La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease characterized by frequent rearrangements of the RUNX1 gene located at chromosomal band 21q22. In this subtype of leukemias, t(8;21)(q22;q22) and t(3;21)(q26;q22) translocations are among the most studied rearrangements, being respectively associated with a favourable and poor prognosis. However, approximately half of RUNX1 translocations remain uncharacterized at the clinical and molecular levels at the present time. The main objectives of this thesis are to characterize four novel RUNX1 translocations in adult patients with acute leukemias and to study the expression profiles of specific transcriptional targets of RUNX1 fusions involved in self-renewal or differentiation of hematopoietic cells. Using molecular techniques, we identified CLCA2 and SV2B genes as novel fusion partners of RUNX1 in t(1;21)(p22;q22) and t(15;21)(q26;q22) translocations. We also described the recurrence of the USP42 and TRPS1 genes involved in t(7;21)(p22;q22) and t(8;21)(q23.3;q22) translocations. Chimeric fusion proteins, truncated isoforms of RUNX1, alteration of RUNX1 transcripts expression and overexpression of the fusion partner were possible outcomes of these various fusions, thus demonstrating the diversity of RUNX1 alterations in acute leukemias. Genomic breakpoints of the recurrent RUNX1-UPS42/USP42-RUNX1 and RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 fusions were cloned and analyzed revealing typical signatures of the non-homologous end joining recombination mechanism at fusion junctions. Since variation in the structure and composition of these junctions was observed, we proposed that distinct cellular machineries would be involved in the genesis of these abnormalities. Quantitative real-time PCR was performed on primary leukemic cells expressing these rare RUNX1 fusions. We demonstrated, for the first time, that similar downregulation of CEBPA and upregulation of JUP, an effector of the Wnt pathway, are detected in most samples studied presenting either recurrent or rare RUNX1 fusions. Despite an overexpression of JUP detected in each RUNX1 positive sample studied, other targets of the Wnt pathway like CCND1 and MYC genes were differently expressed in these cells, thus confirming the heterogeneity of this group of leukemias. Our expression data show that similar transcriptional targets, activated or repressed, are detected in cells expressing either chimeric or truncated RUNX1 proteins and establish the first molecular evidences suggesting that the recurrent RUNX1-RUNX1T1 and four rare RUNX1 fusions share common molecular deregulations. As relapse frequently occurs in RUNX1 positive leukemias, JUP overexpression could be of particular interest with regard to targeted-therapy, as demonstrated by previous work showing potential benefits of inhibiting the Wnt pathway in other genetic groups of acute leukemias.

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetically heterogeneous disease characterized by frequent rearrangements of the RUNX1 gene located at chromosomal band 21q22. In this subtype of leukemias, t(8;21)(q22;q22) and t(3;21)(q26;q22) translocations are among the most studied rearrangements, being respectively associated with a favourable and poor prognosis. However, approximately half of RUNX1 translocations remain uncharacterized at the clinical and molecular levels at the present time. The main objectives of this thesis are to characterize four novel RUNX1 translocations in adult patients with acute leukemias and to study the expression profiles of specific transcriptional targets of RUNX1 fusions involved in self-renewal or differentiation of hematopoietic cells. Using molecular techniques, we identified CLCA2 and SV2B genes as novel fusion partners of RUNX1 in t(1;21)(p22;q22) and t(15;21)(q26;q22) translocations. We also described the recurrence of the USP42 and TRPS1 genes involved in t(7;21)(p22;q22) and t(8;21)(q23.3;q22) translocations. Chimeric fusion proteins, truncated isoforms of RUNX1, alteration of RUNX1 transcripts expression and overexpression of the fusion partner were possible outcomes of these various fusions, thus demonstrating the diversity of RUNX1 alterations in acute leukemias. Genomic breakpoints of the recurrent RUNX1-UPS42/USP42-RUNX1 and RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 fusions were cloned and analyzed revealing typical signatures of the non-homologous end joining recombination mechanism at fusion junctions. Since variation in the structure and composition of these junctions was observed, we proposed that distinct cellular machineries would be involved in the genesis of these abnormalities. Quantitative real-time PCR was performed on primary leukemic cells expressing these rare RUNX1 fusions. We demonstrated, for the first time, that similar downregulation of CEBPA and upregulation of JUP, an effector of the Wnt pathway, are detected in most samples studied presenting either recurrent or rare RUNX1 fusions. Despite an overexpression of JUP detected in each RUNX1 positive sample studied, other targets of the Wnt pathway like CCND1 and MYC genes were differently expressed in these cells, thus confirming the heterogeneity of this group of leukemias. Our expression data show that similar transcriptional targets, activated or repressed, are detected in cells expressing either chimeric or truncated RUNX1 proteins and establish the first molecular evidences suggesting that the recurrent RUNX1-RUNX1T1 and four rare RUNX1 fusions share common molecular deregulations. As relapse frequently occurs in RUNX1 positive leukemias, JUP overexpression could be of particular interest with regard to targeted-therapy, as demonstrated by previous work showing potential benefits of inhibiting the Wnt pathway in other genetic groups of acute leukemias.

