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Rôle de Rrp6 dans l'expression des gènes / The Role of Rrp6 in Gene ExpressionChen, Xin 05 June 2012 (has links)
L'objectif de mon travail est de comprendre le rôle de Rrp6, une exoribonuclease 3'-5', dans l'expression des gènes. Dans ce but, j'ai utilisé le promoteur du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) comme modèle d'étude de la régulation des gènes chez les mammifères. En utilisant ce modèle dans le chapitre 1 des résultats, nous avons montré l'existence d'un nouveau mécanisme de répression de l'expression des gènes dépendant de l'ARN qui requiert les actions combinées de Rrp6 et du microprocesseur. A la suite de ce travail, nous avons caractérisé les complexes de protéines associés à Rrp6 qui contribuent à cette répression de la transcription (résultats - chapitre 2). Ces deux études suggèrent un rôle de Rrp6 dans la répression de la transcription au niveau du promoteur du VIH-1 mais aussi sur certains gènes cellulaires. Au cours des études présentées dans le chapitre 1, nous avons observé une forte diminution de l'expression de la protéine Dicer dans les cellules déplétées de Rrp6. Dicer est un élément central de la régulation de la maturation des microARN (miRNA) et donc joue un rôle important dans tous les processus cellulaires qui sont régulés par les miRNA, incluant de nombreux processus biologiques et physiologiques. Ainsi, il est important de connaitre les voies de régulation de Dicer. Dans le chapitre 3 des résultats, nous décrivons un nouveau mécanisme de régulation de Dicer par Rrp6. En effet, nos résultats montrent que Rrp6 est nécessaire pour un epissage efficace de l'ARNm de Dicer. Nos travaux décrivent un nouveau role de Rrp6 dans des processus cellulaires distincts: transcription et splicing / The objective of my doctoral work was to understand the role of a 3' to 5' exoribonuclease, Rrp6, in gene expression. I used the Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) promoter as a model to study gene regulation in mammalian cells. Using this model, in Result-chapter 1, we demonstrated a novel mechanism of RNA-dependent transcriptional gene silencing that depends on the cooperative activities of Rrp6 and microprocessor. Following this study, we characterized the Rrp6-containing complex that contributes to the transcriptional silencing at HIV-1 promoter (Result-chapter 2). These two studies suggest a role for Rrp6 in transcriptional repression at the HIV-1 promoter and also at a subset of cellular genes. During the course of our studies presented in chapter 1, we observed a dramatic decrease of Dicer protein level in the cells depleted of Rrp6. Dicer is a central regulator of microRNA (miRNA) maturation and therefore exerts an important role in all cellular processes that are regulated by miRNAs, including diverse biological and physiological processes. Thus, it is important to know how Human Dicer1 is regulated. In Result-chapter 3, we describe a new regulatory mechanism of Dicer1 expression by Rrp6. Indeed, our results demonstrate that Rrp6 is required for efficient splicing of Dicer1 mRNA. Our work describes a novel role for Rrp6 in distinct cellular processes: transcription and splicing.
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"Visualisation des "Arbres de Noël" de Mïller par Immunoprécipitation de Chromatine (ChIP) et mise en évidence d'un mécanisme de Surveillance Nucléolaire des ARN ribosomiques"Ruidant, Sabine MM 08 May 2008 (has links)
Les « terminal balls » qui constituent des complexes de maturation sont détectées
à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes
eucaryotes inspectés à ce jour ; générant les images de référence en « arbres de Noël ».
La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées
« SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes.
Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur
l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la
première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un
rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S).
Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres
de Noël ».
La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la
finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines
ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non
moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le
concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation.
Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C
ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un
mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité
5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape
qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres
composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus
d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de
mécanismes de contrôles de qualité.
Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage
des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités
protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la
synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a
conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices
de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse
et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une
inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement
requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation
m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de
contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage
(liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces
facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme
que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance
nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases
3’-5’ l’ Exosome.
