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Resposta ao estresse ácido em leveduras da fermentação alcoólica industrialMELO, Hélio Fernandes de January 2006 (has links)
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Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O processo de fermentação alcoólica industrial é caracterizado por um intenso
reciclo das células de leveduras, com constante exposição a baixos valores de pH tanto
no mosto quanto no pré-fermentador. Isto induz um constante estresse ácido que leva a
diminuição da viabilidade celular no processo. Este trabalho tem como objetivo o
estudo dos fatores celulares responsáveis pela resistência ao estresse ácido a partir da
identificação dos genes de Saccharomyces cerevisiae que respondem a este estresse e do
isolamento e caracterização de mutantes resistentes a ácidos inorgânicos. Inicialmente a
linhagem JP1 foi isolada do mosto de fermentação pela sua capacidade de dominância
no processo fermentativo de diferentes destilarias. Esta linhagem apresentou a mesma
resposta fenotípica às diferentes formas de estresse industrial (ácido e etanólico) que a
linhagem comercial PE-2. As células da linhagem JP-1 foram posteriormente testadas
para o crescimento celular e desempenho fermentativo em meio mineral acidificado e os
resultados mostraram o baixo pH do meio não influenciou estes dois parâmetros.
Adicionalmente, cerca de 1% dos genes da linhagem de laboratório JT-95 de S.
cerevisiae apresentou modificação no padrão de expressão, sendo 35 genes reprimidos e
28 genes induzidos pelo ácido sulfúrico. Entretanto, não se observou uma relação direta
entre o conjunto de genes modificados e os mecanismos conhecidos de resposta a
estresse, o que sugere uma resposta multifatorial ao choque ácido em leveduras. E
finalmente um mutante resistente a ácidos inorgânicos (sulfúrico e clorídrico) foi
isolado a partir de células da linhagem JP-1. Este mutante foi capaz de crescer em meio
ajustado para pH 2, mas semelhante ao parental não apresentou resistência a ácidos
orgânicos (sorbato). Isto mostra que a resistência a estes dois tipos de ácidos deve ser
mediada por mecanismos celulares diferentes. A análise de expressão gênica neste
mutante deverá gerar informações mais precisas sobre este mecanismo de resistência
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Identifica??o de genes em Chromobacterium violaceum relacionados ? resposta ao estresseFontinele, Delanne Cristina Souza de Sena 08 September 2011 (has links)
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DelanneCSSF_TESE.pdf: 5733269 bytes, checksum: db8ba3b543c1bd1c178d56cb6e6335bb (MD5)
Previous issue date: 2011-09-08 / The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single
circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs
are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of
biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental
detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this
work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones
involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For
this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B
(RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates
clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two
ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation
activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from
C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the
operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress
response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment
with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III
? subunit). In this way, we propose that the C. violaceum ? subunit can act in DH10B
in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In
growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were
able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays
PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant
differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are
involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be
interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP)
and/or global regulatory molecule (eg., ?S subunit of RNA polymerase).The results
obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response
mechanisms to environmental stress. / O seq?enciamento do genoma da esp?cie Chromobacterium violaceum identificou
um cromossomo simples circular de 4.8 Mb, no qual aproximadamente 40% das
ORFs encontradas s?o classificadas como hipot?ticas conservadas ou hipot?ticas.
