 is synthesized via cyclooxygenase enzimes, COX-1 and COX-2. COX-2 is inducible by several pro-inflammatory stimuli, for example IL-1b. We obtained an enriched myofibroblast culture treating primary fibroblasts obtained from control and IPF lung tissue with TGF-b1 during 3 days. This treatment induced an upregulation of aSMA expression, a myofibroblast associated protein, and collagen synthesis. It also induced epithelial to mesenchymal transition (EMT) in A549 epithelial lung cell line. Myofibroblasts obtained from FPI cultures showed increased migratory capacity in comparison with control ones. Proliferation associated with this phenotype was very low. We also measured the closure of an in vitro wound by these cell types and we observed that fibroblasts are actually the most important phenotype associated to wound healing, and not myofibroblasts. Moreover, we analized aSMA and COX-2 expression and PGE2 secretion in those cells. IPF cultures showed increased aSMA levels but decreased COX-2 induced expression by IL-1b. Myofibroblast enriched cultures also showed these features, also associated to a suppressed PGE2 secretion. Both in cell cultures and in tissue inmunohisochemistry no coincidence was observed between aSMA and COX-2 positive cells, associating myofibroblasts to an altered COX-2 and PGE2 metabolism. A549-derived myofibroblasts shared the ssame alterations. We analyzed IL-1 specific receptor IL-1RI in order to stablish if it was an stimuli-dependent alteration, and we observed that both IPF and myofibroblasts showed diminished IL-1R expression. IL-1b failed to upregulate its own receptor expression specifically in myofibroblasts. In the profibrotic environment, miofibroblast transition is chronically induced by TGF-b. Moreover this phenotype is associated to a downregulated IL-1RI expression and therefore IL-1b is uncapable of inducing COX-2 expression and PGE2 secretion, worsening migratory and proliferative features of these cells and contributing to fibrotic progression.