Les gènes ASXL (ASXL1, ASXL2 et ASXL3) sont les homologues mammifères du gène Additional sex combs (Asx) présent chez la Drosophile. En 2009, des mutations somatiques impliquant ASXL1 ont été identifiées chez ~ 10-20% des patients atteints d’hémopathies myéloïdes. Le rôle et l’implication des autres membres de la famille dans l’hématopoïèse normale et pathologique sont encore inconnus.Dans ce travail, nous avons identifié pour la 1ère fois, par séquençage haut débit, des mutations somatiques récurrentes d’ASXL2 (22,7%) chez des adultes et enfants atteints de leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec translocation t(8 ;21) (c.-à-d AML1-ETO (AE) ou RUNX1/RUNX1T1). Ces mutations n’ont pas été retrouvées dans d’autres sous types de LAM et sont mutuellement exclusives des mutations d’ASXL1. Le séquençage de l'ARN (RNAseq) d'échantillons de patients a révélé un profil transcriptionnel spécifique chez les patients mutés pour ASXL2. Bien que la survie globale soit similaire, les patients porteurs de mutations d’ASXL1 ou ASXL2 ont une incidence cumulative de rechute de 54,6% et 36,0% comparativement à 25% pour les patients non mutés (P = 0,226). Ces résultats, évoquant une coopération entre ASXL1/2 et AE lors de la leucémogenèse, sont importants car les t(8 ;21) sont parmi les anomalies cytogénétiques les plus fréquentes en matière de LAM. D’autre part, il est bien établi que AE nécessite la coopération d’altérations géniques supplémentaires pour induire la leucémie.Nous avons ensuite exploré le rôle d’ASXL2 dans l’hématopoïèse normale. Nous avons d’abord démontré in vitro que les mutations d’ASXL2 entrainent une diminution de son expression. Nous avons ensuite généré un modèle de souris invalidées pour Asxl2 (KO conditionnel). Par transplantations compétitive et non compétitive, nous avons montré que le KO pour Asxl2 ou Asxl1 et Asxl2 (double KO) induit une diminution et un défaut d’auto renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) ainsi que des cytopénies, avec un phénotype plus sévère que le KO d’Asxl1 seul. L’analyse du transcriptome (par RNAseq) des CSH a révélé un nombre de gènes dérégulés par la perte d’Asxl2 25 fois plus important qu’avec Asxl1. De plus les gènes dérégulés par la perte d’Asxl2 recoupent les cibles transcriptionnelles d’AML1-ETO. Ces données suggérant qu’Asxl2 pourrait être un médiateur important de la leucémogenèse, nous avons ensuite étudié le rôle d’ASXL2 dans les LAM avec t(8 ;21). In vitro, par CHIP Seq, nous avons mis en évidence, dans des lignées t(8;21), un enrichissement des sites de liaisons à l’ADN d’ASXL2 au niveau de ceux d’AML1-ETO. De plus, en infectant ces lignées avec un shRNA dirigé contre ASXL2, nous avons étudié la marque H3K4me1 qui est augmentée de façon majeure dans le contexte leucémique. Afin de comprendre les effets in vivo d’ASXL2 dans la leucémogenèse, nous avons réalisé des greffes de cellules de moelle osseuse de souris KO infectées avec un rétrovirus pour AE9a. Ces souris développent une LAM plus rapidement que les souris contrôles AE9a lors de greffes secondaires, suggérant à nouveau un rôle spécifique d’Asxl2. Afin d’élucider le mécanisme impliqué, nous avons réalisé de l’ATAC seq sur ces souris et mis en évidence des différences importantes dans l’accessibilité de la chromatine, notamment au niveau des gènes Hoxa et Meis1.Pour la première fois, nous décrivons l’incidence des mutations d’ASXL2 dans les LAM et le rôle d’ASXL2 dans l’hématopoïèse. Nous suggèrerons un rôle spécifique dans les LAM avec t(8;21), qui pourrait être associé à des modifications de la marque d’histone H3K4me1. Ces spécificités pourraient résulter en de nouvelles options thérapeutiques chez les patients. / The ASXL family of genes (ASXL1, ASXL2, and ASXL3) are mammalian homologs of the Drosophilia Additional sex combs (Asx) gene. In 2009 somatic mutations involving ASXL1 were originally identified in ~10-20% of patients with myeloid malignancies. Despite this association, alterations in other ASXL family members