Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T17:53:07Z No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T17:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina é o hormônio responsável pela regulação da produção de células vermelhas. A eritropoetina humana recombinante (rhEPO) produzida em laboratório e usada como medicamento pode apresentar as isoformas alfa e beta, chamadas de alfaepoetina e betaepoetina humana recombinante. O tratamento com rhEPO melhora bastante a vida de pacientes anêmicos e/ou em diálise, reduzindo a necessidade de transfusão de sangue. A grande demanda por este biofármaco justifica o esforço de pesquisa não só para conhecimento de seus mecanismos de ação e desenvolvimento de processos de produção, como também para controle da qualidade do produto. É de grande importância o desenvolvimento de métodos de análise que diminuam a margem de erro e aumentem a precisão e a confiabilidade dos resultados, além de reduzir o tempo de liberação para o mercado. O ensaio de determinação da potência da alfaepoetina humana recombinante produzida por Bio-Manguinhos é realizado pelo método de camundongos normocitêmicos, com contagem de reticulócitos por microscopia. Estemétodo de contagem é demorado, pouco preciso e desgastante para o analista. O objetivo deste trabalho é estudar o uso do método de citometria de fluxo na contagem de reticulócitos para o ensaio de potência da alfaepoetina humana recombinante. Visando a implantação do método no Departamento de Controle de Qualidade (DEQUA) de Bio-Manguinhos, o desenvolvimento deste trabalho teve também como objetivo comparar a sua eficácia em relação aoprocesso atualmente utilizado, e a realizar os testes necessários à sua validação. Os camundongos foram inoculados com três doses diferentes de amostra ou material de referência e os reticulócitos presentes no sangue coletado foram marcados com o corante fluorescente laranja de tiazol (Retic-COUNT). Os reticulócitos foram contados em citômetro de fluxo FACSCalibur e seu percentual foi utilizadopara a determinação da potência de acordo com os cálculos da Farmacopéia Européia 6ª edição. Para a comparação entre os métodos, vinte lotes de alfaepoetina humana recombinante produzidos por Bio-Manguinhos tiveram sua potência determinada pela contagem de reticulócitos por citometria e microscopia. Para a determinação da repetitividade e da precisão intermediária, foi utilizado um único lote de alfaepoetina humana recombinante. Para avaliar a concordância entre os métodos de citometria de fluxo e microscopia, foi utilizado o teste estatístico de Bland-Altman, com comparação dos vinte resultados obtidoscom os mesmo lotes, analisados a partir das mesmas amostras de sangue. Os resultados apresentaram boa repetitividade e precisão intermediária e mostraram que os métodos são equivalentes no que diz respeitoà determinação da potencia da rhEPO produzida por Bio-Manguinhos. No entanto, em funçãoda alta probabilidade de erros associados ao método de microscopia, a introdução da citometria de fluxo mostra-se uma alternativa bastante promissora para suprir a demanda de testes com precisão, reprodutibilidade e maior velocidade de liberação de lotes. / Erythropoietin is the hormone responsible for the regulation of the red cells’ production. The recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced in laboratory and used as a drug exists in the alpha and beta isoforms, called alpha epoietin and beta epoietin. The treatment with rhEPO improves the life of anemic patients and/or on dialysis, reducing the need for blood transfusion. The high demand for this biopharmaceutical product justifies the research effort not only for the knowledge of its mechanisms of action and development of production processes, but also for the product quality control. The development of quality control methods able to reduce errors and increase the accuracy and the reliability of the results, along with a reduction in the release timeto the market, is of great importance. The assay to determine the biological activity of the recombinant human alpha epoietin produced in Bio-Manguinhos is performed bythe normocythaemic mice method and reticulocyte counting by microscopy. This counting method is time consuming, imprecise and stressful to the analyst. The present study aimed to study the use of the flow cytometric method for reticulocyte counting in the biological activity assay for the human alpha epoietin. Intending to implement this new method in the Quality Control Department of Bio-Manguinhos, this work also compared its effectiveness with the currently used method, and the tests required to its validation were performed. The mice were inoculated with three different dosesof sample and reference material, and the reticulocytes on the collected blood were stained with the fluorescent dye thiazole orange (Retic-COUNT). The reticulocytes were counted in a FACSCalibur flow cytometer and their percentage was used for the biological activity determination in accordance with the European Pharmacopoeia 6 th edition. To compare the methods, the biological activity of twenty batches of recombinant human alpha epoetin produced by Bio-Manguinhos was determined trough both cytometry and microscopy. Tothe determination of repeatability and intermediate precision, only a single batch of recombinant human alpha epoetin was used. For the evaluation of agreement between both methods, the Bland-Altman test was used to the compare the twenty results obtained from the same batches, analyzed from the same blood samples. The results showed good repeatability and intermediate precision and indicated that the two methods are equivalent when it concerns thedetermination of the rhEPO biological activity. However, due to the high probability of errors associated with the microscopy method, the introduction of the flow cytometry method seems to be a promising alternative to meet the demand for analyses with precise and reproducible results, along with a good speed in releasing batches for the market.

