Spelling suggestions: "subject:"ribozyme.""
21 |
Atypische pleiotrope Zytostatikaresistenz (Multidrug-Resistenz) humaner TumorzellenLage, Hermann 04 December 2001 (has links)
Resistenzen von Tumoren gegenüber der Behandlung mit Chemotherapeutika stellen ein wesentliches Hindernis für eine erfolgreiche Therapie in der onkologischen Klinik dar. Ein Verständnis der biologischen Mechanismen auf molekularer Ebene, die zu diesen Resistenzphänomenen führen, ist daher von entscheidender Bedeutung, um Strategien zu entwickeln, die darauf zielen, eine Therapieresistenz zu überwinden. Um diesem Ziel näher zu kommen, wurden im Verlaufe dieser Arbeit verschiedene Modelle aus unterschiedlichen Tumoren entwickelt und analysiert, die im Zellkultursystem Chemoresistenzen von neoplastischen Geweben simulieren. In einem ersten Schritt wurden diese in vitro Systeme zellbiologisch hinsichtlich dem Vorhandensein von verschiedenen, aus der wissenschaftlichen Literatur bekannten Resistenzmechanismen, charakterisiert. Hierbei konnte neben der verstärkten Expression von ABC-Transportern, wie P-Glykoprotein (P-Gp), "Breast Cancer Resistance Protein" (BCRP) sowie "canalicular Multispecific Organic Anion Transporter" (cMOAT), eine intrazelluläre Kompartimentierung von Zytostatika, Modulation der Aktivität von DNA-Topoisomerasen II (Topo II) sowie Veränderungen in der Aktivität von DNA-Reparatursystemen, wie z.B. dem DNA-Mismatch Repair System (DMM) oder der O6-Methyguanin-Methytransferase (MGMT) in resistenten Zellen wiedergefunden werden. Die Aktivierung dieser Mechanismen reichte jedoch nicht aus, das komplexe Geschehen von unterschiedlichen Kreuzresistenzen in den Zellen zu erklären. Es wurde daher gezielt nach neuen Resistenzmechanismen gesucht. Dafür wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt: 1. Suche nach neuen Resistenz-assoziierten Faktoren auf Ebene der zellulären mRNA Expressionsprofile ("Transcriptomics"), sowie 2. Suche nach neuen Resistenz-assoziierten Faktoren auf Ebene der zellulären Proteinexpression ("Proteomics"). Mittels beider experimentellen Ansätze konnten mehrere Faktoren identifiziert werden, die potentiell neue Resistenzmechanismen in Tumorzellen vermitteln können. Für die Faktoren Glypican-3 (GPC3), DFNA5 und "Transporter associated with Antigen Presentation" (TAP) konnten funktionelle Analysen nachweisen, daß diese am Resistenzgeschehen beteiligt sind. Zur Überwindung von Chemoresistenzen, wurde neben dem Einsatz konventioneller chemischer Substanzen, eine gentherapeutische Strategie, die Ribozymtechnologie, gewählt. In dieser Arbeit wurden Ribozyme gegen GPC3 sowie die ABC-Transporter BCRP und cMOAT entwickelt. / Resistance to antitumor chemotherapy is a common problem in patients with cancer and a major obstacle to effective treatment of disseminated neoplasms. An understanding of the molecular mechanisms leading to these resistance phenomena is of vital interest to develop strategies to overcome therapy resistance in clinics. In order to gain further insides into the biological mechanisms mediating drug resistance, in this study various cell culture models derived from different origins were established and analyzed in detail. At first, these in vitro models were investigated concerning the activity of drug resistance mechanisms that were described in the scientific literature previously. By this approach the enhanced expression of the ABC-transporters P-glycoprotein (P-gp), "breast cancer resistance protein" (BCRP) and "canalicular multispecific organic anion transporter" (cMOAT) could be observed. In addition, an intracellular compartmentalization of the antineoplastic agents, a modulation of the activities of DNA-topoisomerases II (Topo II), and altered activities of DNA-repair systems, such as the DNA-mismatch repair system (DMM) or O6-methyguanine methyltransferase (MGMT) were detected. However, since the activation of these mechanisms do not explain all of the cross resistance pattern observed in these cell systems, other additional mechanisms must be operating in the drug-resistant cells. In order to identify potential new molecular mechanisms involved in drug resistance, in this study two different experimental strategies were performed: 1. Search of new resistance-associated factors on the level of the cellular mRNA expression profiles ("transcriptomics"), and 2. Search of new resistance-associated factors on the level of cellular protein expression ("proteomics"). By applying both experimental strategies, several cellular factors could be identified that potential play a role in drug resistance of tumor cells. Functional evidence was provided for glypican-3 (GPC3), DFNA5 and "transporter associated with antigen presentation" (TAP) to be involved in drug-resistant phenotypes. To overcome drug resistance, a gene therapeutic approach, a hammerhead ribozyme-based technology, was developed. In this study various ribozymes directed against GPC3 and the ABC-transporters BCRP and cMOAT were constructed.