and their potential function in normal or malignant hematopoiesis were unknown.We identified, by next generation sequencing, the surprising finding of highly recurrent somatic ASXL2 mutations (22.7%) in adult and pediatric acute myeloid leukemia (AML) patients bearing the AML1-ETO (AE) translocation (i.e. RUNX1/RUNX1T1, t(8;21)). Interestingly these mutations were only found in patients with t(8 ;21) and mutually exclusive with ASXL1 mutations. RNA sequencing (RNAseq) of primary AE AML patient samples revealed that ASXL2-mutants form a distinct transcriptional subset of AE AML. Although overall survival was similar between ASXL1 and ASXL2 mutant t(8;21) AML patients and their wild-type counterparts, patients with ASXL1 or ASXL2 mutations had a cumulative incidence of relapse of 54.6% and 36.0%, respectively, compared with 25% in ASXL1/2 wild-type counterparts (P=0.226). These findings are of immediate biological importance as AE translocations are amongst the most common cytogenetic alterations in AML and it is well established that AE requires additional genetic alterations to induce leukemogenesis.Given the above human genetic data, we set out to perform a functional comparison of ASXL1 and ASXL2 on hematopoiesis and determine the functional basis for frequent mutations in AE AML. In vitro analyses of ASXL2 mutations revealed that these mutations resulted in substantial reduction of ASXL2 protein expression. We therefore generated Asxl2 conditional knockout (cKO) mice to delineate the effect of ASXL2 loss on hematopoiesis. Competitive and noncompetitive transplantation revealed that Asxl2 or compound Asxl1/2 loss resulted in cell-autonomous, rapid defects of hematopoietic stem cell (HSC) function, self-renewal, and number with peripheral blood leukopenia and thrombocytopenia. RNA-seq of HSCs revealed twenty-fold greater differentially expressed genes in Asxl2 cKO mice relative to Asxl1 cKO mice. Interestingly, genes differentially expressed with Asxl2 loss significantly overlapped with direct transcriptional targets of AE, findings not seen in Asxl1 cKO mice.Overall, the above data suggest that Asxl2 may be a critical mediator of AE leukemogenesis. To functionally interrogate the role of ASXL2 loss in leukemogenesis we first utilized an in vitro model with RNAi-mediated depletion of ASXL2 in the SKNO1 cell line. Anti-ASXL2 and AE ChIPSeq revealed significant co-occupancy of ASXL2 with AE binding sites. Moreover, analysis of histone modification ChIP-Seq revealed an enrichment in intergenic and enhancer H3K4me1 abundance following ASXL2 loss. Next, to understand the in vivo effects of Asxl2 loss in the context of AE, we performed retroviral bone marrow (BM) transplantation assays using AE9a in Asxl2 cKO mice. In contrast to the failure of HSC function with Asxl2 deletion alone, mice reconstituted with BM cells expressing AE9a in Asxl2-deficient background had a shortened leukemia-free survival compared to Asxl2-wildtype control. Moreover, ATAC Sequencing showed an increase of chromatin occupancy with Asxl2 loss at known leukemogenic loci, including the HoxA and Meis1 loci.Overall, these data reveal that ASXL2 is required for hematopoiesis and has differing biological and transcriptional functions from ASXL1. Moreover, this work identifies ASXL2 as a novel mediator of AE transcriptional function and provides a new model of penetrant AE AML based on genetic events found in a substantial proportion of t(8;21) AML patients. Further interrogation of the enhancer alterations generated by ASXL2 loss in AE AML may highlight new therapeutic approaches for this subset of AML