A Fosfoetanolamina Sintética (FO-S), monoester-fosfolípide tem importante papel sobre a proliferação celular, indução da apoptose, em células tumorais, sem, contudo, afetar as células normais. Neste estudo foi avaliado o comportamento biológico e efeitos da toxicidade aguda da fosfoetanolamina sintética (FO-S), em experimentos de dose única e repetidas em camundongos sadios, contribuindo para validação pré-clínica. Os camundongos Balb-c de ambos os sexos receberam o composto FO-S via endovenosa nas doses de 50, 100, 250, 500 e 1000 mg/kg em dose única, e 50, 100 e 250 mg/kg em doses repetidas. No grupo dose única os animais que receberam 500 e 1000 mg/kg de FO-S apresentaram sinais de toxicidade, tais como: mortalidade de 33% dos animais; rebaixamento no sistema nervoso central e autônomo; flutuações das análises hematológicas; aumento dos níveis de TGO e TGP; diminuição de creatinina; análises da medula óssea mostraram diminuição das populações mieloides e linfoides; diminuição de células na fase G0/G1 do ciclo celular, assim como na fase S, e aumento na fase G2/M; alterações histológicas no coração, fígado e rins como necrose, esteatose, hialinização e hiperemia respectivamente. Tanto no grupo dose única, como no grupo doses repetidas, ocorreu aumento no número de reticulócitos no 7º dia após a aplicação, como resposta da medula óssea reativa, e as análises da sua celularidade revelaram atividade positiva do potencial elétrico mitocondrial. No grupo doses repetidas, os animais que receberam 50 mg/kg de FO-S apresentaram no 14º anemia leve, o grupo 100 mg apresentou aumento no número de leucócitos e linfócitos e o grupo 250 mg flutuações nos valores quantitativos de plaquetas, que retornaram à normalidade após 14 dias. As análises da medula óssea revelaram aumento de células no compartimento mieloide no grupo que recebeu 50 mg e aumento da celularidade no compartimento eritroide. A expressão dos marcadores de células precursoras hematopoiéticas da medula óssea, CD34, se mostrou aumentada no grupo que recebeu 250 mg aos 14 dias e diminuição do marcadores de células mielódes e subtipos de linfócitos, CD43, nos grupos que receberam 100 e 250 mg/kg aos 7 e 14 dias. Os animais que receberam 250 mg/kg apresentaram alterações no parênquima pulmonar. A análise de autofagia por citometria de fluxo que não revelou resposta negativa, como estresse oxidativo, apresentando produção normal de vacúolos autofágicos, assim como o teste de presença de micronúcleos não demonstrou danos às células por alterações genéticas induzidas por toxicidade / Synthetic Phosphoethanolamine (FO-S), a monoester phospholipid has an important role on cell proliferation, induction of apoptosis, in tumor cells, without, however, significantly affecting normal cells. In this study the biological behavior and effects of acute toxicity of synthetic phosphoethanolamine (FO-S) were evaluated in single dose and repeated experiments in healthy mice, contributing to the pre-clinical validation of this compound as antitumor phospholipid. Mice of both sexes received intravenous FO-S compound at doses of 50, 100, 250, 500 and 1000 mg / kg in single dose, and 50, 100 and 250 mg / kg in repeated doses. In the single dose group, animals receiving 500 and 1000 mg / kg FO-S showed signs of toxicity, such as: 33% mortality of animals; lowering in the central and autonomic nervous system; fluctuations in hematological analyzes; increased levels of TGO and TGP; decreased creatinine; bone marrow analysis showed decreased myeloid and lymphoid populations; decrease of cells in the G0 / G1 phase of the cell cycle, as well as in the S phase, and increase in the G2 / M phase; histological changes in the heart, liver and kidneys such as hyperemia, necrosis and hyalinization. In both the single dose and repeated dose groups, there was an increase in the number of reticulocytes on the 7th day after application, as a response of the reactive bone marrow, and the cellularity analysis showed positive mitochondrial electrical potential activity. In the repeated dose group, animals receiving 50 mg / kg FO-S presented in the 14th mild anemia, the 100 mg group showed an increase in the number of leukocytes and lymphocytes and the group 250 mg fluctuations in the quantitative platelet values, which returned to the normality at 14 days. Bone marrow analysis revealed increased cell count in the myeloid compartment in the 50 mg group and increased cellularity in the erythroid compartment. Expression of CD34 marrow hematopoietic precursor cell markers was shown to be increased in the 250 mg group at 14 days and a decrease in myelodystic cell markers and CD43 lymphocyte subtypes in the groups receiving 100 and 250 mg / kg at 7 and 14 days. Animals that received 250 mg / kg presented changes in the lung parenchyma. Autophagy analysis was performed by flow cytometry that revealed no negative response, such as oxidative stress, presenting normal production of autophagic vacuoles, as well as the presence of micronuclei test did not demonstrate damage to the cells by genetic changes induced by toxicity