|
22 |
Μελέτες επί της τροποποίησης της ενζυμικής δραστικότητας του ριβοενζύμου ριβονουκλεάση Ρ / Studies on the modification of the enzymatic activity of the ribozyme ribonuclease PΤουμπέκη, Χρυσαυγή 28 May 2013 (has links)
Η RNase P είναι το ένζυμο που ωριμάζει το 5΄ άκρο των πρόδρομων μορίων tRNA, ενώ έχει βρεθεί και στις τρεις φυλογενετικές περιοχές, καθώς και σε υποκυτταρικά οργανίδια. Είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικής φύσεως στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ έχουν βρεθεί και ένζυμα RNase P αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η υπομονάδα RNA των βακτηριακών ολοενζύμων είναι καταλυτικά ενεργή απουσία πρωτεϊνικών παραγόντων in vitro, καθιστώντας την ένα πραγματικό ριβοένζυμο. Η ικανότητα της RNase P να αναγνωρίζει συγκεκριμένες δομές στα μόρια των υποστρωμάτων της και όχι αλληλουχίες, δημιούργησε τη δυνατότητα χρήσης αυτού του ενζύμου ως ενός μοριακού εργαλείου για τη στόχευση πολλών ιικών και παθολογικών μορίων RNA in vitro και in vivo, καταστέλλοντας την έκφραση των μορίων αυτών, μέσω της τεχνολογίας των μορίων EGS (external guide sequence) και των ριβοενζύμων M1GS.
Η RNase P, σύμφωνα με πολλές μελέτες, έχει δειχθεί ότι αποτελεί στόχο πολλών φαρμακευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων πολλών γνωστών αντιβιοτικών, οι οποίοι κατά κύριο λόγο αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Πρόσφατα δείχτηκε, μέσω αναλυτικής κινητικής μελέτης, ότι ένα μακρολίδιο, η σπιραμυκίνη, ενεργοποιεί σημαντικά τη δραστικότητα της βακτηριακής RNase P και του M1 RNA κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, λειτουργώντας έτσι ως μη-ειδικός ενεργοποιητής μικτού τύπου. Μέχρι σήμερα, στη διεθνή βιβλιογραφία, δεν έχει αναφερθεί άλλη ουσία η οποία προκαλεί θετική επίδραση στη δραστικότητα της RNase P. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της δραστικότητας της βακτηριακής RNase P και αποκαλύφθηκε ότι η σπιραμυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ιοντικούς δεσμούς με το μόριο Μ1 RNA, αλλά προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης στο δομικό στοιχείο P10/11 του ριβοενζύμου. Το δομικό αυτό στοιχείο εμπλέκεται στην αναγνώριση του υποστρώματος, αποτέλεσμα το οποίο έρχεται σε συμφωνία με τις τιμές KD που προσδιορίστηκαν για το σύμπλοκο ριβοενζύμου–υποστρώματος, απουσία και παρουσία σπιραμυκίνης.
Με δεδομένο ότι η σπιραμυκίνη δεν επηρεάζει την πρωτεϊνοσύνθεση ή τη δραστικότητα της RNase P των ευκαρυωτικών κυττάρων, κατασκευάστηκε ένα ριβοένζυμο M1GS, ώστε να ελεγχθεί η επίδραση του αντιβιοτικού στη δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293. Ως στόχος του συγκεκριμένου M1GS, επιλέχτηκε ο μεταγραφικός παράγοντας Ets2 λόγω της μεγάλης κλινικής σημασίας του, εφόσον έχει συσχετιστεί με αρκετούς τύπους καρκίνου και παθολογικές καταστάσεις, καθώς και με διαδικασίες διαφοροποίησης. Ο σπουδαίος ρόλος του Ets2, σε συνδυασμό με τα ελλιπή δεδομένα σχετικά με την έκφρασή του, είχαν αποτρέψει μέχρι σήμερα την αποτελεσματική στόχευσή του με τη χρήση των υπαρχουσών μεθοδολογιών που βασίζονται στο RNA, όπως το RNAi.
Μετά από ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του Ets2 mRNA, σχεδιάστηκαν δύο οδηγοί αλληλουχίες. Οι αλληλουχίες αυτές, αρχικά, δοκιμάστηκαν ως εξωτερικές οδηγοί αλληλουχίες (EGS) σε συνδυασμό με το βακτηριακό ολοένζυμο της RNase P. Η EGS303 (το νούμερο υποδεικνύει το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο του στόχου που δρα η RNase P), εμφάνισε τη μεγαλύτερη ικανότητα να επάγει τη δράση της RNase P in vitro. Η οδηγός αυτή αλληλουχία, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο 3΄ άκρο του M1 RNA, παράγοντας το ριβοένζυμο M1GS303, το οποίο είναι δραστικό έναντι του μορίου–στόχου του in vitro. Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ριβοενζύμου ενεργοποιείται εντυπωσιακά κατά 160% παρουσία σπιραμυκίνης. Προκειμένου να ελεγχθεί η δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, το μόριο–στόχος και το ριβοένζυμο εκφράστηκαν ελεγχόμενα σε κύτταρα E. coli, προκαλώντας μείωση της έκφρασης του μορίου–στόχου από το M1GS303 κατά 95% μετά από 12 ώρες έκφρασης των μορίων. Μείωση στα ίδια επίπεδα ανιχνεύτηκε μόλις μετά από 4 ώρες έκφρασης εφόσον στα κύτταρα είχε προστεθεί σπιραμυκίνη, γεγονός που υποστηρίζει την εντυπωσιακά θετική επίδραση της σπιραμυκίνης επί της δραστικότητας του ριβοενζύμου.