Algumas regi?es g?nicas de interesse biotecnol?gico e biol?gico v?m sendo
caracterizadas, como por exemplo, genes de detoxifica??o ambiental e genes de
reparo de DNA, respectivamente. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi
identificar genes de C. violaceum envolvidos com a resposta ao estresse, como por
exemplo, mecanismos de reparo de DNA e/ou manuten??o da integridade
gen?mica. Para tanto, foi constru?da uma biblioteca gen?mica de C. violaceum na
cepa DH10B de Escherichia coli (RecA-), a qual foi testada para clones resistentes a
UVC, resultando na sele??o de cinco clones candidatos. Foram identificadas quatro
ORFs (CV_3721 a 3724) no clone PLH6A. Das quais, as ORFs CV_3722 e
CV_3724, foram subclonadas e uma atividade sin?rgica de complementa??o foi
observada. A ocorr?ncia de um operon foi confirmada usando cDNA de C. violaceum
em ensaio de RT-PCR. Adicionalmente, foi observada a indu??o do operon ap?s
tratamento com UVC, dessa forma, esse operon foi relacionado ? resposta ao
estresse em C. violaceum. Ensaios de mutag?nese com rifampicina ap?s tratamento
com luz UVC mostraram alta freq??ncia de mutagenicidade para a ORF CV_3722,
subunidade ? da Polimerase III. Assim, propomos que esta subunidade de C.
violaceum pode agir em DH10B na s?ntese transles?o utilizando Pol IV em uma via
RecA independente. Em ensaios de viabilidade outros quatro clones (PLE1G,
PLE7B, PLE10B e PLE12H) foram capazes de complementar a fun??o na dose de 5
J/m2. E em ensaios de mutagenicidade PLE7B, PLE10B e PLE12H apresentaram
freq??ncias de muta??o com diferen?as significativas em rela??o ao controle
(DH10B), demonstrando que de alguma forma eles est?o envolvidos na resposta ao
estresse em C. violaceum. Estes clones parecem estar inter-relacionados,
provavelmente, regulados por mol?cula mensageira (como o nucleot?deo c-di-GMP)
e/ou mol?cula regulat?ria global (como a subunidade ?S da RNA Polimerase). Os
resultados obtidos contribuem para um melhor conhecimento da gen?tica desta
esp?cie e de seus mecanismos de resposta ao estresse ambiental. / 2020-01-01
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Expressão de clpB em resposta a estresse causado por choque térmico e antibióticos em Acinetobacter baumannii / clpB expression in response to stress caused by heat shock and antibiotics in Acinetobacter baumanniiLazaretti, Waleska Yana 08 March 2018 (has links)
Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-25T12:11:00Z
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Previous issue date: 2018-03-08 / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) is an important opportunistic, Gram-negative
pathogen responsible for severe nosocomial infections such as pneumonia,
septicemia, urinary tract infections and meningitis. Strains of A. baumannii have been
identified in an endemic and epidemic manner in hospitals, being verified the
occurrence of multiresistant strains in these environments, with important ability to
adapt to selective changes and environmental pressures. Furthermore, multidrug
resistance to antibiotics has been continuously studied because it is a global public
health problem, resulting in failure of therapy, prolongation of hospitalization,
increase of mortality and morbidity rates, and increase in the financial costs of
treatment. This pathogen has varied strategies involved with antimicrobial resistance,
but it is known that the bacteria are able to respond to unfavorable conditions in the
medium through the rapid expression of heat shock proteins (HSP) and also appear
to be involved with the stress response caused by the presence of antibiotics. Among
the HSPs is ClpB, an ATP-dependent molecular chaperone belonging to the HSP100
family that is associated with several cellular activities, with the remarkable ability to
rescue proteins damaged by stress. The objective of this work was to investigate the
role of the clpB gene responsible for the coding of a heat shock protein through
qPCR in response to stress generated by thermal shock and antibiotics in cells of a
multidrug resistant strain of A. baumannii (RS4). Tests performed included analysis
of the structure of the clpB gene with bioinformatics tools and analysis of the
expression of the same gene by qRT-PCR in response to exposure to heat shock
and subinhibitory concentrations of the following antibiotics: ampicillin (30 g mL-1 ),
amoxicillin + sulbactam (12 g mL-1), cefepime (30 g mL-1), sulfamethoxazole +
trimethoprim (120/8 g mL-1) and meropenem (18 g mL-1).The analysis of the qPCR
results showed a transient increase in the induction of the clpB gene in the different
treatments used in this study and repression of mRNA-clpB in the presence of
cefepime. In addition, in the presence of ampicillin and amoxicillin associated with
sulbactam the increase in mRNA-clpB synthesis was around 1.4 times higher after 20
min of incubation with the antibiotics than in the complete absence of the antibiotics.