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

With the sharp increase on the demand for lamb meat, Brazilian sheep industry has experienced an unprecedented growth on the national flock. Among the limiting factors in sheep production anemia due to worm infection is a major cause of losses. The objective of the present work was to evaluate the oxidative status and the red blood cell profile in lambs with bleeding induced anemia, supplemented or not with dextran iron. Ten 5 to 7 month-old ram lambs were used. Day zero was defined when each experimental animal attained 15% packed cell volume after successive bleedings. Animals were then allocated into 2 experimental groups: Treated group which received a single injection of dextran iron (25 mg/kg i.m.) and Control animals that received no treatment. Blood samples were collected on days zero, 7, 14 and 21. At days 7 and 21 there was an increase in the tiobarbituric acid reactive species (TBARS) in treated animals. The same group presented reduced levels of non-protein Thiol groups (NPTH) at days 7, 14 and 21. At day 7 osmotic fragility of red blood cells was increased in control animals as compared to the treated group. Red blood cell profile recovered faster in treated than control animals. In conclusion, iron supplementation eventhough inducing oxidative stress accelerated the recovery of hematological profile. The results can suggest the use of iron injections in conjunction with wormers in the treatment of haemonchus infections / A potencialidade do mercado de carne ovina é uma realidade, devido a isto a ovinocultura brasileira tem se desenvolvido de maneira bastante acentuada. Entre os fatores limitantes para a produção de ovinos a anemia verminótica é a principal causa de prejuízos para os produtores. O objetivo deste trabalho foi avaliar o status oxidativo e a recuperação do quadro hematológico de cordeiros com anemia induzida por sangramento e suplementados ou não com ferro. Foram utilizados 10 cordeiros machos entre 5 e 7 meses de idade. O dia zero do experimento foi considerado quando cada animal atingiu o hematócrito 15% após a indução da anemia e foi alocado em um dos grupos experimentais. O grupo tratado recebeu uma injeção de 25 mg/kg de peso vivo de ferro dextrano intramuscular em dose única e o grupo controle não foi tratado. As coletas de sangue foram feitas nos dias zero, 7, 14 e 21. Nos dias 7 e 21 após ao tratamento houve aumento nos valores de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e diminuição nos valores dos grupamentos tióis não protéicos (NPTH) nos dias 7, 14 e 21 no grupo tratado. No dia 7, o teste de fragilidade osmótica eritrocitária indicou um aumento na resistência da membrana dos eritrócitos dos animais do grupo tratado quando comparado aos animais do grupo controle. A recuperação da série vermelha do sangue (eritrócitos, hematócrito e hemoglobina) foi mais rápida no grupo tratado. A suplementação de ferro apesar de aumentar o estresse oxidativo acelerou a recuperação do quadro hematológico, não aumentando a porcentagem de hemólise pela ação das espécies reativas de oxigênio sobre a membrana eritrocitária. Pode-se sugerir também apartir destes resultados a utilização de ferro como tratamento auxiliar para verminose junto com anti-helmínticos

A Fosfoetanolamina Sintética (FO-S), monoester-fosfolípide tem importante papel sobre a proliferação celular, indução da apoptose, em células tumorais, sem, contudo, afetar as células normais. Neste estudo foi avaliado o comportamento biológico e efeitos da toxicidade aguda da fosfoetanolamina sintética (FO-S), em experimentos de dose única e repetidas em camundongos sadios, contribuindo para validação pré-clínica. Os camundongos Balb-c de ambos os sexos receberam o composto FO-S via endovenosa nas doses de 50, 100, 250, 500 e 1000 mg/kg em dose única, e 50, 100 e 250 mg/kg em doses repetidas. No grupo dose única os animais que receberam 500 e 1000 mg/kg de FO-S apresentaram sinais de toxicidade, tais como: mortalidade de 33% dos animais; rebaixamento no sistema nervoso central e autônomo; flutuações das análises hematológicas; aumento dos níveis de TGO e TGP; diminuição de creatinina; análises da medula óssea mostraram diminuição das populações mieloides e linfoides; diminuição de células na fase G0/G1 do ciclo celular, assim como na fase S, e aumento na fase G2/M; alterações histológicas no coração, fígado e rins como necrose, esteatose, hialinização e hiperemia respectivamente. Tanto no grupo dose única, como no grupo doses repetidas, ocorreu aumento no número de reticulócitos no 7º dia após a aplicação, como resposta da medula óssea reativa, e as análises da sua celularidade revelaram atividade positiva do potencial elétrico mitocondrial. No grupo doses