Η ίδια σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με έκφραση του ριβοενζύμου σε HEK293 κύτταρα. Η δραστικότητα του ριβοενζύμου προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά, από την έκφραση της χιμαιρικής φθορίζουσας πρωτεΐνης Ets2–EGFP (μόριο–στόχος), σε διαφορετικούς χρόνους έκφρασης. Παρατηρήθηκε ότι το M1GS δρα αποτελεσματικά έναντι του μορίου–στόχου του και σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vivo, προκαλώντας μείωση στην έκφραση του Ets2, η οποία αυξάνεται επιπλέον παρουσία σπιραμυκίνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σημαντική ενεργοποίηση της δραστικότητας του M1GS σε ανθρώπινα κύτταρα και καθιστούν τη σπιραμυκίνη ένα σημαντικό ενεργοποιητή στη χρήση των ριβοενζύμων M1GS ως εργαλεία γονιδιακής αποσιώπησης. Ο συνδυασμός βελτιωμένων ριβοενζύμων M1GS με την παρουσία σπιραμυκίνης αυξάνει ακόμα περισσότερο την πρακτική χρήση της συγκεκριμένης τεχνολογίας τόσο in vitro όσο και in vivo, επιτυγχάνοντας ακόμα πιο αποτελεσματική αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης. / RNase P is the enzyme that endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. It has been found in all three phylogenetic domains of life, as well as in subcellular organelles. In most cases, it has been described as a ribonucleoprotein complex. However, few RNase P enzymes that are exclusively proteinaceous have been also reported recentrly. The RNA subunit of bacterial holoenzyme is catalytically active in the absence of protein factors in vitro, making it a true ribozyme. The ability of RNase P to recognize specific structures in its substrate molecules instead of specific sequences, allowed the use of this enzyme as a molecular tool for targeting pathological and viral RNA molecules in vitro and in vivo, by suppressing gene expression through the technology of EGS (external guide sequence) and M1GS ribozymes.
RNase P, according to numerous studies, has been the target of several pharmaceutical agents, including most of the mainstream antibiotics. It has been shown recently, through analytical kinetic studies that the macrolide spiramycin significantly enhances the activity of bacterial RNase P and M1 in a dose dependent manner, acting as a non-specific mixed-type activator. Until now, no other compound has been reported to induce a positive effect on RNase P activity. In the present study, the enhancement of bacterial RNase P activity by spiramycin was tested initially, and it was revealed that spiramycin does not interact with the M1 RNA molecule through ionic bonds. On the contrary, it induces a conformational change of the P10/11 structural element of M1 RNA, which is mainly responsible for substrate recognition. The above results are in agreement with the KD values determined for the ribozyme-substrate complex, in the absence or in the presence of spiramycin.
Since spiramycin does not affect eucaryotic protein synthesis or eucaryotic RNase P activity, an M1GS ribozyme was constructed, in order to examine the effect of spiramycin on the ribozyme activity in vivo, using human HEK293 cells. The target of this M1GS was the transcription factor Ets2, a factor with great clinical importance, since it has been associated with several types of cancer and disease, as well as essential processes during differentiation. The important role of Ets2 in combination with the lack of data on Ets2 expression, had hitherto prevented its effective targeting by using the existing methodologies based on RNA, such as RNAi.
After analysis of the secondary structure of Ets2 mRNA, two guide sequences were designed. These sequences were originally tested in trans as external guide sequences (EGS), in combination with the bacterial RNase P. The EGS303 (the number indicates the nucleotide residue cleaved by RNase P), showed an ability to induce RNase P activity in vitro. The guide sequence was then cloned and fused into the 3' end of M1 RNA ribozyme, thus producing the M1GS303 ribozyme, which was found to be effective against the target molecule. The activity of this specific ribozyme is impressively enhanced by 160% in the presence of spiramycin. In order to examine the activity of this ribozyme in vivo, the expression of the target molecule and the ribozyme were induced in E. coli cells. After 12 hours of expression, a reduced level of the target molecule was detected, because of the M1GS303 activity (about 95%). Reduction to similar levels was observed after only 4 hours from the induction of both molecules expression, in the presence of spiramycin. This observation strongly supports spiramycin’s striking positive effect on the ribozyme activity.
