La caractérisation des mécanismes moléculaires exacts de la signalisation de l'insuline est très importante pour comprendre, traiter et prévenir le diabète de type 2. Le deacetylase SIRT1 est une protéine récemment découverte qui est impliquée dans la régulation métabolique, comme dans la sécrétion de l'insuline et l'homéostasie glucidique. Un des activateurs de SIRT1, le resvératrol, a des effets bénéfiques sur la santé, dont une amélioration de la sensibilité à l'insuline et une durée de vie prolongée. Cependant, l'interaction exacte entre la signalisation de l'insuline, SIRT1 et le resvératrol n'est pas connue. Par conséquent j'ai étudié au cours de ma thèse l'impact du resvératrol et de SIRT1 sur la voie de signalisation de l'insuline, principalement dans des cellules musculaires mais aussi in vivo dans le modèle expérimentale du nématode C.elegans. J'ai pu montrer que le resvératrol est un inhibiteur class IA-spécifique de la PI3K. Le resveratrol inhibe aussi l'installation d'une insulino-résistance, peut-être par l'inhibition des protéines kinases comme JNK, diminuant ainsi la phosphorylation en sérine des IRS. Nous montrons aussi que SIRT1 intensifie la signalisation de l'insuline, probablement par l'interaction avec le complexe IRS-PI3K. L'interaction de SIR-2.1, l'homologue de SIRT1, avec la PI3K joue aussi un rôle important dans la régulation de la durée de vie de C.elegans / Characterisation of the exact molecular mechanisms of insulin signalling is of great importance in understanding, treating and preventing type 2 diabetes. The recently discovered deacetylase SIRT1 is implicated in several metabolic regulation mechanisms, including insulin secretion and glucose homeostasis. The SIRT1 activator resveratrol also has beneficial metabolic effects, including improved insulin sensitivity and prolonged lifespan. However, the exact interplay of insulin signalling, SIRT1 and resveratrol is not known. I have therefore studied the impact of resveratrol and SIRT1 on the insulin signalling pathway, mainly in muscle cells, but also in the living model C.elegans. This work has allowed me to show that resveratrol is an isoform-specific PI3K inhibitor. Resveratrol also inhibited instalment of insulin resistance, possible through inhibition of kinases like JNK thereby reducing the IRS serine phosphorylation. We also showed that SIRT1 potentiates insulin signalling, probably through interaction with IRS-PI3K. The interaction with SIR-2.1, the SIRT1 homolog, is important also in PI3K-mediated lifespan regulation in C.elegans

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Le matériel génétique (l’ADN) d’un organisme contient l’information nécessaire à sa survie, sa croissance et sa reproduction. La perte de cette information affecte grandement la santé de l’organisme et cette altération est l’un des facteurs les plus courants dans le vieillissement ou le cancer. Quasiment toutes les cellules d’un organisme contiennent une copie de ce matériel génétique, communément appelé le génome, et font usage de plusieurs mécanismes pour en réparer les sections endommagées ainsi que pour le copier avec précision lors de la division cellulaire. Nous avons cherché à étudier les processus cellulaires qui maintiennent la stabilité génomique en inactivant systématiquement chacun des gènes avec la technique de criblage par CRISPR afin d’en étudier les rôles. Nous avons effectué ces criblages à l’échelle du génome dans des lignées cellulaires humaines en combinaison avec des perturbations chimiques dans le but d’identifier l’effet du traitement chimique ou le rôle de gènes qui exacerbent ou atténuent la perturbation. Nous nous sommes d’abord concentrés sur le resvératrol, une molécule initialement extraite de plantes qui a démontré des propriétés antivieillissement dans certains organismes modèles ainsi que la capacité d’inhiber la prolifération cellulaire. Notre criblage génétique a révélé que le resvératrol inhibait la réplication de l’ADN. En comparant les effets cellulaires du resvératrol à l’hydroxyurée, un agent connu pour causer du stress réplicatif, nous avons montré que ces deux traitements menaient à une diminution similaire de la progression de la fourche de réplication ainsi qu’à une activation