La maturation des cellules lymphoïdes T est un processus thymique hautement régulé au cours duquel les réarrangements ordonnés des loci du TCRδ, y, β et enfin α déterminent le développement des lignées yδ et αβ. Les remaniements somatiques des segments géniques V, (D) et J du TCR font intervenir les protéines RAG1/2, les séquences RSS jouxtant ces segments et des éléments régulateurs (enhancers) assurant une cis-régulation de ce processus. Le contrôle de la recombinaison V(D)J se fait grâce à divers mécanismes incluant des mécanismes épigénétiques, l’intervention de facteurs de transcription et la conformation/séquence des RSS. Dans ce travail, nous montrons que les réarrangements du locus TCRδ sont strictement ordonnés chez l’Homme. Le premier réarrangement Dδ2-Dδ3 se produit à un stade ETP (Early T-cell Precursor) CD34+/CD1a-/CD7+dim, et précède systématiquement le réarrangement Dδ2-Jδ1. L’analyse in silico du locus a permis d’identifier un site de fixation clé pour le facteur de transcription RUNX1 à proximité immédiate de l’heptamètre Dδ2-23RSS chez l’Homme mais absent chez la souris. Le recrutement de RUNX1 sur ce site dans les thymocytes très immatures CD34+/CD3- permet d’augmenter l’affinité de fixation des protéines RAG1/2 sur le Dδ2-23RSS de manière spécifique. Ce travail identifie un rôle original de cofacteur de RUNX1 au cours de la recombinaison V(D)J dans la thymopoïèse humaine. Une série d’analyses épigénétiques exhaustives, menées dans le cadre du projet Européen Blueprint, sur les sous-populations thymiques humaines, nous a permis d’établir que l’enhanceosome du TCRα est constitué, comme chez la souris, dès les étapes les plus précoces de la thymopoïèse sans pour autant pouvoir s’activer avant la fin de la β-sélection. Nos résultats préliminaires suggèrent que les protéines homéotiques HOXA (notamment HOXA9) répriment l’activité de l’enhancer alpha (et donc les réarrangements du TCRα en interagissant avec le facteur de transcription ETS1 via leurs homéodomaines. Leur répression, induite par le passage de la β-sélection, aboutit à l’ouverture chromatinienne des segments Vα/Jα via l’activation du TCRα. Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur le découplage jusqu’ici inexpliqué entre la formation de l’enhanceosome du TCRα à un stade très immature et son activation, permettant les réarrangements du locus, à un stade thymique bien plus tardif. / Maturation of T lymphoid cells is a highly regulated process where ordered thymic rearrangements at the TCRδ, TCRy, TCRβ and finally TCRα loci determine the development into either yδ or αβ T-cell lineages. Somatic rearrangements of V, (D), and J gene segments of TCR loci involve RAG1/2 proteins, RSS sequences juxtaposing V, D, and J genes segments and regulatory elements (enhancers) providing a cis-regulation of this process. The control of the V(D)J recombination is achieved through various mechanisms including epigenetic modifications, involvement of transcription factors and RSS conformation/sequence. In this work, we show that TCRδ rearrangements are strictly ordered in Humans. The first Dδ2-Dδ3 rearrangement occurs at ETP (Early T-Cell Precursor) stage CD34+/CD1a-/CD7+dim, and always precedes Dδ2-Jδ1 rearrangement. In-silico analysis of the locus identified a key binding site for a transcription factor RUNX1 in close proximity to the Dδ2-23RSS heptamer in human, but not in mice. The RUNX1 recruitment at this site in immature CD34+/CD3- thymocytes increases binding affinity of RAG1/2 proteins. This work identifies an original cofactor of human VDJ recombination. A set of comprehensive epigenetic analysis conducted within the Europeen Blueprint project on human thymic subpopulations allowed as to establish that the TCRα enhanceosome (Eα), as in mice, is already formed from the earliest stages of thymopoiesis without being able to be activated before the end of β-selection. Our preliminary results suggest that HOXA homeobox proteins (including HOXA9) suppress the activity of the Eα (thus TCRα rearrangements) by interacting with the transcription factor ETS1 via their homeodomains. Induced by β-selection HOXA repression results in the chromatin opening of the Vα/Jα gene segments through TCRα activation. These finding shed new light on the so far unexplained shift observed between the formation of Eα enhanceosome at a very immature stages and its activation at a much later developmental stages.