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Study of ribonucleoprotein particle biogenesis and quality control by a novel technique using bacterial Rho factor as a tool / Etude de la biogenèse et du contrôle qualité des particules ribonucléoprotéiques en utilisant le facteur bactérien Rho comme un outilRemenaric Hajak, Mateja 22 April 2016 (has links)
Chez les eucaryotes, l’information génétique est transcrite en ARN messager qui subit plusieurs étapes de maturation et évènements d’assemblage avant d’être exporté hors du noyau. Ces modifications du transcrit sont effectuées par de nombreux facteurs protéiques recrutés au transcrit naissant, formant ainsi une particule ribonucléoprotéique (mRNP). La biogenèse du mRNP est étroitement liée avec la transcription et le contrôle qualité afin d’assurer l’efficacité et l’exactitude de la production de mRNPs matures. Des études récentes suggèrent que les membres du complexe THO-Sub2 pourraient être des facteurs cruciaux dans le couplage de la transcription, de la biogénèse du mRNP et de l’export. Dans notre groupe, nous avons mis en oeuvre un essai novateur pour étudier la biogénèse du mRNP et le contrôle qualité, basé sur l’expression du facteur Rho bactérien dans Saccharomyces cerevisiae. Rho interfère avec l’assemblage adéquat du mRNP et génère des transcrits aberrants qui sont dégradés par la machinerie de dégradation nucléaire. Dans cette étude, nous avons utilisé le système expérimental Rho pour mieux comprendre Rrp6 et l’implication de l’exosome dans la dégradation des transcrits liée au contrôle qualité, ainsi que pour mieux caractériser le rôle et la fonction du complexe THO-Sub2 dans le processus de biogénèse du mRNP. Les résultats obtenus révèlent une différence intéressante dans le comportement des membres du complexe THO sous l’action de Rho et dévoilent leur dépendance à la liaison à l’ARN, ce qui n’aurait pas pu être observé avec d’autres techniques expérimentales. Cela confirme le potentiel attendu du système expérimental basé sur Rho dans l’étude des facteurs protéiques impliqués dans la biogénèse et le contrôle qualité du mRNP. / In eukaryotes, the genetic information is transcribed into messenger RNA which undergoes various processing and assembly events prior to its export from the nucleus. These transcript modifications are performed by numerous protein factors recruited to the nascent transcript, thus making a messenger ribonucleoprotein particle (mRNP). mRNP biogenesis is tightly interconnected with both transcription and quality control to ensure efficiency and accuracy in production of mature mRNPs. Recent findings suggest that members of THO-Sub2 complex might be crucial factors in coupling transcription, mRNP biogenesis and export. In our group, we have implemented an innovative assay to study mRNP biogenesis and quality control, based on the expression of the bacterial factor Rho in Saccharomyces cerevisiae. Rho interferes with proper mRNP assembly and generates aberrant transcripts degraded by the nuclear degradation machinery. In this study, we use Rho experimental system to expand our findings on Rrp6 and exosome involvement in quality control degradation of transcripts, as well as to better characterize the role and function of THO-Sub2 complex in the process of mRNP biogenesis. Obtained results reveal an interesting difference in behavior of THO complex members upon Rho action and disclose their dependence on binding to the RNA, which could not be observed by other experimental techniques. This substantiates the expected potential of Rho-based experimental system in the study of protein factors involved in mRNP biogenesis and quality control.
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Sestřih atypických intronů v S. cerevisiae / Splicing of atypical introns in S. cerevisiaeCit, Zdeněk January 2012 (has links)
Pre-mRNA splicing is a vital process of gene expression important for all eukaryotic organisms. For the proper function of this very complex and dynamic event the presence of few specialized RNA and many proteins that hold a variety of tasks is necessary, not only inside the splicing complex itself, but also beyond this complex. The Prp45 is one of the proteins involved in pre-mRNA splicing in yeast Saccharomyces cerevisiae. Its human homologue, SNW1/SKIP, is involved in splicing but also in other crucial cell processes. The Prp45 protein was reliably reported only to participate in the second transesterification reaction of splicing. But there are also data suggesting its possible involvement in the first transesterification reaction. This work provides further evidences linking protein Prp45 with the first splicing reaction, obtained by the research of cells carrying the mutant allele prp45(1-169). Cells carrying this allele show dropped splicing and accumulation of pre-mRNAs. This thesis therefore also investigated the possible influence of Prp45 protein on the RNA export from the nucleus to the cytoplasm. But no connection between this protein and RNA transport was discovered. Keywords pre-mRNA splicing; Saccharomyces cerevisiae; Prp45; Mer1; Mud2; Prp22; Rrp6; AMA1; SNW1/SKIP
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Characterization of RNA exosome in Insect Cells : Role in mRNA SurveillanceHessle, Viktoria January 2011 (has links)