de la signalisation en réponse au stress réplicatif. Nous avons également démontré que l’inhibition de la réplication de l’ADN dans les cellules humaines par le resvératrol est l’un des effets principaux de la molécule sur la prolifération cellulaire et ne requiert pas la présence de la déacétylase d’histone Sirtuin-1, protéine qui a été suggérée comme étant la cible principale du resvératrol pour son effet antivieillissement. Nous avons également étudié la perturbation d’un second processus cellulaire, soit le maintien des télomères. Ces séquences spéciales aux extrémités des chromosomes sont indispensables à la protection du génome et leur érosion graduelle est contrebalancée par l’activité enzymatique de la télomérase. Nous avons effectué un crible génétique par CRISPR à l’échelle du génome dans une lignée cellulaire dont nous avons inhibé la télomérase en utilisant BIBR1532, un inhibiteur spécifique de la télomérase. Nous avons découvert une forte interaction génétique entre la télomérase et C16orf72, un gène non-annoté que nous avons nommé TAPR1. Nous avons montré que les cellules déficientes en TAPR1 possèdent des niveaux élevés de la protéine p53, un facteur de transcription central à la réponse cellulaire aux dommages télomériques et aux dommages à l’ADN. Nous suggérons que TAPR1 agit comme un inhibiteur de la stabilité protéique de p53. En somme, ces travaux mettent en évidence la capacité des cribles génétiques CRISPR à approfondir nos connaissances sur le fonctionnement des processus de maintien de la stabilité génomique chez l’humain. / The genetic material (DNA) of an organism contains the necessary information for survival, growth and reproduction. Loss of this information strongly impacts the health of the organism and is the leading factor in aging and cancer. Almost all cells in an organism contain a copy of said genetic material (genome) and employ several mechanisms to repair any damaged section of the genome and to accurately copy it during cell division. We sought to understand the cellular processes by which cells maintain genome stability by systematically inactivating individual genes to uncover their role using pooled CRISPR-Cas9 screening. We employed genome-wide CRISPR screening in human cell lines in combination with specific chemical perturbations to identify gene deletions that enhance or suppress the phenotype of the chemical treatment, thereby shedding light on the effect of the treatment or the role of said enhancer/suppressor genes. We first focused on resveratrol; a small molecule first discovered in plants that has been suggested to extend lifespan in model organisms while also inhibiting cell proliferation ex vivo. Chemical-genetic screening pinpointed a role of resveratrol in inhibition of DNA replication. When we compared the cellular effects of resveratrol to hydroxyurea, a known inducer of replicative stress, we found that both treatments led to slower replication fork progression and activation of signaling in response to replicative stress. Importantly, we showed that the inhibition of DNA replication by resveratrol in human cells is a primary effect on cell proliferation and independent of the histone deacetylase Sirtuin-1, which has been implicated as the primary target in lifespan extension by resveratrol. We then studied the perturbation of a second cellular process, namely telomere maintenance. These specialized sequences at the termini of chromosomes are critical for the protection of chromosome ends and their erosion is counteracted by the enzymatic activity of telomerase. We performed a genome-wide CRISPR screen in cells that were concomitantly treated with a specific telomerase inhibitor, BIBR1532. We uncovered a strong genetic interaction between telomerase and a previously unannotated gene, C16orf72, which we named TAPR1. We found that TAPR1-depleted cells led to elevated p53 levels, a transcription factor central for the cellular response to telomeric and global DNA damage. We propose that TAPR1 is a negative regulator of p53 protein levels by promoting its turnover. Altogether, these studies highlight the power of CRISPR-Cas9 in genetic screening to uncover novel insight into the human genome stability maintenance network.