The same set of experiments was repeated in human HEK293 cells. The activity of the ribozyme was determined qualitatively and quantitatively, by the determination of the expression of the chimeric fluorescent protein Ets2-EGFP (target molecule) at different times of expression. The M1GS ribozyme cleaves efficiently the target molecule in human cells as well in vivo, resulting in a reduction in the expression of Ets2, which is further increased in the presence of spiramycin. This result indicates the significant activation of M1GS activity in human cells, making spiramycin an important activator in using M1GS ribozymes as tools in gene silencing. The combination of improved M1GS ribozymes in the presence of spiramycin, further increases the practical utilization of this technology both in vitro and in vivo, thus achieving an even more effective suppression in gene expression.
|
23 |
Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός γονιδίων που κωδικοποιούν υπομονάδες του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της ριβονουκλεάσης Ρ από το μυξομύκητα Dictyostelium discoideum - ένα ένζυμο κλειδί στη βιογένεση του tRNAΚαλαβριζιώτη, Δήμητρα 18 February 2009 (has links)
Η ριβονουκλεάση Ρ (RNase P) είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο, απολύτως απαραίτητο για την βιωσιμότητα του κυττάρου, καθώς είναι υπεύθυνο για την ωρίμανση του 5΄ άκρου των προδρόμων μορίων tRNA. Δραστικότητα RNase P έχει απομονωθεί από όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα και από τις τρεις φυλογενετικές περιοχές (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες), όπως επίσης και από τα ημιαυτόνομα υποκυτταρικά οργανίδια, μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες [Frank και Pace 1998, Xiao et al. 2002]. Το ένζυμο αυτό διαθέτει μια RNA υπομονάδα απαραίτητη για την κατάλυση ενώ ο αριθμός των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο ποικίλλει από μια στα βακτήρια έως και δέκα στην RNase P του ανθρώπου [Frank και Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. Η RNA υπομονάδα από τα Βακτήρια και ορισμένα Αρχαία παρουσιάζει καταλυτική δραστικότητα απουσία πρωτεϊνών in vitro, σε υψηλή ιοντική ισχύ [Guerrier-Takada et al. 1983, Pannucci et al. 1999]. Παρότι μέχρι στιγμής καμία τέτοια ιδιότητα δεν έχει εντοπιστεί σε ευκαρυωτική RNA υπομονάδα, πιστεύεται ότι στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα ριβοένζυμο [Frank et al. 2000].
Η RNase P από το Dictyostelium discoideum είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο που αποτελείται από RNA και πρωτεϊνικές υπομονάδες οι οποίες είναι απαραίτητες για την δραστικότητα του ολοενζύμου. Η πυκνότητα επιπολής που υπολογίσθηκε για την RNase P από το D. discoideum είναι πολύ χαμηλή σε σχέση με τα χαρακτηρισμένα ολοένζυμα ευκαρυωτικής προέλευσης και είναι παρόμοια με αυτή ενός πρωτεϊνικού μορίου [Stathopoulos et al. 1995]. Παρότι έχει αποδειχθεί ότι το ολοένζυμο αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, πολύ λίγα είναι γνωστά για την ακριβή σύσταση του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου. Πρόσφατα εντοπίστηκε το γονίδιο της RNA υπομονάδας της RNase P από το D. discoideum μέσω συγκριτικής φυλογενετικής ανάλυσης, μήκους 369 νουκλεοτιδίων [Marquez et al. 2005]. Χρησιμοποιώντας τις πρωτεϊνικές υπομονάδες Rpp20 και Rpp40 της RNase P του ανθρώπου πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στη τράπεζα δεδομένων της αλληλούχισης του γενωμικού DNA του D. discoideum. Το αποτέλεσμα της αναζήτησης ήταν η εύρεση δύο ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης (drpp20 και drpp40) που κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες (DRpp20 και DRpp40) οι οποίες παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με τις υπομονάδες. Η επαγόμενη πρωτεΐνη DRpp20 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 26,4 KD, pI 5,6 και επιδεικνύει σημαντική ομοιότητα με την χαρακτηρισμένη πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp20 του ανθρώπου (34% ταυτότητα, 56% ομοιότητα σε μήκος 140 αμινοξέων). Όμοια, η πρωτεΐνη DRpp40 έχει προβλεπόμενο μοριακό βάρος 48,2 KD, pI 5,5 και παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με την πρωτεϊνική υπομονάδα Rpp40 (26% ταυτότητα, 45% ομοιότητα σε μήκος 302 αμινοξέων). Παρά την συνολική ομοιότητα, τα μοριακά βάρη των DRpp20 και DRpp40 διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με αυτά των ομόλογων πρωτεϊνών τους. Η DRpp20 διαθέτει μια περιοχή χαμηλής πολυπλοκότητας, πλούσια σε κατάλοιπα θρεονίνης, γλουταμίνης και λυσίνης που πιθανόν να συνεισφέρει στο επιπλέον μοριακό βάρος όπως φαίνεται από την στοίχιση με το Clustal W. Τόσο οι επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων γενωμικών περιοχών όσο και οι περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας σε επίπεδο πρωτεΐνης υπάρχουν σε αφθονία στο D. discoideum [Eichinger et al. 2005] και παραμένει να αποδειχτεί εάν αυτά τα χαρακτηριστικά συνεισφέρουν δομικά ή λειτουργικά στις DRpp. Από βιοπληροφορική ανάλυση προκύπτει ότι καμία από τις υπομονάδες των Αρχαίων ή τις εννέα υπομονάδες της ζύμης δεν παρουσιάζει ομοιότητα με τις DRpp20 και DRpp40.
Επιπρόσθετα, με την βοήθεια του Pfam αλλά και των προγραμμάτων που συνδέονται με τον MetaServer εντοπίσαμε στην περιοχή 56-126 αμινοξέα της πρωτεΐνης DRpp20 το δομικό μοτίβο των Alba πρωτεϊνών. Η μελέτη των δύο πρωτεϊνών με βάση τον αλγόριθμο PSORT υποδεικνύει ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα για χωροθέτηση στον πυρήνα παρά σε οποιοδήποτε άλλο υποκυτταρικό διαμέρισμα.