repetidas, os animais que receberam 50 mg/kg de FO-S apresentaram no 14º anemia leve, o grupo 100 mg apresentou aumento no número de leucócitos e linfócitos e o grupo 250 mg flutuações nos valores quantitativos de plaquetas, que retornaram à normalidade após 14 dias. As análises da medula óssea revelaram aumento de células no compartimento mieloide no grupo que recebeu 50 mg e aumento da celularidade no compartimento eritroide. A expressão dos marcadores de células precursoras hematopoiéticas da medula óssea, CD34, se mostrou aumentada no grupo que recebeu 250 mg aos 14 dias e diminuição do marcadores de células mielódes e subtipos de linfócitos, CD43, nos grupos que receberam 100 e 250 mg/kg aos 7 e 14 dias. Os animais que receberam 250 mg/kg apresentaram alterações no parênquima pulmonar. A análise de autofagia por citometria de fluxo que não revelou resposta negativa, como estresse oxidativo, apresentando produção normal de vacúolos autofágicos, assim como o teste de presença de micronúcleos não demonstrou danos às células por alterações genéticas induzidas por toxicidade / Synthetic Phosphoethanolamine (FO-S), a monoester phospholipid has an important role on cell proliferation, induction of apoptosis, in tumor cells, without, however, significantly affecting normal cells. In this study the biological behavior and effects of acute toxicity of synthetic phosphoethanolamine (FO-S) were evaluated in single dose and repeated experiments in healthy mice, contributing to the pre-clinical validation of this compound as antitumor phospholipid. Mice of both sexes received intravenous FO-S compound at doses of 50, 100, 250, 500 and 1000 mg / kg in single dose, and 50, 100 and 250 mg / kg in repeated doses. In the single dose group, animals receiving 500 and 1000 mg / kg FO-S showed signs of toxicity, such as: 33% mortality of animals; lowering in the central and autonomic nervous system; fluctuations in hematological analyzes; increased levels of TGO and TGP; decreased creatinine; bone marrow analysis showed decreased myeloid and lymphoid populations; decrease of cells in the G0 / G1 phase of the cell cycle, as well as in the S phase, and increase in the G2 / M phase; histological changes in the heart, liver and kidneys such as hyperemia, necrosis and hyalinization. In both the single dose and repeated dose groups, there was an increase in the number of reticulocytes on the 7th day after application, as a response of the reactive bone marrow, and the cellularity analysis showed positive mitochondrial electrical potential activity. In the repeated dose group, animals receiving 50 mg / kg FO-S presented in the 14th mild anemia, the 100 mg group showed an increase in the number of leukocytes and lymphocytes and the group 250 mg fluctuations in the quantitative platelet values, which returned to the normality at 14 days. Bone marrow analysis revealed increased cell count in the myeloid compartment in the 50 mg group and increased cellularity in the erythroid compartment. Expression of CD34 marrow hematopoietic precursor cell markers was shown to be increased in the 250 mg group at 14 days and a decrease in myelodystic cell markers and CD43 lymphocyte subtypes in the groups receiving 100 and 250 mg / kg at 7 and 14 days. Animals that received 250 mg / kg presented changes in the lung parenchyma. Autophagy analysis was performed by flow cytometry that revealed no negative response, such as oxidative stress, presenting normal production of autophagic vacuoles, as well as the presence of micronuclei test did not demonstrate damage to the cells by genetic changes induced by toxicity

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Henrique da Silva.pdf: 146595 bytes, checksum: b33ac213ba3a976522fc7a41aa05e514 (MD5) Previous issue date: 2013-08-05 / Changes in the results of erythrocyte standards require decisions and guide the conduct of clinical regarding prognosis and treatment of any diseases. The use of modern equipment that make the blood cell count used to calculate the RDW (red cell distribution width) and its fractions RDW-CV and RDW-SD, which provide a quantitative assessment of heterogeneity of each erythrocyte. Given the limited information available in the literature about the RDW for the domestic cat, this study aims to compare the values of RDW, with MCV and reticulocytes from 40 (n=14males, n=26 females) healthy mongrel cats, with age ranging from 1.2 to 5.5 years (3.0 ± 1.2) were used. The animals were kept in individual cages all over the experiment. Blood samples were taken directly from the external jugular vein and separated into two tubes: one containing anticoagulant EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) to 10% for the complete blood count and the second without anticoagulant for biochemical tests. The results showed that there is a direct relationship between values of RDW-SD and RDW-CV and an inverse correlation between RDW-CV with