Les femmes diabétiques de type 2 présentent un risque cardiovasculaire (CV) plus élevé que les hommes diabétiques de type 2, mais peu d’études s’intéressent au sexe féminin dans ce contexte. L’objectif de ce doctorat était i) d’étudier les altérations CV induites par le prédiabète/diabète de type 2 dans le sexe féminin ; ii) de proposer une approche thérapeutique par le Resvératrol (RSV) chez des rates diabétiques de type 2 ; et iii) d’étudier l’effet du sexe sur les modifications physiologiques induites lors d’un prédiabète et sur la tolérance myocardique à un épisode d’ischémie-reperfusion (IR). Nous avons utilisé le rat prédiabétique induit par un régime riche en graisse et en sucre (HFS), et le rat Goto-Kakizaki (GK) diabétique de type 2. Nous avons réalisé des expériences d’imagerie, de spectroscopie par résonance magnétique in vivo et ex vivo et des analyses biochimiques. Nous avons mis en évidence un épaississement et une augmentation de la perfusion myocardiques chez les femelles HFS, ainsi qu’une forte sensibilité myocardique à un épisode d’IR, impliquant un stress oxydant exacerbé. Le RSV a induit chez les femelles GK une cardioprotection en augmentant les composés riches en énergie et les protéines de la voie du monoxyde d’azote lors d’un épisode d’IR. Enfin, il n’y a pas de dimorphisme sexuel dans la tolérance myocardique à un épisode d’IR lors d’un prédiabète, bien que le régime HFS ait induit des modifications physiologiques différentes selon le sexe. En conclusion, nous avons montré que les dysfonctions endothéliale et mitochondriale jouent un rôle important dans les complications CV associées au diabète de type 2 dans le sexe féminin. / Type 2 diabetic women have a higher cardiovascular (CV) risk than type 2 diabetic men, but few studies focus on the female sex in this context. The objective of this PhD was i) to study CV alterations induced by prediabetes/type 2 diabetes in female; ii) to propose a therapeutic approach by Resveratrol (RSV) in type 2 diabetic female; and iii) to study the effect of sex on the prediabetes-induced physiological modifications and on the myocardial tolerance to ischemia-reperfusion (IR) injury. We used the prediabetic rat induced by a high-fat high-sucrose diet (HFS), and the type 2 diabetic Goto-Kakizaki rat (GK). We performed in vivo and ex vivo cardiovascular magnetic resonance imaging and spectroscopy experiments and biochemical analyses. We highlighted myocardial thickening and increased perfusion in female HFS, as well as high myocardial sensitivity to IR involving exacerbated oxidative stress. RSV treatment of female GK induced cardioprotection by increasing the high-energy compounds and the proteins of the nitric oxide pathway during IR injury. Finally, there was no sexual dimorphism in myocardial tolerance to IR injury in prediabetes, although the HFS diet induced sex-specific physiological changes. In conclusion, we have shown that endothelial and mitochondrial dysfunctions play an important role in CV complications associated to type 2 diabetes in the female sex.

Les propriétés antioxydantes du resvératrol sont d’un grand intérêt pour contrer la dysfonction endothéliale où la contribution du stress oxydant est majeure. Cette dysfonction endothéliale est d’ailleurs bien caractérisée en hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Cette étude vise à explorer les effets thérapeutiques du resvératrol sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’HVG. L’HVG est induite suite à un cerclage aortique (CA) sur des porcelets de 2 mois. Le resvératrol est ensuite administré à 20 mg/kg/jour per os aux animaux répertoriés dans différents groupes. Le groupe 1 comprend les animaux contrôles sans CA alors que le groupe 2 représente les porcelets ayant subit le CA sans traitement. Le groupe 3 comprend les animaux traités pendant les 60 jours après la chirurgie alors que le groupe 4 est traité seulement à partir du 30ème jour jusqu’au jour 60. Des analyses échocardiographiques et histologiques ont été effectuées afin de déterminer le degré d’hypertrophie et l’impact du resvératrol sur la progression de l’HVG alors que la réactivité vasculaire a été évaluée par des expériences de chambres d’organes. La dysfonction endothéliale a été étudiée in vitro par quantification des métabolites nitriques et des niveaux de GMPc tandis que le stress oxydant est décrit par les niveaux d’angiotensine II (Ang II) et de protéines carbonylées. Les courbes dose-réponse à la sérotonine du groupe 3 traité pendant les 60 jours au resvératrol ont démontré une relaxation vasculaire significativement améliorée comparé au groupe 2 non-traité (p<0,05). Le pourcentage de changement du rapport de la masse du ventricule gauche sur la masse corporelle (LVmass/BW) a démontré une inhibition du développement de l’HVG dans le groupe 3 alors que le groupe 4 n’a pas eu d’effets bénéfiques des 30 jours de traitement au resvératrol. La biodisponibilité du NO représentée par la mesure de ses métabolites en circulation (398,71±21,74 ; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,001 pour groupe 1 et 3 vs groupe 2) et par le niveau de GMPc a été augmentée avec l’administration du