Στην παρούσα εργασία τα υπό μελέτη γονίδια drpp20 και drpp40 κλωνοποιούνται σε φορέα υπερέκφρασης pET-29 και εισάγονται σε δεκτικά κύτταρα BL21(DE3)pLysS. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες απομονώνονται από το κυτταρικό εκχύλισμα με χρωματογραφία συγγενείας σε στήλη νικελίου. Οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 με την μέθοδο που απομονώνονται παραλαμβάνονται σχεδόν στην φυσική τους μορφή όπως προκύπτει και από τα φάσματα του κυκλικού διχρωϊσμού. Οι πρωτεΐνες αυτές χρησιμοποιούνται για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων καθώς επίσης και για λειτουργικές μελέτες οι οποίες περιγράφονται παρακάτω.
Όπως αποδεικνύεται οι πρωτεΐνες DRpp20 και DRpp40 αποτελούν τμήματα του μακρομοριακού συμπλόκου της RNase P. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ανιχνεύουν μία ζώνη που συνεκλούεται με την δραστικότητα του ολοενζύμου σε ανάλυση κατά Western. Επιπρόσθετα, η ισχύς αυτής της αλληλεπίδρασης επιτρέπει την κατακρήμνιση καταλυτικά δραστικού ενζύμου με την χρήση των πολυκλωνικών αντισωματών anti-DRpp20 και anti-DRpp40.
Μεταξύ των πρωτεϊνών και της RNA υπομονάδας καθώς επίσης του tRNA υποστρώματος αναμένεται να υπάρχουν αλληλεπιδράσεις RNA πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκε η ικανότητα των πρωτεϊνών DRpp20 και DRpp40 να αλληλεπιδρούν με μόρια RNA και ιδιαίτερα με μόρια tRNA. Σε μία σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν δοκιμάστηκαν μόρια tRNA, ολικό RNA αλλά και πλασμιδιακό DNA χωρίς όμως κάποιο αποτέλεσμα στις συνθήκες που πραγματοποιήθηκε η αντίδραση, παρότι άλλες πρωτεΐνες που φέρουν το μοτίβο των Alba πρωτεϊνών έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με μόρια DNA ή δίκλωνα τμήματα RNA.
Τέλος, για τις DRpp20, DRpp40 αλλά και το ολοένζυμο, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για δραστικότητα ΑΤΡασης κυρίως εξαιτίας της ομολογίας της πρώτης με την Rpp20 του ανθρώπου που διαθέτει τέτοια ιδιότητα, χωρίς να ανιχνεύεται μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης σημαντική ομολογία με αντίστοιχα ένζυμα. Στις συνθήκες που δοκιμάστηκαν δεν ανιχνεύτηκε δραστικότητα ΑΤΡασης που να σχετίζεται με κάποια από τις δύο πρωτεΐνες ή το ολοένζυμο.
Ο απώτερος στόχος μας είναι ο προσδιορισμός της ελάχιστης λειτουργικής δομής καθώς και η χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και RNA-πρωτεΐνης στο ολοένζυμο της RNase P. Η ολοκλήρωση της μελέτης θα συμβάλλει στην κατανόηση του καταλυτικού μηχανισμού και της εξέλιξης της ριβονουκλεάσης Ρ από ένα αρχέγονο ριβοένζυμο σε ένα υψηλά οργανωμένο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο. / Ribonuclease P (RNase P) is a ubiquitous and essential ribonucleoprotein enzyme that matures the 5´ end of all primary tRNA transcripts. It has been studied from a variety of organisms, representing the three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya), as well as from the major subcellular organelles, mitochondria and chloroplasts [Frank and Pace 1998, Xiao et al. 2002]. RNase P enzymes contain a similar in size RNA subunit which is absolutely required for catalysis. However, the size and number of protein subunits of the holoenzyme varies significantly, from one small subunit in bacteria to ten subunits in human RNase P [Frank and Pace 1998, Chamberlain et al. 1998, Jarrous 2002]. The RNA subunit from bacteria and some archaea is catalytically active in vitro in high ionic strength and in the absence of the protein fraction of RNase P [Guerrier-Takada et al.1983, Pannucci et al. 1999]. No such activity has been proven yet for eukaryotic RNA subunit but is still considered to be intrinsically a ribozyme [Frank et al. 2000].
Dictyostelium discoideum RNase P holoenzyme is a ribonucleoprotein complex, consisted of RNA and proteins essential for catalytic activity. Considering its buoyant density, D. discoideum RNase P exhibits one of the most proteinaceous idiosyncrasies, among the characterized holoenzymes of eukaryotic origin [Stathopoulos et al. 1995]. Although it has been established that this enzyme contains both RNA and protein components, very little is known on the exact composition of the ribonucleoprotein complex. A recent report identified a putative RNA subunit of D. discoideum RNase P of length of 369 nucleotides through phylogenetic comparative analysis [Marquez et al. 2005].