MCV. There was no relation between RDW and reticulocyte aggregates or punctate. There was no relation between sex and RDW as well. RDW values determined in this experiment can be used as a resource for future research and also as reference values for the feline species. / As alterações nos resultados dos padrões eritrocitários demandam decisões e norteiam a conduta do clínico quanto ao prognóstico e a terapêutica de eventuais patologias. A utilização de equipamentos modernos que fazem a contagem celular sanguínea permite calcular a amplitude de distribuição dos eritrócitos ou RDW (red cell distribution width) e suas frações RDW-CV e RDW-SD, que provêem uma avaliação quantitativa da heterogenicidade de cada eritrócito. Diante da escassa informação disponível na literatura científica sobre os valores de RDW para o gato doméstico, este estudo se propõe a comparar os valores de RDW com o VCM e reticulócitos de 40 gatos domésticos hígidos, sem raça definida, com idade variando de 1,2 a 5,5 anos (3,0±1,2), sendo 14 machos e 26 fêmeas provenientes do gatil da instituição. O sangue foi colhido diretamente da veia jugular externa e separado em dois tubos: um contendo anticoagulante EDTA (ácido etileno diamino tetra acético) a 10%, para a realização do hemograma e o segundo, sem anticoagulante, para as provas bioquímicas de triagem. Os resultados encontrados mostraram que existe uma relação direta significativa entre os valores de RDW-SD e RDW-CV e uma correlação inversa entre os valores de RDW-CV o VCM. Não houve correlação entre os valores de RDW e reticulócitos agregados ou ponteados. O sexo não interfere no diâmetro das hemácias. Os valores de RDW determinados neste experimento podem ser usados como fonte de consulta para futuras pesquisas e também como valores de referência da espécie felina.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Henrique da Silva.pdf: 146595 bytes, checksum: b33ac213ba3a976522fc7a41aa05e514 (MD5) Previous issue date: 2013-08-05 / Changes in the results of erythrocyte standards require decisions and guide the conduct of clinical regarding prognosis and treatment of any diseases. The use of modern equipment that make the blood cell count used to calculate the RDW (red cell distribution width) and its fractions RDW-CV and RDW-SD, which provide a quantitative assessment of heterogeneity of each erythrocyte. Given the limited information available in the literature about the RDW for the domestic cat, this study aims to compare the values of RDW, with MCV and reticulocytes from 40 (n=14males, n=26 females) healthy mongrel cats, with age ranging from 1.2 to 5.5 years (3.0 ± 1.2) were used. The animals were kept in individual cages all over the experiment. Blood samples were taken directly from the external jugular vein and separated into two tubes: one containing anticoagulant EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid) to 10% for the complete blood count and the second without anticoagulant for biochemical tests. The results showed that there is a direct relationship between values of RDW-SD and RDW-CV and an inverse correlation between RDW-CV with MCV. There was no relation between RDW and reticulocyte aggregates or punctate. There was no relation between sex and RDW as well. RDW values determined in this experiment can be used as a resource for future research and also as reference values for the feline species. / As alterações nos resultados dos padrões eritrocitários demandam decisões e norteiam a conduta do clínico quanto ao prognóstico e a terapêutica de eventuais patologias. A utilização de equipamentos modernos que fazem a contagem celular sanguínea permite calcular a amplitude de distribuição dos eritrócitos ou RDW (red cell distribution width) e suas frações RDW-CV e RDW-SD, que provêem uma avaliação quantitativa da heterogenicidade de cada eritrócito. Diante da escassa informação disponível na literatura científica sobre os valores de RDW para o gato doméstico, este estudo se propõe a comparar os valores de RDW com o VCM e reticulócitos de 40 gatos domésticos hígidos, sem raça definida, com idade variando de 1,2 a 5,5 anos (3,0±1,2), sendo 14 machos e 26 fêmeas provenientes do gatil da instituição. O sangue foi colhido diretamente da veia jugular externa e separado em dois tubos: um contendo anticoagulante EDTA (ácido etileno diamino tetra acético) a 10%, para a realização do hemograma e o segundo, sem anticoagulante, para as provas bioquímicas de triagem. Os resultados encontrados mostraram que existe uma relação direta significativa entre os valores de RDW-SD e RDW-CV e uma correlação inversa entre os valores de RDW-CV o VCM. Não houve correlação entre os valores de RDW e reticulócitos agregados ou ponteados. O sexo não interfere no diâmetro das hemácias. Os valores de RDW determinados neste experimento podem ser usados como fonte de consulta para futuras pesquisas e também como valores de referência da espécie felina.

As Anemias Hemolíticas compreendem um grupo de doenças em que há redução acentuada na sobrevivência dos glóbulos vermelhos circulantes e a medula óssea não é capaz de compensação, mesmo aumentando sua produção, o que causa anemia desde os primeiros anos da vida da pessoa. Dentre as doenças deste grupo, a Anemia Falciforme (SCA) e a Esferocitose Hereditária (HS) destacam-se por se tratarem de enfermidades com defeitos genéticos intrínsecos das células vermelhas (RBCs) que geram complicações multissistêmicas agudas e crônicas em seus portadores. Por vias patofisiológicas distintas, reticulócitos e respectivas hemácias defeituosas de tais doenças, falciformes e esferócitos, são continuamente aprisionados e fagocitados no baço, importante órgão de destruição de células velhas e/ou defeituosas via hemólise extravascular, o que leva progressivamente à disfunção e eventual perda da função esplênica. O objetivo desse trabalho é avaliar o papel do baço em relação à habilidade e ao fenótipo adesivos de reticulócitos (ret) e eritrócitos (erit) em pacientes com SCA e HS, com e sem função esplênica preservada. Amostras de sangue de 37 pacientes (22 SCA and 15 HS) com função esplênica e 19 pacientes (13 SCA e 6 HS) sem ela foram avaliadas. Ainda, sangue de 22 crianças com SCA foi coletado em estudo longitudinal dos 6 e 29 meses de vida. Todas as amostras de sangue foram analisadas quanto à função esplênica (Contagem de células PIT e de corpúsculos de Howell-Jolly - HJB), quanto ao perfil imunofenotípico celular (em % e em média de intensidade de fluorescência - MFI) e quanto à habilidade de adesão das células vermelhas à laminina e à linhagem celular endotelial HMEC-1. A análise da transição da perda de função esplênica demonstrou que a mesma se intensificou a partir dos 3 anos de idade (PIT: r=0,8; p<0,0001; HJB: r=0,7; p<0.0001). Quanto à imunofenotipagem celular, a contagem PIT se correlacionou positivamente, principalmente com os marcadores CD147 (%ret: r=0,6; p<0,0001; MFIret: r=0,6; p<0,0001; %erit: r=0,7; p<0,0001; MFIerit: r=0,6; p<0,0001), LuBCAM (%ret: r=0,5; p=0,004; MFIret: r=0,6; p<0,0001; %erit: r=0,6; p<0,0003; MFIerit: r=0,4; p<0,004) and CD58 (%ret: r=0,4; p=0,006; MFIret: r=0,5; p<0,0013; %erit: r=0,4; p<0,009; MFIerit: r=0,6; p<0,0001). Na comparação entre ausência ou presença do baço, a perda de sua função exerceu influência no aumento da expressão de adesão de RBCs em SCA, principalmente CD147 (%ret: p=0,002; MFIret: p=0,003; %erit: p<0,0001; MFIerit: p=0,005), LuBCAM (%ret: p=0,0001; MFIret: p<0,0001; %erit: p<0,0001; MFIerit: p<0,0001) e CD58 (%ret: p=0,007; MFIret: p=0,006; %erit: p=0,003; MFIerit: p=0,0004), embora a adesão celular tenha diminuído em pacientes HS esplenectomizados. Na comparação entre as doenças, pacientes HS com o baço apresentaram maior freqüência de adesão celular em relação aos SCA, notavelmente em relação ao LuBCAM (%ret: p=0,0008; MFIret: p=0,03; %erit: p<0,0001; MFIerit: p=0,0002), CD58 (%ret: p=0,0009; %erit: p=0,003) e CD44 (%ret: p=0,009; %erit: p<0,003). No entanto, as amostras SCA sem função esplênica tiveram maior expressão de adesão celular para CD147 (%ret: p=0,006; MFIret: p=0,02; %erit: p=0,02), LuBCAM (%ret: p=0,004; MFIret: p<0,0001), CD36 (%ret: p=0,0002; MFIret: p=0,01), CD242 (%ret: p=0,0008; %erit: p=0,05) e CD49d (%ret: p=0,04). Em relação ao Ensaio de Adesão in vitro, na ausência de baço, os RBCs SCA apresentaram maior adesividade à laminina do que os RBCs SCA com função esplênica preservadaem todas as taxas de fluxo de tensão de cisalhamento empregadas (0,5 dyne/cm2: p=0,01; 1 dyne/cm2: p=0,02; 2 dynes/cm2: p=0,03; 3 dynes/cm2: p=0,03; 5 dynes/cm2: p=0,04 e 7 dynes/cm2: p=0,03). Especialmente, reticulócitos de pacientes sem baço apresentaram maior adesividade à HMEC-1 em baixas tensões de cisalhamento (1 dyne/cm2) em ambas as doenças (SCA: p=0,03; HS: p=0,03). Por fim, reticulócitos apresentaram maior habilidade adesiva à células endoteliais em indivíduos SCA do que em pacientes HS, com (0,5 dyne/cm2: p=0,04; 1 dyne/cm2: p=0,03) ou sem baço (0,5 dyne/cm2: p=0,02; 2 dynes/cm2: p=0,01; 3 dynes/cm2: p=0,03; 5 dynes/cm2: p=0,02 e 7 dynes/cm2: p=0,03). Nossos resultados indicam que embora pertençam ao grupo de Anemias Hemolíticas, as patofisiologias e evoluções clínicas distintas de SCA e de HS levam a padrões imunofenotípicos diferentes de expressão da adesão celular. Na SCA, a ausência de função esplênica teria direta relação com o aumento do fenótipo pró-adesivo e com a adesividade de RBCs SCA, o que traz sérias consequências clínicas aos pacientes, enquanto na HS sem baço, de maneira geral, os eventos de adesão celular são minimizados, embora ainda apresentem reticulócitos e eritrócitos adesivos circulantes após a esplenectomia. / Hemolytic Anemias comprise a group of diseases in which there is marked reduction in the survival of circulating erythrocytes and the bone marrow is not capable of compensation, even by increasing its production, which causes anemia from the first years of the person\'s life on. Among the diseases of this group, Sickle Cell Anemia (SCA) and Hereditary Spherocytosis (HS) stand out for being diseases with intrinsic genetic defects of red blood cells (RBCs) that generate acute and chronic multisystemic complications in their patients. By distinct pathophysiological pathways, reticulocytes and these disease\'s respective defective erythrocytes, sickle and spheroid ones, are continuously trapped and phagocytosed in the spleen, important organ of destruction of old and/or defective cells via extravascular hemolysis, which progressively leads to dysfunction and eventual loss of splenic function. The objective of this study was to evaluate the role of the spleen in relation to the reticulocyte (ret) and erythrocyte (eryt) adhesive ability and adhesion phenotype in patients with SCA and HS, with and without preserved splenic function. Blood samples from 37 patients (22 SCA and 15 HS) with splenic function and 19 patients (13 SCA and 6 HS) without it were evaluated. Still, blood from 22 children with SCA was collected in a longitudinal study from 6 to 29 months of age. All blood samples were analyzed for splenic function [pitted cells (PIT) and Howell-Jolly bodies (HJB) counting], for the cellular immunophenotypic profile (in % and in mean fluorescence intensity - MFI) and for the adhesive ability of RBCs to laminin and to endothelial cell line HMEC-1. Analysis of the splenic function loss transition showed that it intensified from 3 years of age on (PIT: r=0.8, p<0.0001; HJB: r=0.7, p<0.0001). Regarding the cellular immunophenotyping, PIT count correlated positively, mainly with CD147 markers (%ret: r=0.6, p<0.0001; MFIret: r=0.6, p<0.0001; %eryt: r=0.7, p<0.0001; MFIeryt: r=0.6, p<0.0001), LuBCAM (%ret: r=0.5, p=0.004; MFIret: r=0.6, p<0.0001; %eryt: r=0.6, p<0.0003; MFIeryt: r=0.4, p<0.004) and CD58 (%ret: r=0.4, p=0.006; MFIret: r=0.5, p<0.0013; %eryt: r=0.4, p<0.009; MFIeryt: r=0.6, p<0.0001). In the comparison between spleen absence or presence, the loss of its function exerted influence on the increase of RBCs adhesion expression in SCA, mainly on CD147 (%ret: p=0.002; MFIret: p=0.003; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p=0.005), LuBCAM (%ret: p=0.0001; MFIret: p<0.0001; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p<0.0001) e CD58 (%ret: p=0.007; MFIret: p=0.006; %eryt: p=0.003; MFIeryt: p=0.0004), although cell adhesion has been decreased in splenectomized HS patients. In the comparison between diseases, HS patients with spleen showed higher cell adhesion frequency compared to SCA, notably in relation to LuBCAM (%ret: p=0.0008; MFIret: p=0.03; %eryt: p<0.0001; MFIeryt: p=0.0002), CD58 (%ret: p=0.0009; %eryt: p=0.003) and CD44 (%ret: p=0.009; %eryt: p<0.003). However, SCA samples without splenic function had higher cell adhesion expression for CD147 (%ret: p=0.006; MFIret: p=0.02; %eryt: p=0.02), LuBCAM (%ret: p=0.004; MFIret: p<0.0001), CD36 (%ret: p=0.0002; MFIret: p=0.01), CD242 (%ret: p=0.0008; %eryt: p=0.05) and CD49d (%ret: p=0.04). Concerning the in vitro Adhesion Assay, in the spleen absence, SCA RBCs showed greater adhesiveness to laminin than SCA RBCs with preserved splenic function did at all shear stress flow rates applied (0.5 dyne/cm2: p=0.01, 1 dyne/cm2: p=0.02, 2 dynes/cm2: p=0.03, 3 dynes/cm2: p=0.03, 5 dynes/cm2: p=0.04 and 7 dynes/cm2:p=0.03). Especially, reticulocytes from patients without spleen showed higher adhesiveness to HMEC-1 at low shear stresses (1 dyne/cm2) in both diseases (SCA: p=0.03; HS: p=0.03). Finally, reticulocytes showed greater adhesion ability to endothelial cells in SCA subjects than in HS patients, with (0.5 dyne/cm2: p=0.04 and 1 dyne/cm2: p=0.03) or without spleen (0.5 dyne/cm2: p=0.02, 2 dynes/cm2: p=0.01, 3 dynes/cm2: p=0.03, 5 dynes/cm2: p=0.02 and 7 dynes/cm2: p=0.03). Our results indicate that although both diseases belong to the Hemolytic Anemias group, SCA and HS distinct pathophysiologies and clinical evolution lead to different immunophenotypic patterns of cell adhesion expression. In SCA, the absence of splenic function may have a direct relation with the increase of SCA RBCs proadhesive phenotype and adhesiveness, which brings serious clinical consequences to the patients, whereas in HS without spleen, in general, cellular adhesion events are minimized, although they still present adhesive circulating reticulocytes and erythrocytes after splenectomy.

Erythropoietin is a glycoprotein which stimulates the erythropoiesis, clinically used for the treatment of renal anaemia. The biological and chromatographic methods for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products were validated in the present work. The normocythaemic mice bioassay was carried out in female BALB/c strain, with multiple injections schedule and reticulocytes counted by automated flow cytometry. The dose-response curve was linear (r2=0.9708) in the concentration range of 1 to 64 IU/mL. A reversed-phase liquid chromatography method (RP-LC) was developed and validated using a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase A consisted of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and mobile phase B consisted of 0.08% TFA:acetonitrile (30:70, v/v), run in linear gradient: 0.1-60 min, 0.1-100% of B at flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained within 60 min and it was linear (r2=0.9997) in the concentration range of 10-150 μg/mL. The procedures were validated evaluating parameters such as, the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, and limit of quantitation, as well as, the limit of detection evaluated in the validation of the chromatographic method. The methods were applied for the potency evaluation of the alfa and beta rhEPO in pharmaceutical products, which were analysed by the chromatographic method and compared to the bioassay showing mean differences between the estimated potencies of 11.2% higher for the RP-LC. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.