polyphénol (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,05 pour groupe 1, 3 et 4 vs groupe 2). Le rôle antioxydant du resvératrol a été confirmé avec une réduction des niveaux de protéines carbonylées chez le groupe 3 comparé aux valeurs du groupe 2 (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg respectivement) sans diminution des niveaux d’Ang II. Le resvératrol a aussi réduit l’hypertrophie des cardiomyocytes et la fibrose interstitielle. Ainsi, le resvératrol peut effectivement réduire la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques et limiter l’occurrence de remodelage myocardique associé à l’HVG, principalement à travers l’activation de la signalisation dépendante du NO. / Antioxidant properties of resveratrol are of great interest regarding endothelial dysfunction in which oxidative stress has a major causative role. This dysfunction is well characterized in left ventricular hypertrophy (LVH). The current study was designed to explore the effects of resveratrol as a treatment for the coronary endothelial dysfunction associated with LVH. An aortic banding (AB) was performed on swine to induce LVH on two-month-old swine for 60 days. Resveratrol was administered at 20 mg/kg/d per os to different groups. Group 1 represented healthy controls while group 2 was not treated. After AB, group 3 received resveratrol from day 1 to 60 post-surgery whereas group 4 was treated from day 30 to 60 only. Echocardiographic and histological studies were performed to evaluate the degree of LVH. Vascular reactivity of epicardial coronary arteries was assessed in organ chamber experiments. Endothelial dysfunction was evaluated in vitro by nitric oxide (NO) metabolites and cyclic guanosine-3,5-monophosphate (cGMP) while angiotensin II (Ang II) levels and protein carbonylation evaluated Oxidative stress. After treatment, the LVmass/body weight ratio was improved in group 3 associated with reduced cardiomyocyte hypertrophy and interstitial fibrosis (p<0.05). Dose-response curves to serotonin for the resveratrol treated group 3 demonstrated a greater vascular relaxation compared to LVH untreated group 2 (p<0.05). Bioavailability of NO measured by its circulating metabolites (398,71±21,74; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,001 for groups 1 and 3 vs group 2) and by vascular cGMP (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml for groups 1, 2, 3 and 4 respectively, p<0,05 for group 1,3 and 4 vs group 2) was increased. The antioxidant effect of the polyphenol was confirmed by decreased protein carbonylation with the 60 days treatment (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg for group 3 vs 2) associated to unchanged Ang II levels. Therefore, resveratrol effectively reduces epicardial coronary endothelial dysfunction and limits the occurrence of cardiac remodelling associated with LVH, mainly through an NO-dependent pathway.

Maîtriser l’impact des maladies sur les cultures est un défi majeur de l’agriculture moderne. Cette préoccupation est un aspect important de l’optimisation de la productivité, notamment en viticulture. En France, le mildiou de la vigne causé par Plasmopara viticola est une des maladies cryptogamiques responsable des épidémies les plus dévastatrices et les plus redoutées. Les traitements reposent sur l’utilisation préventive, systématique et onéreuse de composés chimiques antifongiques dont l’utilisation massive constitue un risque à la fois pour l’homme et l’environnement. La réduction de l’utilisation de fongicide implique le développement d’outils de diagnostic au champ, qui requiert la compréhension des interactions entre la plante et les agents pathogènes. Les travaux de cette thèse pluridisciplinaire ont porté sur le pathosystème Plasmopara viticola - Vitis vinifera, notamment pour répondre à l’intérêt croissant pour un outil de diagnostic en temps réel de la maladie utilisable au vignoble. Les stilbènes sont des phytoalexines impliqués dans la défense de certaines plantes supérieures vis-à-vis de stress biotiques et abiotiques. L’autofluorescence de ces composés phénoliques, dont la biosynthèse est induite dans les feuilles de vigne par P. viticola, en fait un potentiel marqueur naturel de l’infection. En effet, la faible autofluorescence bleu-verte des feuilles de vigne saines est considérablement renforcée par l’autofluorescence violet-bleue des stilbènes à la surface de feuilles de vigne infectée par P. viticola. Cette étude a montré que quelque soit le niveau de résistance du génotype, l’autofluorescence violet-bleue des stilbènes induit par l’infection est présente au niveau des parois des cellules de l’épiderme. En dehors de la concentration, la viscosité s’est révélé être la principale variable physico-chimique influençant l’intensité de l’autofluorescence des stilbènes dans les différents compartiments cellulaires des feuilles de vigne. Ceci explique la fluorescence intense des parois, particulièrement rigides, des cellules de garde (stomates) des feuilles infectées. Le suivi cinétique journalier a révélé la nature transitoire de l’autofluorescence des stilbènes lors de l’infection. La robustesse et l’intérêt de ce signal a