ABSTRACT PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HEXOKINASE ISOENZYMES FROM Rhizopus oryzae Dedeoglu, Didem MS., Department of Biotechnology Supervisor: Prof.Dr. Haluk Hamamci Co-supervisor: Dr. Seyda A&ccedil / ar February 2007, 116 pages Glycolysis is the central metabolic pathway for living organisms. Its regulation is important for the yield of the end products which are industrially important. These end products, like lactic acid produced by Rhizopus oryzae, are industrially important. Rhizopus oryzae is a filamentous fungus producing lactic acid and ethanol. The lactic acid yield of R. oryzae is low (&amp / #61566 / 70 %) compared to that of lactic acid bacteria (&amp / #61502 / 95 %) still it is noteworthy because R. oryzae produces only the L (+) form of lactic acid which can be metabolized in the human body. The yield of an industrial process should be high for the feasibility of the production of a particular product. If a way can be found increase the flux through the glycolysis the yield of lactic acid may increase as well. Keeping this in mind we wanted to focus on the first step of glycolysis, hexokinase of R. oryzae. Hexokinase catalyzes the reaction that converts glucose to glucose-6-phosphate. In this study for the first time the two isoenzymes of hexokinase of R. oryzae were purified and characterized by biochemically and kinetically Hexokinase has two isoenzymes. The purified enzymes (isoenzymes1 &amp / isoenzymes2) obeyed Michealis-Menten Kinetics. The Km value of purified isoenzyme 1 is 0.16 mM and isoenzyme 2, 0.21 mM at pH 7.70 for glucose. The Km value of isoenzyme1 for fructose was 28.8 mM. Essentially isoenzyme 2 can not utilize fructose. None of the isoenzymes were inhibited by trehalose-6-phophate.The monomer moleculer weight of isoenzymes were estimated SDS PAGE analysis. There were two different values for molecular weight of isoenzmye 1 / 62.9 and 42.5 kDa and two values for isoenzyme 2 / 56.2 and 41.6 kDa

Rhizopus oryzae is a filamentous fungus, which can produce high amounts of L(+)-lactic acid and produces ethanol as the main by-product. In an effort to understand the pyruvate branch point of this organism, fermentations under different inoculum and glucose concentrations were carried out. At low inoculum size (1x103 spores ml-1), high amount of lactate (78 g l-1) was produced, whereas high ethanol concentration (37 g l-1) was obtained at high inoculum sizes (1x106 spores ml-1). Decreasing working volume increased lactate production significantly at high inoculum sizes (1x105 and 1x106 spores ml-1), but did not influenced the physiology at low inoculum sizes (1x103 and 1x104 spores ml-1). In shake flask cultures, at low initial glucose concentrations biomass yield was high and lactate and ethanol yields were low. Higher lactate and ethanol and lower biomass yields were obtained by increasing the initial glucose concentrations. In alginate immobilized, semi-continuous cultures with cell retention, glucose level in the medium was kept at low values. Like in shake flask cultures, as the glucose concentration decreased lactate and ethanol yields decreased and biomass yields increased. Increasing the glucose concentration by a pulse of glucose caused increases in branch point enzyme activities, as well as in concentrations of the metabolites. In fed batch cultures higher biomass yield (0.25 g DCW g glucose-1) could be obtained. Lactate dehydrogenase was influenced by the inoculum size and glucose concentration more than pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase. It showed higher activity at lactate producing fermentations. Unlike lactate dehydrogenase, pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase showed high activity even at low glucose concentrations.

Rhizopus oryzae is a prominent strain for producing fumarate, where biomass growth precedes fumarate production. The natural bio film growth of R. oryzae as fungal mat was investigated using different glucose addition strategies in a novel fed-batch fermenter. Batch growth was compared through three fed-batch runs, each with a different glucose addition strategy. The fed-batch runs involved a constant glucose feed (CGF) of 0.075 g h-1 and controlled glucose feeds in order to keep the respiration quotient (RQ) at either 1.3 mol CO2 mol-1 O2 (RQ1.3) or 1.1 mol CO2 mol-1 O2 (RQ1.1). Ethanol overflow via the established Crabtree mechanism was completely negated for the CGF and RQ1.1 runs, while the batch and RQ1.3 runs exhibited significant ethanol formation. Biomass yield on glucose was found to be 0.476 g g-1 (RQ1.1), 0.194 g g-1 (RQ1.3), 0.125 g g-1 (CGF) and 0.144 g g-1 (batch). The results indicate a three-fold improvement in biomass yield when comparing the batch run with the RQ1.1 run. In addition, the RQ1.1 run resulted in zero detectable byproducts, unlike the batch scenario where pyruvate and fumarate were associated with ethanol formation. Clear evidence is provided that glucose overflow can be fully eliminated during R. oryzae growth, significantly affecting the biomass yield on glucose. / Dissertation (MEng (Chemical Engineering))--University of Pretoria, 2021. / University of Pretoria postgraduate bursary / CSIR Inter-bursary Programme / Chemical Engineering / MEng (Chemical Engineering) / Unrestricted