Malgré l'amélioration des traitements, environ 20% des patients atteints de leucémie aigue lymphoblastiques (LAL) rechutent dans la moelle osseuse ou dans des sites extra-médullaires tels que les ovaires et les testicules, ce qui est particulièrement fréquent dans les rechutes tardives de LAL-B présentant un remaniement ETV6/RUNX1. Les travaux réalisés par Virginie Gandemer en 2007, ont montré que l'expression de CD9 permettait de distinguer les leucémies ETV6/RUNX1 des autres types de leucémie. Le gène CD9 code pour une protéine de la famille des tétraspanines dont l'expression a été corrélée avec le risque métastatique et la survie des patients. Par ailleurs il a été démontré que la protéine CD9 était impliquée dans le homing et la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques et leucémiques. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'à travers ses propriétés fonctionnelles sur la migration et le homing, CD9 pourrait être un acteur clé des rechutes de LAL-B. Le but de ce travail de thèse était donc premièrement de déterminer le mode de régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1 et deuxièmement de déterminer les effets de l'expression de CD9 sur la motilité et la prise de greffe des LAL-B. Les analyses préalablement réalisées au laboratoire avaient suggéré que CD9 pouvait être régulé par des miARNs. Nous avons identifié un cluster de 3 miARNs potentiellement impliqués dans la régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1. Ces résultats doivent cependant être complétés par d'autres analyses fonctionnellles afin d'être confirmés. Nous avons étudié le rôle de la protéine CD9 dans la dissémination des cellules de LAL-B. Nous avons démontré que CD9 était un régulateur potentiel de l'adhésion et un nouveau facteur impliqué dans la migration et le homing dépendants de CXCR4 en favorisant l'activation de RAC1 et les réarrangements de l'actine en réponse au CXCL12. Enfin, nous avons décrit pour la première fois l'influence de CD9 sur la migration et le homing dans les testicules via RAC1. Nos résultats montrent donc que CD9 favorise la dissémination des cellules de LAL-B dans les testicules et suggèrent que cette protéine pourrait constituer un acteur majeur des rechutes tardives de LAL-B dont les mécanismes d'apparitions sont peu connus. / Despite improvements in survival rates, approximately 20% of children suffering from acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) present relapses from bone marrow or from B-extramedullary sites, such as the testes or ovaries, particularly in cases of late relapse of ETV6/RUNX1-ALL. Virgine Gandemer showed in 2007, that the expression of CD9, a protein from the tetraspanin superfamily, can be used to distinguish ETV6/RUNX1 lymphoblastic leukemia from other types of ALL. CD9 expression has been correlated with the risk of metastasis and is associated with a poor clinical outcome in various types of cancer. Moreover CD9 has been implicated in hematopoietic and leukemic stem cell homing. We hypothesized, that CD9 protein, through its functional properties on migration and homing, could be a key actor of B-ALL relapses. The purpose of our study was then to investigate, first the transcriptional regulation of CD9 in ETV6/RUNX1 B-ALL and secondly, the effect of CD9 expression on motility and engrafment of B lymphoblasts. The analysis of CD9 transcriptional regulation previously made in the team, suggested that it could be regulated by miRNAs. We identified a cluster of 3 miRNAs potentially implicated in the regulation of CD9 expression in ETV6/RUNX1 B-ALL. This result has to be confirmd by more functional analysis. We investigated the role of CD9 in the dissemination of B-ALL. We identified CD9 as a potential regulator of B-ALL cell adhesion and a new factor involved in CXCR4-mediated migration and