également été validée par la mesure à différentes échelles (de la cellule à la feuille entière) et avec différentes méthodes fluorimétriques. Les résultats de ce travail ont permis des avancées sur la connaissance du rôle de composés phénoliques induits et constitutifs dans la défense contre P. viticola. En plus de la localisation de l’autofluorescence des stilbènes en surface des feuilles, la microscopie confocale couplée à la microspectrofluorimetrie a révélé différentes localisations de ces phytoalexines dans la profondeur des tissus en corrélation avec le niveau de résistance des génotypes. L’utilisation de l’autofluorescence des stilbènes comme marqueur de l’infection a permis de mettre en évidence : 1) le fait que les flavonols constitutifs des feuilles de V. vinifera retardent le développement de l’infection par P. viticola; et 2) le fait que les acides hydroxycinnamiques constitutifs ne semble pas participer à la défense contre P. viticola. Enfin, une nouvelle méthode de diagnostic non-destructive du mildiou sur feuille basée sur l’autofluorescence des stilbènes a été développée. Elle a montré une détection pré-symptomatique du mildiou sur les feuilles de vigne entières dès le premier jour après l’infection sur la face abaxiale et le troisième jour sur la face adaxiale. Cette méthode de diagnostic du mildiou a été validée au laboratoire notamment grâce à un prototype de capteur proximal développé en collaboration avec la société Force-A. La validation de la méthode au vignoble dans le cadre d’infection naturelle est la prochaine étape pour une utilisation de ce capteur optique dans le cadre de l’agriculture durable et de la sélection variétale. / Controlling the impact of diseases on crops is a major challenge of modern agriculture. This concern is an important aspect of optimizing productivity, notably in viticulture. In France, downy mildew caused by Plasmopara viticola is a fungal disease responsible for the most devastating epidemics. The preventive and systematic treatments are expensive, while the massive use of antifungal chemicals is a risk to both humans and the environment. Reducing the use of fungicide involves the development of diagnostic tools in the field, which requires understanding the interactions between plants and pathogens. The work of this multidisciplinary thesis focused on the pathosystem Plasmopara viticola - Vitis vinifera, especially to meet the growing interest in a real-time diagnostic tool of disease applicable in the vineyard. Stilbenes are phytoalexins involved in the defense of certain higher plants against biotic and abiotic stresses. The autofluorescence of these phenolic compounds, whose biosynthesis is induced in grapevine leaves by P. viticola, makes it a potential marker of natural infection. Indeed, the low blue-green autofluorescence of grapevine leaves is greatly enhanced by the violet-blue autofluorescence of stilbenes on the surface of leaves infected by P. viticola. This study showed that whatever the level of resistance in various genotypes, violet-blue autofluorescence induced by stilbene is present in the walls of epidermal cells. In addition to their concentration, viscosity proved the main physico-chemical variable affecting the intensity of the autofluorescence of stilbenes in different compartments of vine leaves. This explains the intense fluorescence of the walls, particularly rigid, of guard cells (stomata) of infected leaves. Daily monitoring revealed a kinetic with a transient rise of the autofluorescence of stilbenes during infection. The robustness and value of this signal was also validated by measuring at different levels (cellular to whole leaf) and with various fluorimetric methods (imaging, spectroscopy, proximal sensing). These results advance our understanding of the role of constitutive and induced phenolic compounds in plant defence against P. viticola. In addition to a common location of the autofluorescence of stilbenes on the leaf surface, confocal microscopy coupled with microspectrofluorometry revealed distinctive localizations of these phytoalexins in the deep tissue correlated with the level of resistance in genotypes. This aspect no doubt needs broader testing. The use of autofluorescence of stilbene as a marker of infection allowed us to ascertain that: 1) constitutive flavonols of the leaves of V. vinifera retard the development of infection by P. viticola and 2) the constitutive hydroxycinnamic acids do not seem to participate in the defence against P. viticola. Finally, a new method for the non-destructive diagnosis of leaf infection based on the autofluorescence of stilbenes has been developed. We have demonstrated a pre-symptomatic detection of downy mildew on whole grape leaves from the first day after infection on the abaxial surface and from the third day on the adaxial surface. This method of diagnosis has been validated in the laboratory thanks to a proximal sensor prototype developed in collaboration with the company Force-A. The validation of the method in the vineyard in a context of natural infections is the next step for use of this optical sensor as a tool for sustainable agriculture and for genetic screening.