Genomic analysis of the available data from D. discoideum sequencing projects, revealed among others the existence of two open reading frames (drpp20 and drpp40) encoding two proteins (DRpp20 and DRpp40) that show significant similarity to previously characterized proteins subunits Rpp20 and Rpp40 from human RNase P. The encoded protein DRpp20 has a predicted molecular mass of 26,4 KD, pI 5,6 and exhibits significant similarity to characterized human RNase P protein subunit, Rpp20 (34% identity, 56% similarity at a length of 140 amino acids). Likewise, the protein DRpp40 of a predicted mass of 48,2 KD and pI 5,5, displays significant similarity to its human counterpart, Rpp40 (26% identity, 45% similarity at a length of 302 amino acids). DRpp20 harbors a region of low complexity (rich in threonine residues) which confers to higher MW in comparison with the human homologue. Such regions have not been encountered so far in proteins of this kind in other organisms. Tandem repeats at the genomic and the protein level, are abundant in D. discoideum [Eichinger et al. 2005] and it remains to be proven if these features contribute to the structure and function of DRpp proteins. To the best of our knowledge no homologues of DRpp20 and DRpp40 have been identified in yeast and archaeal RNase P enzymes.
Additionally, pattern search of the D. discoideum protein sequences using MetaServer and Pfam prediction tools identified a DRpp20 region (amino acids 56 to 126) that bears similarity to the Alba domain. PSORT analysis of DRpp20 and DRpp40 predicts that these proteins are likely to localise into the nucleus.
In this study the putative ORFs were subcloned into pET-29 expression vector and the recombinant vectors were used for the transformation of BL21(DE3)pLysS. The recombinant polypeptides were purified from the cell extract using Ni2+-nitriloacetic acid agarose column. The purified proteins are isolated in their native form as supported by circular dichroism analysis of the preparations. These preparations were used for the production of polyclonal antibodies as well as functional studies as described below.
DRpp20 and DRpp40 are functionally associated with the RNase P ribonucleoprotein catalytic complex. Using anti-DRpp20 and anti-DRpp40 polyclonal antibodies we ascertained the concurrence of DRpp20 and DRpp40 with purified RNase P activity after standard purification schemes. Moreover, the nature of this association permits the precipitation of RNase P activity through antigen-antibody interaction using the same antibodies.
RNA-proteins interactions between the protein subunits, the RNA moiety and/or the RNA substrate are expected in the holoenzyme complex, and therefore the ability of DRpp40 and DRpp20 to bind to RNA molecules was investigated. In a series of experiments using a variety of binding partners (plasmids, tRNAs and total RNA), we did not detect any DNA or RNA binding properties for DRpp20 and DRpp40, although other proteins that contain the Alba core interact with DNA or double stranded RNA regions.
Although neither DRpp20 nor DRpp40 harbours an ATPase domain, we tested DRpp40 and DRpp20 for ATPase activity mostly due to the latter homology with human Rpp20, which was shown to have ATPase activity. We could not detect any ATPase activity associated with aforementioned proteins or holoenzyme.
Our future prospects are the determination of minimal catalytic core and the complete mapping of all protein-protein and RNA-protein interactions within RNase P holoenzyme. The completion of this project will contribute in a decisive manner to the understanding of both the catalytic mechanism and the evolution of RNase P from a primordial ribozyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.
|
24 |
Μελέτες επί της δομής και της λειτουργίας του ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου της RNase P από το Dictyostelium discoideum / Studies on the structure and function of the ribonucleoprotein complex of Dictyostelium discoideum RNase PΒουρεκάς, Αναστάσιος 25 October 2007 (has links)
Η ριβονουκλεάση P είναι το ένζυμο το οποίο αναλαμβάνει την δημιουργία του 5´ ώριμου άκρου όλων των πρόδρομων μορίων tRNA. Πρόκειται για ένα ριβονουκλεο-πρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο εντοπίζεται στα κύτταρα των οργανισμών και από τις τρεις κύριες φυλογενετικές περιοχές, τα Βακτήρια, τα Αρχαία και τους Ευκαρυώτες. Αποτελείται από μια υπομονάδα RNA απαραίτητη για την κατάλυση, ενώ το μέγεθος και ο αριθμός των πρωτεϊνικών υπομονάδων ποικίλλει από μια μικρή στα βακτήρια έως δέκα πρωτεΐνες στο ολοένζυμο που απομονώνεται από τα ανθρώπινα κύτταρα. Η υπομονάδες RNA των βακτηρίων καθώς επίσης και μερικών αρχαίων μπορούν να καταλύσουν την αντίδραση ωρίμανσης του tRNA απουσία της πρωτεΐνης in vitro, είναι δηλαδή ριβοένζυμα. Η ανακάλυψη αυτή διεύρυνε τις αντιλήψεις μας για τις ιδιότητες των βιομορίων και επανέφερε στο προσκήνιο την θεωρία του κόσμου του RNA. Στο ευκαρυωτικό ριβοένζυμο, ο ρόλος των πρωτεϊνών είναι πιο ουσιαστικός, καθώς η υπομονάδα RNA φαίνεται ότι χάνει μεγάλο μέρος της λειτουργικής της ανεξαρτησίας. Η διαλεύκανση των λειτουργών της κάθε υπομονάδας θα δώσει σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη της RNase P από ένα αρχέγονο ένζυμο σε ένα πολύπλοκο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο.