homing, through the promotion of actin rearrangement in response to CXCL12. We also characterized the effect of CD9 protein expression on RAC1 activation, which had an impact on blast migration and engraftment. Finally, we described, for the first time, the influence of CD9, mediated by RAC1 signaling, on B-cell chemotactic migration and homing in the testis. Our work provides evidence for an impact of CD9 on the ability of pre-B leukemic cells to disseminate to testes, through its effects on migration and homing, and suggests that CD9 may be a key player in late relapses of B-ALL, which are currently poorly understood.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant et dérivent le plus souvent de précurseurs lymphoïdes B. D’importants progrès thérapeutiques ont permis d’améliorer considérablement le pronostic. Néanmoins, 15 à 20 % des enfants rechutent encore. Ces rechutes peuvent survenir de façon isolée ou combinée dans la moelle osseuse, le site primitif des lymphoblastes, et/ou dans des organes extramédullaires tels que le testicule ou le système nerveux central. Notre équipe a montré que la protéine transmembranaire CD9 jouait un rôle majeur dans la migration des blastes dans ces sites et notamment le testicule, par l’activation de la voie RAC1 en réponse à la stimulation des cellules par le CXCL12. Ici, nous avons mis en évidence qu’un faible niveau d’oxygène, caractéristique commune aux niches médullaire et extramédullaires, régulait positivement l’expression de CD9 aux niveaux transcriptionnel et protéique, via la voie majeure de réponse à l’hypoxie, dépendante du facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a). Nous montrons que HIF1a se fixe directement sur le promoteur de CD9 pour induire sa transcription. Nous montrons aussi que la protéine CD9 est essentielle aux propriétés d’adhérence et de migration des blastes dans des conditions de basse oxygénation, et que son action pourrait s’exercer à travers RAC1 comme en normoxie. Nos résultats dans des expériences de xénogreffe à des souris indiquent que la voie HIF1a favorise la dissémination des blastes, possiblement à travers la régulation qu’elle exerce sur CD9. Ainsi, ce travail contribue à mieux comprendre le rôle de CD9 dans la pathogenèse des LAL de l’enfant. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) are the most frequent cancer in children and derive most often from B-cell precursors. Huge therapeutic improvements have allowed to reach high survival rates near 90% at 10 years from diagnosis. However, 15-20% of children still relapse with a significant risk of death. Relapses can occur in bone marrow and/or extramedullary sites such as testis or central nervous system, usually referred as “sanctuary sites”. Our previous work showed that the transmembrane protein CD9 plays a major role in lymphoblasts migration into these sites, especially in testis, through the activation of RAC1 signaling upon blasts stimulation with C-X-C chemokine ligand 12 (CXCl12). Here, we addressed the question of putative common factors shared by bone marrow and extramedullary niches which could upregulate CD9 expression and function. Consequently, we found that low oxygen levels could actually enhance CD9 expression both at mRNA and protein levels. We further determined that Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a), the master transcription factor involved in hypoxia response, binds directly CD9 promoter to induce its transcription. We also showed that CD9 protein is crucial for leukemic cell adhesion and migration at low oxygen levels, possibly through its action on RAC1 signaling. Mouse xenograft experiments indicate that HIF1a signaling pathway favors ALL cells dissemination, which may involve CD9 as well. The present work increments our understanding of CD9 implication in ALL pathogenesis.