The exosome, an evolutionarily conserved protein complex with exoribonucleolytic activity, is one of the key players in mRNA quality control. Little is known about the functions of the exosome in metazoans. We have studied the role of the exosome in nuclear mRNA surveillance using Chironomus tentans and Drosophila melanogaster as model systems. Studies of the exosome subunits Rrp4 and Rrp6 revealed that both proteins are associated with transcribed genes and nascent pre-mRNPs in C. tentans. We have shown that several exosome subunits interact in vivo with the mRNA-binding protein Hrp59/hnRNP M, and that depleting Hrp59 in D. melanogaster S2 cells by RNAi leads to reduced levels of Rrp4 at the transcription sites. Our results on Rrp4 suggest a model for cotranscriptional quality control in which the exosome is constantly recruited to nascent mRNAs through interactions with specific hnRNP proteins. Moreover, we show that Rrp6 interacts with mRNPs in transit from the gene to the nuclear pore complex, where it is released during early stages of nucleo-cytoplasmic translocation. Furthermore, we show that Rrp6 is enriched in discrete nuclear bodies in the salivary glands of C. tentans and D. melanogaster. In C. tentans, the Rrp6-rich nuclear bodies colocalize with SUMO. We have also constructed D. melanogaster S2 cells expressing human b-globin genes, with either wild type of mutated splice sites, and we have studied the mechanisms by which the cells react to pre-mRNA processing defects. Our results indicate that two surveillance responses operate co-transcriptionally in S2 cells. One requires Rrp6 and retains defective mRNAs at the transcription site. The other one reduces the synthesis of the defective transcripts through a mechanism that involves histone modifications. These observations support the view that multiple mechanisms contribute to co-transcriptional surveillance in insects. / At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 4: Manuscript.
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Differential uncoupling of 5' and 3' exonucleolytic activities as determined by mutational analysis of the Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease, RAT1Gupton, Leodis Darren 14 June 2011 (has links)
Eukaryotic gene expression requires hundreds of proteins and several RNA factors to facilitate nuclear RNA processing. These RNA processing events include RNA transcription, pre-mRNA splicing, pre-ribosomal RNA (pre-rRNA) processing and trafficking of RNA to its proper location in the cell. As we learn more about the molecular details of the factors governing these highly coordinated processes it is becoming increasingly clear that a subset of factors participate in multiple RNA processing pathways to ensure faithful gene expression.
Our work completes the characterization of the Abelson pre-mRNA splicing mutants. We have discovered that the prp27-1 splicing mutant is a severe loss of function allele of RAT1, an essential 5’→3’ exoribonuclease. Several alleles of RAT1 have been previously isolated with each conferring an array of phenotypes thus making the elucidation of its essential in vivo function difficult. We set out to determine how mutations within a specific region determines the RNA processing pathway in which Rat1p has been implicated to function within.
In our analysis of Rat1p function we discovered the prp27-1 allele exhibits novel 3’ end processing defects never reported in previous rat1 mutants. We performed mutational analysis to examine the coupling of 5’ and 3’ exonucleolytic activities in nuclear RNA processing events. Through our study we have discovered a means by which the cell coordinately regulates the nuclear RNA degradation complexes to ensure efficient processing of pre-RNAs for the faithful execution of eukaryotic gene expression. Additionally, we offer evidence in support of role for Rat1p in promoting mitotic events in vivo. / text
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Visualisation des Arbres de Noël de Miller par immunoprécipitation de chromatine (ChIP) et mise en évidence d'un mécanisme de surveillance nucléolaire des ARN ribosomiquesRuidant, Sabine 08 May 2008 (has links)
Les terminal balls qui constituent des complexes de maturation sont détectées<p>à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes<p>eucaryotes inspectés à ce jour ;générant les images de référence en « arbres de Noël ».<p>La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées<p>« SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes.<p>Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur<p>l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la<p>première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un<p>rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S).<p>Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres<p>de Noël ».<p>La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la<p>finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines<p>ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non<p>moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le<p>concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation.<p>Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C<p>ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un<p>mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité<p>5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape<p>qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres<p>composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus<p>d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de<p>mécanismes de contrôles de qualité.<p>Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage<p>des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités<p>protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la<p>synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a<p>conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices<p>de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse<p>et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une<p>inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement<p>requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation<p>m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de<p>contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage<p>(liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces<p>facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme<p>que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance<p>nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases<p>3’-5’ l’ Exosome. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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