Η RNase P από το Dictyostelium discoideum διαθέτει μια απαραίτητη για την δραστικότητα υπομονάδα RNA όπως και όλα τα ένζυμα αυτού του είδους. Παράλληλα διαθέτει έντονο πρωτεϊνικό χαρακτήρα καθώς διαθέτει την χαμηλότερη πυκνότητα επιπολής σε σχέση με ένζυμα RNase P από άλλους οργανισμούς. Οι πληροφορίες αυτές προέρχονται από τον αρχικό χαρακτηρισμό του ενζυμικού συμπλόκου, και δεν παρέχουν στοιχεία για την ακριβή σύστασή του. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός ενός από τα γονίδια που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του Dictyostelium, ομόλογα προς χαρακτηρισμένα γονίδια από τον άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες. Το γονίδιο drpp30 κωδικεύει μια πρωτεΐνη 40.7 kDa, σημαντικά μεγαλύτερη από τις ομόλογες της. Η πρωτεΐνη DRpp30 υπερεκφράστηκε σε βακτηριακά κύτταρα, και μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό της χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Η συμμετοχή της DRpp30 στο μακρομοριακό σύμπλοκο της RNase P πιστοποιήθηκε με ανοσοβιοχημική προσέγγιση, ενώ η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη προσδένει τo pre-tRNA υπόστρωμα του ενζύμου, καθώς και την υπομονάδα RNA in vitrο. Το μοντέλο ομολογίας της DRpp30 βάσει της κρυσταλλικής δομής της ορθόλογης Ph1877 από τα αρχαία, φανερώνει ότι η πρωτεΐνη αποκτά τη δομή αβ βαρελιού (ΤΙΜ barrel fold).
Κατά τη διάρκεια της διατριβής, οι προσπάθειες για τον εντοπισμό του γονιδίου της RNA υπομονάδας ήταν σε εξέλιξη, όταν το εν λόγω γονίδιο αναγνωρίστηκε μέσω φυλογενετικών συγκρίσεων από την ομάδα του Norman Pace. Το μετάγραφο του γονιδίου εντοπίστηκε σε ενεργά κλάσματα RNase P, και παράλληλα εντοπίστηκε και ένα μικρότερο μετάγραφο του ίδιου γονιδίου. Προσδιορίστηκαν τα ακριβή 5´και 3´ άκρα των δύο αυτών μορίων και ακολούθησε κλωνοποίηση τους. Τα in vitro μετάγραφα των δύο κλωνοποιημένων αλληλουχιών μπορούν να υποκαθιστούν την ενδογενή RNA υπομονάδα του ολοενζύμου in vitro, ενώ δεν εντοπίστηκε έως τώρα ενζυμική δραστικότητα που να σχετίζεται με τα δύο αυτά μόρια. / Ribonuclease P is a ubiquitus ribonucleoprotein enzyme, responsible for the production of the 5´ mature ends of all precursor tRNA molecules. RNase P endonucleolytic activity has been isolated from organisms representing the three domains of life, namely Bacteria, Archaea and Eukarya. It has been shown to contain an essential RNA subunit and one (Bacteria) or more (Archaea, Eukaryotes) proteins. The RNase P RNA subunits from bacteria and some archaea are catalytically active in vitro, whereas those from eukaryotes and most archaea have lost most of their functionality and require protein subunits for activity. RNase P has been characterized biochemically and genetically in several systems, and structures for both RNA and protein subunits have emerged. The integration of structural and functional data is slowly forming a scenario for the evolution of RNase P from an ancient enzyme to a highly organized ribonucleoprotein complex.
Dictyostelium discoideum RNase P harbors an essential RNA subunit, and has high protein content, as judged by its low boyant density. Nevertheless, our knowledge on the exact composition was limited. In the current study, a gene showing significant similarity to human Rpp30 RNase P protein subunit was identified in Dictyostelium genome. The gene encodes a protein (DRpp30) which is significantly larger than its homologues, due to an unusual C-terminus. The gene was cloned, overexpressed, and was used for the production of polyclonal antibodies. The participation of DRpp30 in the macromolecular complex of RNase P was verified by an immunobiochemical approach. The recombinant protein was shown to bind specifically both the RNase P RNA subunit and the pre-tRNA substrate in vitro, thus giving a first insight of its role in the holoenzyme complex. Homology modeling using as a template the archaeal Ph1887p, and molecular dynamics simulations of the modeled structure suggest that DRpp30 adopts a TIM-barrel fold.