L’acétyl-coA occupe une place centrale dans le métabolisme intermédiaire. Il constitue le point de jonction de plusieurs voies métaboliques telles que la .-oxydation, la glycolyse, le catabolisme de certains acides aminés, la cétolyse, la cétogenèse et la synthèse d’acides gras. Il est également impliqué dans d’autres processus tels que l’acétylation des protéines. Au cours de mon travail de thèse, je me suis attachée à étudier différents aspects du métabolisme de l’acétyl-coA. La première partie de mon travail a porté sur la modulation pharmacologique de la .- oxydation dans le but de corriger des déficits de cette voie métabolique. L’intérêt de traitements par 400µM de bézafibrate ou 75µM de resvératrol dans les formes modérées de déficit en VLCAD et en CPT2 avait été montré précédemment. Par des méthodes de référence et grâce à la mise au point de nouvelles techniques, j’ai pu montrer sur des fibroblastes de patients déficitaires en LCHAD que des traitements par une combinaison de 35µM de bézafibrate et 30µM de resvératrol permettent d’augmenter les capacités d’oxydation du palmitate en stimulant la synthèse protéique. L’effet de cette combinaison était comparable à celui d’un traitement par 400µM de bézafibrate. Dans un second temps, je me suis intéressée à deux cofacteurs impliqués dans le métabolisme de l’acétyl-coA : l’acide lipoïque, cofacteur de quatre .-cétoacides déshydrogénases (PDHc, BCKDHc, .- KGDHc et GCS) et la riboflavine, cofacteur d’acyl-coA déshydrogénases de la .-oxydation et de déshydrogénases impliquées dans le catabolisme des acides aminés ramifiés. Ainsi, j’ai participé à la description d’anomalies du métabolisme de l’acide lipoïque, un nouveau groupe de maladies héréditaires du métabolisme caractérisé par un déficit combiné en .-cétoacides déshydrogénases. Par ailleurs, j’ai pu montrer qu’une hyperprolinémie constitue un biomarqueur intéressant pour le diagnostic d’acidurie glutarique de type II primaire ou secondaire, ces dernières pouvant se rencontrer en cas d’anomalie du métabolisme de la riboflavine. J’ai également évalué l’utilisation d’un mélange racémique de L,D-3-hydroxybutyrate afin de corriger les déficits énergétiques induits par un déficit en PDHc ou GLUT1. Via la cétolyse, le L,D-3- hydroxybutyrate génère de l’acétyl-coA. De façon surprenante, l’administration de ce composé s’est traduite par une amélioration de l’état clinique des patients atteints de déficits en PDHc, alors qu’une dégradation a été observée chez les patients atteints de déficits en GLUT1. Cette évolution différente pourrait souligner l’importance de l’anaplérose chez les patients déficitaires en GLUT1. Enfin, la dernière partie de mon travail de thèse porte sur la description d’un patient atteint d’une forme modérée de déficit en pyruvate carboxylase, cette enzyme étant régulée par l’acétyl-coA. Les difficultés diagnostiques rencontrées devant ces formes modérées sont rapportées, ainsi que des essais de traitement par des composés anaplérotiques et par le bézafibrate, malheureusement sans bénéfice net que ce soit in vitro ou in vivo. En conclusion, le métabolisme de l’acétyl-coA est altéré dans de nombreuses maladies héréditaires du métabolisme, dont certaines sont de description récente. Il peut être modulé par différentes approches pharmacologiques. Le développement de nouvelles techniques et notamment les analyses de flux métaboliques fournissent des outils utiles à son exploration et à l’étude de nouveaux traitements. / Acetyl-CoA is crucial for intermediary metabolism. It is at the crossroad of several metabolic pathways such as beta-oxidation, glycolysis, aminoacid catabolism, ketolysis, and fatty acid synthesis. It is also involved in other processes such as protein acetylation. In this document I studied different aspects of acetyl-CoA metabolism. First, I tried to correct fatty acid oxidation defects through pharmacological approach. Thanks to well- known methods and new ones, I showed that a combination of 30µM resveratrol and 35µM bezafibrate increased fatty acid oxidation capacities by increasing protein synthesis, as well as 400µM bezafibrate. Acetyl-CoA metabolism is also altered due to cofactors defects such as lipoic acid or riboflavine deficiency. I was involved in new diseases description and research for new biomarkers in this context. PDHc and GLUT1 deficiency are two different diseases with the same consequence : a