Le manioc (Manihot esculenta Crantz) est une plante, dont les tubercules servent de nourriture de base pour près de 800 millions de personnes sous les tropiques. Malgré sont importance, ce tubercule présente deux inconvénients majeurs qui limitent leur utilisation en alimentation humaine : Une toxicité liée à la présence de composés cyanés, et une faible teneur en protéines. Dans l'optique de lever ces contraintes, plusieurs procédés de transformation ont étés mis au point par l'expérience des populations et des améliorations ont été apportées par la recherche. La plupart de ces procédés incluent une étape critique de fermentation spontanée. Cette étape présente quelques problèmes dus à sa dépendance vis à vis des microorganismes épiphytes. Ces problèmes sont notamment la présence de quantités résiduelles de composés cyanés non négligeables (100 à 170ppm) un temps de ramollissement très long (4 à 5 jours) et des produits dérivés de qualités nutritionnelles et hygiéniques douteuses. Dans l'optique d'améliorer ces procédés traditionnels de rouissage du manioc cyanogène, une centaine de microorganismes ont été isolés des cossettes de manioc séché, sur la base de leurs potentialités à produire la β-glucosidase, l'α-amylase, la pectine hydrolase et la polygalacturonase. Ces enzymes sont les plus impliqués dans les phénomènes biochimiques et physico-chimiques ayant lieu au cours du rouissage du manioc. Ils sont responsables de la dégradation des composés cyanés et du ramollissement des tubercules par dégradation des pectines qui constituent le squelette du tubercule. 60% des microorganismes isolés et identifiés ont été productrices d'α-amylases, 46% de β-glucosidase, et 36%de pectinases. Les capacités des différentes souches sélectionnées à produire ces principaux enzymes, ont ensuite été évaluées. Parmi ces microorganismes, deux se sont avérés particulièrement intéressantes : Une souche de bactérie lactique identifiée comme étant Lactobacillus plantarum avec une activité α-amylase de l'ordre de 17000±100UE/ml, et une activité ß-glucosidase de 2000±300µmol CN-/mn; Une moisissure identifiée comme étant Rhizopus oryzae à activité α-amylase de 20000±500UE/ml et activité pectine hydrolase de 2,3±0,2 µmol COO-/mn/mg. Ces deux souches ont été sélectionnées et utilisées comme ferments en culture mixte avec une biomasse initiale de 106ufc/g manioc frais de Lactobacillus plantarum et 103spores/g manioc frais de Rhizopus oryzae pour la fermentation des tubercules de manioc. Les résultats obtenus ont indiqué une acidification rapide avec un pH avoisinant 3,5±1 après 24 heures de rouissage, un ramollissement plus rapide (12±3mm/5s après 48 heures de rouissage). Mais le rouissage naturel s'est avéré meilleur du point de vue dégradation des composés cyanés. En effet la très forte acidification obtenue avec le ferment dès la 24eme heure, a provoqué un blocage du processus de dégradation des glucosides cyanogénétiques au niveau de la cyanohydrine, composé par ailleurs aussi toxique que l'acide cyanhydrique. Une étude de l'influence de quelques paramètres externes nous ont permis de noter que la température optimale de croissance de Lactobacillus plantarum était de 40±5°C pour un pH optimal de 6 alors que Rhizopus oryzae avait une température optimale de croissance à 30±7°C et un pH optimal de 5. Les essais de production de biomasses, indiquent que le meilleur milieu de multiplication des germes s'est avéré être le milieu CTM de Law et al., avec pour substrat de la farine de son de manioc mélangée au milieu nutritif de Meyer.<br />Dans l'optique de mettre à la disposition des populations ce ferment, des essais de conservation des souches par séchage ont indiqué que le fluide de protection indiqué pour avoir des taux de survies acceptables au terme du séchage était le glycérol, alors que le support le plus adapté a été l'amidon de manioc. On a ainsi obtenu plus de 75±5% de survivants après séchage sur lit convectif à une température de 35°C sous un débit d'air de 10 m3/h pour tous les deux germes. Ce ferment composé de Lactobacillus plantarum (106ufc/g) et Rhizopus oryzae (103spores/g), sur support amidon a induit contrairement aux microorganismes frais, une diminution effective du taux de glucosides totaux résiduels (5% en fin de rouissage) diminution corollaire à l'ajout du NaOH réalisé après la 24ème heure, afin de contourner l'effet néfaste du pH acide sur la dégradation de la cyanohydrine.

Rhizopus oryzae is a filamentous fungi which produces lactic acid and ethanol in fermentations. R. oryzae has numerous advantages for use industrial production of L-(+)-lactic acid but the yield of lactic acid produced on the basis of carbon consumed is low. Metabolic flux analysis of R. oryzae has shown that most of the pyruvate produced at the end of the glycolysis is channelled to ethanol, acetyl-CoA and oxaloacetate production. This study aimed to answer some questions addressed on the regulation of pyruvate branch point in R. oryzae and for this purpose biochemical characterisation of the enzymes acting at this branch point and cloning the genes coding for these enzymes have been done. Pyruvate decarboxylase was purified and characterised for the first time from R. oryzae. The purified enzyme has a Hill coefficient of 1.84 and the Km of the enzyme is 8.6 mM for pyruvate at pH 6.5. The enzyme is inhibited at pyruvate concentrations higher than 30 mM. The optimum pH for enzyme activity shows a broad range from 5.7 and 7.2. The monomer molecular weight was estimated as 59&plusmn / 2 kDa by SDS-PAGE analysis. Pyruvate decarboxylase (pdcA and pdcB) and lactate dehydrogenase (ldhA and ldhB) genes of R. oryzae have been cloned by PCR-cloning approach and the filamentous fungi Aspergillus niger was transformed with these genes. The A. niger transformed with either of the ldh genes of R. oryzae showed enhanced production of lactic acid compared to wild type. Citric acid production was also increased in these transformants while no gluconate production was observed Cloning of hexokinase gene from R. oryzae using degenerate primers was studied by the use of GenomeWalker kit (Clontech). The results of this study were evaluated by using some bioinformatics tools depending on the unassembled clone sequences of R. oryzae genome.

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