While our efforts to isolate the gene encoding the RNA subunit of D. discoideum RNase P were in progress, Norman Pace and his group identified it through phylogenetic comparison. The full transcript of the gene was detected in active RNase P samples along with a smaller transcript of the same gene. The exact 5´and 3´ ends of both transcripts were identified and were cloned. Both these transcripts can substitute the endogenous RNA subunit in vitro, but no enzymatic activity associated with these RNA molecules could be detected so far.
|
25 |
Contributions to the study of the architecture and evolution of ribozymesMeyer, Mélanie 13 September 2013 (has links) (PDF)
NcRNA represent most of primary transcripts RNA in higher eukaryotes and tune gene expression via diverse mechanisms. They adopt 3D structures composed at 70% by WC bp forming A-form helices linked by RNA motifs. We identified the pk-turn, a new RNA motif related to k-turns that allow for the formation of a bend of 60° between stems P16 and P17 from the bacterial RNaseP. Yet it features different sequence and structural requirements than k-turns. The 2nd ribozyme which got my attention is the LCrz inserted in GIR2, a group I intron. This twintron is observed in the pre-rRNA 18S of the small subunit of the eukaryoteD. iris. LCrz catalyzes a reaction equivalent to the first step of splicing by group II introns, but in a structural context related to group I introns. We solved the 2.5 Å crystal structure of the LCrz and confirmed the unexpected shape by means of SAXS experiments. This work emphasizes the relationship between structure and function in the evolution of ribozymes.
|
26 |
Modulation unterschiedlicher Formen der Multidrug-Resistenz mittels eines MultitargetmultiribozymesKowalski, Petra 27 July 2006 (has links)
Tumorzellen entwickeln häufig Resistenzen gegen verschiedene strukturell und funktionell unabhängige Zytostatika, was als Multidrug-Resistenz (MDR) bezeichnet wird und die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie ist. Mit Hilfe von in vitro-Untersuchungen wurden erhöhte Genexpressionen der ABC-Transporter MDR1, MRP2 und BCRP als maßgebliche Resistenzfaktoren identifiziert, wie z.B. in den Magenkarzinomzellinien EPG85-257RDB (MDR1) und EPG85-257RNOV (BCRP) sowie in der Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS (MRP2). Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines auf Ribozym-Technologie basierenden Therapieansatzes, welcher die Expressionen der oben genannten ABC-Transporter simultan inhibiert und dessen Anwendung zur Reversion der zellulären MDR führt. Dazu wurde ein Multitargetmultiribozym (MTMR) entwickelt, das aus in trans-aktiven Ribozymen besteht, die gegen die ABC-Transporter mRNAs gerichtet sind sowie aus in cis-spaltenden Ribozymen und aus Spacer-RNA-Sequenzen. Durch autokatalytische Spaltung in cis konnten die in trans-aktiven Ribozyme aus dem Gesamt-MTMR freigesetzt werden. Die Analyse der kinetischen Parameter des MTMRs ergab, daß die autokatalytisch entstandenen MTMR-Fragmente ihre Substrat-RNAs im Vergleich zu den korrespondierenden Monoribozymen ohne Einbuße an Effizienz spalten können. Darüber hinaus wurde die MTMR-Sequenz stabil in den drei eingangs genannten MDR-Zellinien exprimiert, was in einer signifikanten Reduktion der jeweiligen Ziel-mRNAs (97 % MDR1-, 80 % BCRP-, 96 % MRP2-mRNA) und der entsprechenden Proteine resultierte. Die Multidrug-Resistenz konnte aufgrund der MTMR-Expression um 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV), 100% (257RDB) und die Zytostatikumsakkumulation um 90% (257RNOV-Zellen) sowie 100% (257RDB-Zellen) revertiert werden. Das MTMR stellt erstmalig ein RNA-Konstrukt dar, welches in der Lage ist, simultan mehrere unabhängige Gene funktionell auszuschalten. Es besitzt daher ein großes Potential für zukünftige gentherapeutische Ansätze. / Cancer cells are often insensible against structurally and functionally unrelated drugs that is known as multiple drug resistance (MDR) and the main cause for treatment failure. Overexpression of the ABC-transporters P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), and BCRP (ABCG2) is associated with MDR in several cancer cell lines, e.g. in the stomach carcinoma cell lines EPG85-257RDB (P-gp), EPG85-257RNOV (BCRP), and in the ovarian carcinoma cell line A2780RCIS (MRP2). We aimed the development of a novel hammerhead ribozyme-based therapeutic approach capable of simultaneous silencing of the prementioned ABC-transporters, and consequently of reversing MDR phenotypes. We designed a so-called multitarget multiribozyme (MTMR) consisting of trans-acting hammerhead ribozymes directed against the MDR1, MRP2, and BCRP transcripts, of MDR1 homologous spacer sequences, and of cis-acting ribozymes against the spacer sequences. Autocatalytic cleavage in cis excised the full-length MTMR, and released trans-acting hammerhead ribozymes. We also evaluated the catalytic features of the MTMR using large RNA target molecules. Comparison of the kinetic values of the autocatalytically derived MTMR fragments with those of corresponding mono-ribozymes demonstrated an MTMR-mediated substrate cleavage without distinct loss in catalytic efficiency. Moreover, the MTMR was stably expressed in the prementioned multidrug-resistant cancer cell lines, and decreased the targeted transcripts about 97% (MDR1), 80% (MRP2), and 96% (BCRP) as well as the corresponding protein levels, respectively. Cellular MDR could be reverted about 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV), and 100% (257RDB). Additionally, the MTMR reversed mitoxantrone accumulation entirely, and daunorubicin accumulation about 90% in stomach carcinoma cells, respectively. Taken together, the MTMRs capability of simultaneous silencing of multiple genes provides an effective instrument to knockdown genes of interest.
|
Page generated in 0.0383 seconds