Surprisingly, in the presence of meropenen the induction of mRNA-clpB expression
was more than 30-fold higher after 10 minutes of incubation with the antibiotic and
more than 8-fold higher in the presence of sulfamethoxazole associated with
trimetropin. These data suggest that A. baumannii through thermal stress and
antibiotic exposure, adjusts transcription levels of gene clpB allowing the bacterium to
survive unfavorable conditions of the medium. Consequently, it can be stated that the
protein encoded by the clpB gene is an important virulence factor in response to
antibiotics in this pathogen. / Acinetobacter baumannii (A. baumannii) é um importante patógeno oportunista,
Gram-negativo e responsável por infecções nosocomiais severas como pneumonias,
septicemias, infecções urinárias e meningites. Cepas de A. baumannii têm sido
identificadas de maneira endêmica e epidêmica nos hospitais, sendo verificada a
ocorrência de cepas multirresistentes nesses ambientes, com importante habilidade
de adaptação a mudanças seletivas e pressões ambientais. Ainda, a
multirresistência a antibióticos vem sendo estudada continuamente, por se tratar de
um problema de saúde pública global, resultando em falha na terapia, no
prolongamento da internação hospitalar, no aumento das taxas de mortalidade e
morbidade e na elevação dos custos financeiros do tratamento. Esse patógeno
possui estratégias variadas envolvidas com a resistência aos antimicrobianos,
porém, sabe-se que as bactérias apresentam habilidade de responder a condições
desfavoráveis do meio em que se encontram por meio da rápida expressão de
proteínas de choque térmico (HSP) e parecem também estar envolvidas com a
resposta a estresse causado pela presença de antibióticos. Dentre as HSPs, está a
ClpB, chaperone molecular dependente de ATP, pertencente à família HSP100 que
está associada a diversas atividades celulares, com a capacidade notável para
resgatar proteínas danificadas pelo estresse. O objetivo deste trabalho foi investigar
o papel do gene clpB em resposta a estresse gerado por choque térmico e
antibióticos em células de uma cepa multirresistente de A. baumannii (RS4). Os
testes realizados englobaram análise da estrutura do gene clpB com ferramentas de
bioinformática e análise da expressão do mesmo gene por qRT-PCR em resposta à
exposição a choque térmico e a concentrações subinibitórias dos seguintes
antibióticos: ampicilina (30 g mL-1), amoxacilina+ sulbactam (12 g mL-1), cefepime
(30 g mL-1), sulfametoxazol + trimetoprima (120/8 g/mL-1) e meropenem (18 g
mL-1). Os resultados apontados por análise de bioinformática sugerem uma
conservação da estrutura global de ClpB dentro do gênero Acinetobacter sp. A
análise dos resultados de qPCR evidenciou aumento transitório na indução do gene
clpB nos diferentes tratamentos utilizados neste estudo e repressão do mRNA-clpB
na presença de cefepime. Em adição, tanto na presença de ampicilina como de
amoxicilina associada à sulbactam o aumento na síntese de mRNA-clpB foi em torno
de 1,4 vezes superior após 20 min de incubação com os antibióticos do que na
completa ausência dos antibióticos. Surpreendentemente, na presença de
meropenen, a indução da expressão do mRNA-clpB foi mais que 30 vezes superior
após 10 minutos de incubação com o antibiótico e mais que 8 vezes superior na
presença de sulfametoxaxol associado à trimetropina. Esses dados sugerem que A.
baumannii, mediante estresse térmico e exposição a antibióticos, ajusta os níveis de
transcrição do gene clpB, permitindo que a bactéria sobreviva a condições
desfavoráveis do meio. Consequentemente, pode-se afirmar que a proteína
codificada pelo gene clpB figura como importante fator de virulência em resposta a
antibióticos neste patógeno.
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Perfis de Expressão Gênica e Possíveis Interações entre microRNAs e mRNAs em Diabetes Mellitus Tipo 1 com Enfoque em Resposta ao Estresse Oxidativo e Reparo do DNA / Gene Expression Profiles and Possible Interactions between microRNAs and mRNAs in Type 1 Diabetes Mellitus, Focusing on Response to Oxidative Stress and DNA RepairTakahashi, Paula 23 March 2015 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) resulta de um ataque autoimune contra as células pancreáticas, extinguindo a produção de insulina e levando à hiperglicemia. Evidências indicam uma associação entre o estresse oxidativo (que pode causar danos no DNA) e o DM1, sendo que apenas alguns trabalhos da literatura relataram a expressão de genes relacionados à respostas ao estresse oxidativo e reparo do DNA em DM1. Ainda, os microRNAs (reguladores pós-transcricionais da expressão gênica) estão envolvidos em vários processos biológicos e condições patológicas, mas informação sobre a expressão dos microRNAs em DM1 ainda é escassa. A fim de proporcionar um melhor entendimento sobre as vias de regulação de genes participantes de processos biológicos relevantes para o DM1, o presente estudo consistiu em analisar os perfis de expressão gênica (método de microarranjos) de microRNAs e de mRNAs (bem como de algumas proteínas) provenientes de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês peripheral blood mononuclear cells) de pacientes DM1 (n=19) em comparação com indivíduos sadios não diabéticos (n=11), dando maior enfoque a genes associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA. Os resultados de expressão obtidos pelo método de microarranjos apontaram 44 microRNAs diferencialmente expressos (35 induzidos e nove reprimidos) nos pacientes DM1 e esses microRNAs apresentaram grande especificidade ao estratificar pacientes DM1 dos controles, incluindo hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b e hsa-miR-424, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. A análise funcional dos genes-alvo dos microRNAs, tanto dos induzidos quanto dos reprimidos, apontou 22 e 12 vias KEGG significativamente enriquecidas, respectivamente, incluindo vias relacionadas ao câncer. Com relação à análise de expressão de mRNAS, 277 genes diferencialmente expressos foram identificados nos pacientes DM1, sendo que 52% deles são potenciais alvos dos microRNAs diferencialmente expressos nos pacientes DM1. Dentre esses alvos foram encontrados genes candidatos ao desenvolvimento da doença, assim como genes implicados nos processos biológicos resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, como UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 e TNFAIP3, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. Já a análise de grupos gênicos identificou 49 e 55 grupos gênicos significativamente expressos e enriquecidos em pacientes DM1, respectivamente, destacando-se vias relacionadas à sinalização apoptótica, resposta ao hidroperóxido, reparo do DNA por recombinação homóloga e resposta ao estresse do retículo endoplasmático. Quanto aos dados de expressão proteica (western blotting), PTGS2 e ATF3 não apresentaram níveis de expressão detectáveis em nenhum dos dois grupos estudados, enquanto que para DUSP1 não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, apesar de os três genes se apresentarem induzidos em pacientes DM1. Os resultados do ensaio do gene repórter da luciferase demonstraram a ocorrência da interação entre hsa-miR-148a e DUSP1 em meio celular. Essa evidência aliada aos dados de western blotting, sugerem a possibilidade de hsa-miR-148a atuar na repressão traducional de DUSP1. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram perfis distintos de expressão de microRNAs e mRNAs em PBMCs de pacientes DM1 comparados a indivíduos sadios, sendo que adicionalmente, dados inéditos relacionados à interação microRNAs-mRNAs em DM1 foram obtidos, principalmente associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, sugerindo um distúrbio na rede microRNA-alvo em pacientes DM1. / Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) results from an autoimmune attack against the pancreatic cells, ceasing insulin production, which causes hyperglycemia. Although associations between oxidative stress, which can cause DNA damage, and T1DM have been demonstrated, only a few studies have reported differential expression of genes associated with response to oxidative stress and DNA repair in T1DM patients. Moreover, microRNAs (post-transcriptional regulators of gene expression) are implicated in many biological processes and pathological conditions; however, only scarce information is available in the literature concerning the expression of microRNAs in T1DM. In order to better understand the regulatory pathways involved in biological processes that are relevant to T1DM, we aimed to investigate the microRNA and mRNA transcriptional expression profiles by microarray analysis (as well as expression of selected proteins) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from T1DM patients (n=19) compared with healthy non-diabetic individuals (n=11), emphasizing genes related to response to oxidative stress and DNA repair. Microarray expression results indicated 44 differentially expressed microRNAs (35 up- and nine down-regulated) in T1DM patients, with those microRNAs possessing a discriminatory power to clearly stratify the patients from the controls, including hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b, and hsa-miR-424, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Functional annotation analysis performed on the predicted targets of the differentially expressed microRNAs pointed 22 and 12 annotated KEGG pathways for the overexpressed and repressed microRNAs, respectively, many of them related to cancer. Regarding mRNA microarray results, we detected 277 differentially expressed genes in T1DM patients, with 52% of them being potential targets of the differentially expressed microRNAs in T1DM patients. Among these targets, we identified candidate genes for T1DM as well as genes involved in the biological processes response to oxidative stress and DNA repair, such as UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 and TNFAIP3, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Furthermore, out of the 49 and 55 significantly expressed/enriched gene sets in T1DM patients, respectively, five pathways related to apoptotic signaling, response to hydroperoxide, DNA repair via homologous recombination, and response to endoplasmic reticulum stress were of interest for the present work. Concerning protein expression results (western blotting), PTGS2 and ATF3 expression was not detected for either the patient or the control group, while significant difference in DUSP1 expression was not observed between the two groups, although the corresponding mRNAs of those genes were found induced. Regarding the luciferase assay, our results demonstrated that the interaction between hsa-miR-148a and DUSP1 occurs in the cellular milieu. Therefore, these findings together with those western blotting results suggest that hsa-miR-148a could play a role in DUSP1 translational repression. Altogether, our results indicate distinctive microRNA and mRNA expression profiles in PBMCs from T1DM patients relative to healthy non-diabetic individuals. Furthermore, we have provided novel data regarding microRNA-mRNA interactions in T1DM, in particular involving genes associated with response to oxidative stress and DNA repair, suggesting a perturbation in the microRNA-target network in T1DM patients.
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Perfis de Expressão Gênica e Possíveis Interações entre microRNAs e mRNAs em Diabetes Mellitus Tipo 1 com Enfoque em Resposta ao Estresse Oxidativo e Reparo do DNA / Gene Expression Profiles and Possible Interactions between microRNAs and mRNAs in Type 1 Diabetes Mellitus, Focusing on Response to Oxidative Stress and DNA RepairPaula Takahashi 23 March 2015 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) resulta de um ataque autoimune contra as células pancreáticas, extinguindo a produção de insulina e levando à hiperglicemia. Evidências indicam uma associação entre o estresse oxidativo (que pode causar danos no DNA) e o DM1, sendo que apenas alguns trabalhos da literatura relataram a expressão de genes relacionados à respostas ao estresse oxidativo e reparo do DNA em DM1. Ainda, os microRNAs (reguladores pós-transcricionais da expressão gênica) estão envolvidos em vários processos biológicos e condições patológicas, mas informação sobre a expressão dos microRNAs em DM1 ainda é escassa. A fim de proporcionar um melhor entendimento sobre as vias de regulação de genes participantes de processos biológicos relevantes para o DM1, o presente estudo consistiu em analisar os perfis de expressão gênica (método de microarranjos) de microRNAs e de mRNAs (bem como de algumas proteínas) provenientes de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês peripheral blood mononuclear cells) de pacientes DM1 (n=19) em comparação com indivíduos sadios não diabéticos (n=11), dando maior enfoque a genes associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA. Os resultados de expressão obtidos pelo método de microarranjos apontaram 44 microRNAs diferencialmente expressos (35 induzidos e nove reprimidos) nos pacientes DM1 e esses microRNAs apresentaram grande especificidade ao estratificar pacientes DM1 dos controles, incluindo hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b e hsa-miR-424, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. A análise funcional dos genes-alvo dos microRNAs, tanto dos induzidos quanto dos reprimidos, apontou 22 e 12 vias KEGG significativamente enriquecidas, respectivamente, incluindo vias relacionadas ao câncer. Com relação à análise de expressão de mRNAS, 277 genes diferencialmente expressos foram identificados nos pacientes DM1, sendo que 52% deles são potenciais alvos dos microRNAs diferencialmente expressos nos pacientes DM1. Dentre esses alvos foram encontrados genes candidatos ao desenvolvimento da doença, assim como genes implicados nos processos biológicos resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, como UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 e TNFAIP3, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. Já a análise de grupos gênicos identificou 49 e 55 grupos gênicos significativamente expressos e enriquecidos em pacientes DM1, respectivamente, destacando-se vias relacionadas à sinalização apoptótica, resposta ao hidroperóxido, reparo do DNA por recombinação homóloga e resposta ao estresse do retículo endoplasmático. Quanto aos dados de expressão proteica (western blotting), PTGS2 e ATF3 não apresentaram níveis de expressão detectáveis em nenhum dos dois grupos estudados, enquanto que para DUSP1 não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, apesar de os três genes se apresentarem induzidos em pacientes DM1. Os resultados do ensaio do gene repórter da luciferase demonstraram a ocorrência da interação entre hsa-miR-148a e DUSP1 em meio celular. Essa evidência aliada aos dados de western blotting, sugerem a possibilidade de hsa-miR-148a atuar na repressão traducional de DUSP1. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram perfis distintos de expressão de microRNAs e mRNAs em PBMCs de pacientes DM1 comparados a indivíduos sadios, sendo que adicionalmente, dados inéditos relacionados à interação microRNAs-mRNAs em DM1 foram obtidos, principalmente associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, sugerindo um distúrbio na rede microRNA-alvo em pacientes DM1. / Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) results from an autoimmune attack against the pancreatic cells, ceasing insulin production, which causes hyperglycemia. Although associations between oxidative stress, which can cause DNA damage, and T1DM have been demonstrated, only a few studies have reported differential expression of genes associated with response to oxidative stress and DNA repair in T1DM patients. Moreover, microRNAs (post-transcriptional regulators of gene expression) are implicated in many biological processes and pathological conditions; however, only scarce information is available in the literature concerning the expression of microRNAs in T1DM. In order to better understand the regulatory pathways involved in biological processes that are relevant to T1DM, we aimed to investigate the microRNA and mRNA transcriptional expression profiles by microarray analysis (as well as expression of selected proteins) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from T1DM patients (n=19) compared with healthy non-diabetic individuals (n=11), emphasizing genes related to response to oxidative stress and DNA repair. Microarray expression results indicated 44 differentially expressed microRNAs (35 up- and nine down-regulated) in T1DM patients, with those microRNAs possessing a discriminatory power to clearly stratify the patients from the controls, including hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b, and hsa-miR-424, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Functional annotation analysis performed on the predicted targets of the differentially expressed microRNAs pointed 22 and 12 annotated KEGG pathways for the overexpressed and repressed microRNAs, respectively, many of them related to cancer. Regarding mRNA microarray results, we detected 277 differentially expressed genes in T1DM patients, with 52% of them being potential targets of the differentially expressed microRNAs in T1DM patients. Among these targets, we identified candidate genes for T1DM as well as genes involved in the biological processes response to oxidative stress and DNA repair, such as UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 and TNFAIP3, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Furthermore, out of the 49 and 55 significantly expressed/enriched gene sets in T1DM patients, respectively, five pathways related to apoptotic signaling, response to hydroperoxide, DNA repair via homologous recombination, and response to endoplasmic reticulum stress were of interest for the present work. Concerning protein expression results (western blotting), PTGS2 and ATF3 expression was not detected for either the patient or the control group, while significant difference in DUSP1 expression was not observed between the two groups, although the corresponding mRNAs of those genes were found induced. Regarding the luciferase assay, our results demonstrated that the interaction between hsa-miR-148a and DUSP1 occurs in the cellular milieu. Therefore, these findings together with those western blotting results suggest that hsa-miR-148a could play a role in DUSP1 translational repression. Altogether, our results indicate distinctive microRNA and mRNA expression profiles in PBMCs from T1DM patients relative to healthy non-diabetic individuals. Furthermore, we have provided novel data regarding microRNA-mRNA interactions in T1DM, in particular involving genes associated with response to oxidative stress and DNA repair, suggesting a perturbation in the microRNA-target network in T1DM patients.
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ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS PARA PEIXES: ASPECTOS BIOQUÍMICOS E MOLECULARES / ESSENTIAL OILS AS ANESTHETICS FOR FISH: BIOCHEMICAL AND MOLECULAR ASPECTSToni, Cândida 15 January 2015 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The essential oil (EOs) extracted from plants Hesperozygis ringens and Lippia alba possess
anesthetic and sedative properties and is an alternative to traditional anesthetics used in
aquaculture for ease of handling and/or reduce stress. In this sense, the study aimed to
investigate the effects of these EOs on the physiology of fish, through physiological, biochemical
and endocrine indicators. In the article 1 was determined (a) the anesthetic activity of the EOs of
H. ringens (EOHR) and L. alba (EOLA) and (b) its effects on silver catfish (Rhamdia quelen) after
induction and recovery from anesthesia. Fish were subjected to one of the following treatments
for each EO: basal group, control or anesthetized (150, 300 or 450 uL L-1 EO), evaluating the
ventilatory rate (VR) during the induction period and thereafter transferred to anesthetics-free
tanks for recovery from anesthesia. At 0, 15, 30, 60 and 240 min of recovery, samples of plasma
and gills were collected to measure metabolic indicators and ionregulatory enzymes, respectively.
In the article 2, the effects of prolonged exposure to low EOHR concentrations were studied on
silver catfish. After 6 h of exposure to 0 (control), 30 or 50 uL L-1 EOHR added to water, it was
analyzed: VR, metabolic indicators of stress in plasma, enzyme activity in liver, and expression of
pituitary hormones (growth hormone - GH, prolactin - PRL and somatolactina - SL). In the
manuscript, (a) evaluated the effectiveness of anesthesia EOLA on gilthead sea bream (Sparus
aurata) and (b) we investigated the effects of 35 uL L-1 EOLA and 2-phenoxyethanol (2-PHE) on
the stress response in gilthead sea bream undergoing persecution. After 4 h of exposure, the
plasma was sampled (for the determination of cortisol, metabolites and osmolality), brain and
pituitary (to evaluate the expression of endocrine indicators). In the article 1, anesthesia with EOs
caused changes in some parameters measured in silver catfish, but did not prevent the
restoration of most of the indicators assessed after 240 min of recovery. In the article 2, 50 uL L-1
EOHR led to an increase of glucose, lactate, protein and osmolality, as well as an increase in
metabolic enzyme activity and reduced expression of GH and SL. In the manuscript, gilthead sea
bream exposed to EOLA, stressed or not, exhibited higher levels of cortisol, glucose, lactate and
osmolality. EOLA exposure added to the stress reduced the expression levels of CRH-BP
(corticotropin releasing hormone bound to protein). PRL expression was reduced in the stressed
control group and after exposure to EOLA and 2-PHE in fish not stressed. Higher expression of
pro-opiomelanocortin (POMC) "a" and "b" were observed in fish stressed and exposed to EOLA
and 2-PHE, respectively. We conclude that: (1) the EOLA is more efficient for silver catfish that
EOHR in anesthesia concentrations; (2) for sedating the fish, it is recommended 30 uL EOHR L-1
(or less); (3) the EOLA was effective as an anesthetic for gilthead sea bream at 100-300 uL L-1,
but for 4 h exposure, the 2-PHE was more effective in preventing the stress response. / Os óleos essenciais (OEs) extraídos das plantas Hesperozygis ringens e Lippia alba possuem
propriedades anestésica e sedativa, constituindo uma alternativa aos anestésicos
tradicionalmente usados em aquicultura para facilitar o manejo e/ou reduzir o estresse. Neste
sentido, o estudo teve por objetivo investigar os efeitos desses OEs sobre a fisiologia de peixes,
através de indicadores fisiológicos, bioquímicos e endócrinos. No artigo 1 determinou-se (a) a
atividade anestésica dos OEs de H. ringens (OEHR) e L. alba (OELA) e (b) seus efeitos em
jundiá (Rhamdia quelen) depois da indução e recuperação da anestesia. Os peixes foram
submetidos a um dos seguintes tratamentos para cada OE: grupo basal, controle ou anestesiado
(150, 300 ou 450 μL L-1 OE), avaliando-se a taxa ventilatória (TV) durante o período de indução
e, posteriormente, transferidos para aquários sem anestésicos para recuperação da anestesia.
Nos tempos 0, 15, 30, 60 e 240 min de recuperação foram realizadas amostragens de plasma e
brânquias para medir indicadores metabólicos e enzimas ionorregulatórias, respectivamente. No
artigo 2, os efeitos da exposição prolongada de jundiás a baixas concentrações do OEHR foram
estudados. Após 6 h de exposição a 0 (controle), 30 ou 50 μL L-1 OEHR adicionado à água,
analisou-se: TV, indicadores metabólicos e de estresse em plasma, atividade enzimática em
fígado e expressão de hormônios hipofisários (hormônio do crescimento - GH, prolactina - PRL e
somatolactina - SL). No manuscrito (a) avaliou-se a eficácia anestésica do OELA em dourada
(Sparus aurata) e (b) investigaram-se os efeitos de 35 μL L-1 de OELA e 2-fenoxietanol (2-PHE)
sobre a resposta ao estresse em douradas submetidos à perseguição. Após 4 h de exposição,
foram amostrados plasma (para determinação dos níveis de cortisol, metabólitos e
osmolalidade), cérebro e hipófise (para avaliar a expressão de indicadores endócrinos). No artigo
1, a anestesia com os OEs provocou alterações em alguns parâmetros medidos em jundiás, mas
não impediu a restauração da maioria dos indicadores avaliados após 240 min de recuperação.
No artigo 2, 50 μL L-1 do OEHR provocou a elevação dos níveis de glicose, lactato, proteína e
osmolalidade, bem como aumento na atividade de enzimas metabólicas e redução na expressão
do GH e SL. No manuscrito, douradas expostos ao OELA, estressados ou não, exibiram maiores
níveis de cortisol, glicose, lactato e osmolalidade. A exposição ao OELA somado ao estresse
reduziu os níveis de expressão de CRH-BP (hormônio liberador de corticotrofina ligado à
proteína). A expressão de PRL foi reduzida no grupo controle estressado e após a exposição ao
OELA e 2-PHE em peixes não estressados. Maiores expressões de pro-opiomelanocortina
(POMC) a e b foram observadas em peixes estressados e expostos ao OELA e 2-PHE,
respectivamente. Conclui-se que: (1) o OELA é mais eficiente para jundiás que o OEHR em
concentrações para anestesia; (2) para sedar os peixes, recomenda-se 30 μL L-1 do OEHR (ou
menos); (3) o OELA foi eficaz como anestésico para dourada entre 100-300 μL L-1, mas para 4 h
de exposição o 2-PHE foi mais eficiente em prevenir a resposta ao estresse.
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