defect in acetyl- CoA production from glucose. In order to improve patients’ quality of life, I evaluated the substitution of ketogenic diet with a racemic mix of L,D-3-hydroxybutyrate in PDHc and GLUT1 deficiency. The clinical evolution of patients was strikingly different, with an improvement in PDHc patients, whereas a degradation was noticed in GLUT1 patients. This difference might underline the role of anaplerosis in GLUT1 deficiency. Finally, I evaluated anaplerotic treatment and bezafibrate treatment in pyruvate carboxylase deficiency, an enzyme allosterically regulated by acetyl-CoA. To conclude, acetyl-CoA metabolism is altered in numerous inherited errors of metabolism, some of them being recently described. It can be modulated by pharmacological approaches. The development of new techniques such as metabolic flux analysis are useful for its study and for new treatments evaluation.

L’insuffisance cardiaque (IC) reste la cause majeure de morbimortalité dans les pays industrialisés justifiant ainsi la recherche de traitements plus ciblés. Caractérisée par des désordres métaboliques importants qui impliquent notamment une dysfonction mitochondriale, le métabolisme énergétique apparait comme une composante majeure du développement de l’IC. Ces dernières années, le co-activateur transcriptionnel PGC-1α a été proposé comme un acteur central du contrôle de la fonction mitochondriale et constitue ainsi une cible thérapeutique d’intérêt. Ainsi, l’objectif principal de ce travail est de développer un test cellulaire robotisé permettant la recherche d’activateurs de PGC-1α dans un contexte cardiaque.La mise en place de ce test cellulaire de criblage dans des cellules H9c2 différenciées en cellules pseudo-cardiaques a permis l’identification de trois familles majeures : les hormones stéroïdiennes, les vitamines B et les acides gras, capables d’activer l’expression de PGC-1α et par ce biais d’induire une biogenèse mitochondriale ainsi qu’une augmentation de la respiration mitochondriale. La validation de ces effets dans des cardiomyocytes de rat adulte a permis d’une part de valider la pertinence du test et du choix du modèle cellulaire et d’autre part de vérifier qu’une induction de l’expression de PGC-1α se répercute bien sur la cascade transcriptionnelle de la biogenèse mitochondriale. Ce test constitue donc un atout majeur dans le recherche de nouveaux activateurs de PGC-1α pour mieux comprendre ses mécanismes de régulation dans le cœur, mais offre aussi des perspectives intéressantes pour la recherche de composés pharmacologiques à visée thérapeutique.Par ailleurs, peu de connaissances sont disponibles dans la littérature concernant le contrôle de la biogenèse mitochondriale dans le muscle lisse vasculaire et plus particulièrement dans l’hypertension artérielle. Ainsi, la deuxième partie de ce travail a été de caractériser la biogenèse mitochondriale dans un contexte d’hypertension. A travers l’utilisation d’un modèle expérimental d’hypertension et après confirmation dans des cellules musculaires lisses en culture, nous avons montré une induction importante de la biogenèse mitochondriale dans l’hypertension par un mécanisme stress oxydant-dépendant. De plus, cette induction est corrélée à une forte activation de la CaMKII, totalement bloquée par la présence d’un anti-oxydant : le resvératrol. Ces résultats suggèrent donc un contrôle de la biogenèse mitochondriale dépendante de la balance pro/anti-oxydante via l’activation de la CaMKII dans le muscle lisse vasculaire. / Heart failure (HF) is still the major cause of morbimortality in industrialized countries that justify the research of new treatments. Characterized in part by metabolic disorders including mitochondrial dysfunction, energetic metabolism appears as an essential component in HF development. These last years, PGC-1α has been proposed as a central actor of mitochondrial function control and thus as a therapeutic target of interest.The development of a cellular robotized assay in cardiac-like differentiated H9c2 cells allowed identification of three families: steroid hormones, B vitamins and fatty acids, able to induce the expression of PGC-1α and thus up-regulate mitochondrial biogenesis and mitochondrial respiration. The validation of these effects in adult rat cardiomyocytes lets in the one hand to validate the suitability of the assay and in the other hand to confirm that PGC-1α induction leads to mitochondrial biogenesis activation. Consequently, this assay constitutes a major asset to find new activators of PGC-1α to better understand its regulation in heart and provides interesting perspectives for the research of therapeutic pharmacologic compounds.Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis in response to hypertension in vascular smooth muscle remain unclear. In this context, the second part of this work was to identify how mitochondrial biogenesis is modulated in arterial hypertension. Using an experimental model of hypertension and after validation in cultivated smooth muscle cells, we show a mitochondrial biogenesis induction in response to hypertension in relation with an increase in oxidative stress. Moreover, this induction is associated with a significant increase in CaMKII activity which was totally blocked by an antioxidant: resveratrol. These results suggest a regulation of mitochondrial biogenesis by oxidative stress via a CaMKII mechanism in vascular smooth muscle.

No / Osteoarthritis is an inflammatory disease of load-bearing synovial joints that is currently treated with drugs that exhibit numerous side effects and are only temporarily effective on pain, the main symptom of the disease. Consequently, there is an acute need for novel, safe and more effective chemotherapeutic agents for the treatment of osteoarthritis and related arthritic diseases. Resveratrol is a phytoalexin stilbene produced naturally by plants including red grapes, peanuts and various berries. Recent research in various cell models has demonstrated that resveratrol is safe and has potent anti-inflammatory properties. However, its potential for treating arthritic conditions has not been explored. In this study we provide experimental evidence that resveratrol inhibits the expression of VEGF, MMP-3, MMP-9 and COX-2 in human articular chondrocytes stimulated with the pro-inflammatory cytokine IL-1beta. Since these gene products are regulated by the transcription factor NF-kappaB, we investigated the effects of resveratrol on IL-1beta-induced NF-kappaB signaling pathway. Resveratrol, like N-Ac-Leu-Leu-norleucinal (ALLN) suppressed IL-1beta-induced proteasome function and the degradation of IkappaBalpha (an inhibitor of NF-kappaB) without affecting IkappaBalpha kinase activation, IkappaBalpha-phosphorylation or IkappaBalpha-ubiquitination which suppressed nuclear translocation of the p65 subunit of NF-kappaB and its phosphorylation. Furthermore, we observed that resveratrol as well as ALLN inhibited IL-1beta-induced apoptosis, caspase-3 activation and PARP cleavage in human articular chondrocytes. In summary, our results suggest that resveratrol suppresses apoptosis and inflammatory signaling through its actions on the NF-kappaB pathway in human chondrocytes. We propose that resveratrol should be explored further for the prophylactic treatment of osteoarthritis in humans and companion animals.

Tumor-induced immunosuppression can occur by multiple mechanisms, each posing a significant obstacle to immunotherapy. Evidence presented in this dissertation suggests that aberrant cytokine signaling, as a result of altered metabolism of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) cells, confers a selective advantage for tumor survival and growth. Cells from CLL patients with aggressive disease (as indicated by high-risk cytogenetics) were found to exhibit prolongation in Interferon (IFN)-induced STAT3 phosphorylation, and increased levels of reactive oxygen species (ROS) in these cells reflected these signaling processes. Changes in the relative balance of phospho-STAT3 and phospho-STAT1 levels, in response to combinations of IL-2 + Toll-like receptor (TLR)-7 agonist + phorbol esters, as well as IFN, were associated with the immunosuppressive and immunogenic states of CLL cells. In addition, immunosuppressive leukemic cells were found to express high levels of proteins with O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modifications, due to increased metabolic activity through the Hexosamine Biosynthetic Pathway (HBP), which caused impaired intracellular signaling responses and affected disease progression. A conclusion of the studies presented here is that the intrinsic immunosuppressive properties of leukemic cells may be overcome by agents such as Resveratrol that target metabolic pathways of these cells.