RUNX1, a transcription factor required for hematopoiesis and lymphocyte differentiation, is one of the most commonly targeted genes in hematopoietic malignancies. Mutations in the RUNX1 gene are associated with a poor prognosis in a subset of T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) and RUNX1 has been proposed as a tumor suppressor in TLX1/3-transformed human T-ALL. Recent ChIP-seq studies in human T-ALL cell lines demonstrated that a large portion of TAL1- and NOTCH1- bound regions contain RUNX binding sites in promoter or enhancer regions, suggesting oncogenic roles for RUNX1 in T-ALL. To interrogate RUNX1 functions in leukemogenesis, we depleted RUNX1 in a T-ALL mouse model and in human T-ALL cell lines. We found that RUNX1 is required for the maintenance of mouse T-ALL growth in vivo and the survival of human T-ALL cell lines in vitro. In addition, inhibition of the RUNX1 activity with a small molecule inhibitor impairs the growth of human T-ALL cell lines and primary patient samples. RUNX1 depletion reduces the expression of a subset of TAL1- and NOTCH1- regulated genes including the MYB and MYC oncogenes, respectively. We demonstrate that RUNX1 regulates transcription factor binding and acetylation of H3K27 at the Myb and Myc enhancer loci. These studies provide genetic and pharmacological evidences that RUNX1 supports T-ALL cell survival and suggest RUNX1 inhibitor as a therapeutic strategy in T-ALL treatment.

RUNX1 overlapping RNA (RUNXOR) is a long non-coding RNA and plays a pivotal role in the differentiation of myeloid cells via targeting runt-related transcription factor 1 (RUNX1). We and others have previously reported that myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) expand and inhibit host immune responses during chronic viral infections; however, the mechanisms responsible for MDSC differentiation and suppressive functions, in particular the role of RUNXOR-RUNX1, remain unclear. Here, we demonstrated that RUNXOR and RUNX1 expressions are significantly upregulated and associated with elevated levels of immunosuppressive molecules, such as arginase 1 (Arg1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), and reactive oxygen species (ROS) in MDSCs during chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Mechanistically, we discovered that HCV-associated exosomes (HCV-Exo) can induce the expressions of RUNXOR and RUNX1, which in turn regulates miR-124 expression via STAT3 signaling, thereby promoting MDSC differentiation and suppressive functions. Importantly, overexpression of RUNXOR in healthy CD33+ myeloid cells promoted differentiation and suppressive functions of MDSCs. Conversely, silencing RUNXOR or RUNX1 expression in HCV-derived CD33+ myeloid cells significantly inhibited their differentiation and expressions of suppressive molecules and improved the function of co-cultured autologous CD4 T cells. Taken together, these results indicate that the RUNXOR-RUNX1-STAT3-miR124 axis enhances the differentiation and suppressive functions of MDSCs and could be a potential target for immunomodulation in conjunction with antiviral therapy during chronic HCV infection.

Breast cancer remains the most common malignant disease in women worldwide. Despite the advantages of early detection and improved treatments, studies into the mechanisms that initiate and drive breast cancer progression are still required. Recent studies have identified RUNX1, which is an essential transcription factor for hematopoiesis, is one of the most frequently mutated genes in breast cancer patients. However, the role of RUNX1 in the mammary gland is understudied. In this dissertation, we examined the role of RUNX1 in both normal mammary epithelial and breast cancer cells. Our in vitro studies demonstrated that RUNX1 inhibits epithelial to mesenchymal transition (EMT), migration, and invasion, reflecting its tumor suppressor activity, which was confirmed in vivo. Moreover, RUNX1 also contributes significantly to inhibition of the phenotypes of breast cancer stem cells (CSC), which is responsible for metastasis and tumor relapse. We showed that Runx1 overexpression reduces the tumorsphere formation and cancer stem cell population. Overall, our studies provide mechanistic evidence for RUNX1 repression of EMT in mammary cells, anti-tumor activity in vivo and regulation of CSC-like properties in breast cancer. Our results highlight crucial roles for RUNX1 in preventing epithelial to mesenchymal transition and tumor progression in breast cancer. This RUNX1 mediated mechanism points to novel intervention strategies for early stage breast cancer.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24511号 / 医博第4953号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 伊藤 貴浩, 教授 岩田 想, 教授 河本 宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM