Doctor en Bioquímica / Reproduction is regulated through the integration of information that comes from the hypothalamus, hypophysis, and the ovary. There are critical hormone sensitive periods during development during which they are especially vulnerable to exposure to abnormal hormonal levels resulting from metabolic problems or environmental sources. These exposures may permanently alter the differentiation and function of reproductive organs. Several studies performed in humans and animal models have suggested that polycystic ovary syndrome (PCOS) originates during early development due to exposure to abnormal steroidal hormone levels. Supporting this, our group recently reported that the administration of a single dose of estradiol valerate (EV) to newborn rats can irreversibly program the polycystic ovary condition during adulthood. However, there is no information about how this neonatal exposure to a single dose of EV can determine the functional and structural changes seen in the adult ovary. The aim of this research was to determine if there are genes—primarily those most reported to be related to PCOS in humans—with permanently altered expression and if these expression patterns are due to modifications in the methylation pattern in their DNA sequence. A single dose (10 mg/kg) of EV was administered to neonatal rats, and PCR array and real-time PCR analyses were conducted to examine the subsequent gene expression patterns of growth factors, nuclear receptors, and coregulators. Twenty-four hours after the exposure, the EV-exposed rat ovaries expressed more androgen receptor (Ar) than did the control ovaries; in the 60-day old rats, the Ar mRNA levels decreased 6.4-fold relative to the controls. The interstitial tissue and antral follicles from the adult EV-treated rats expressed more Ar than did the control preantral follicles, suggesting a failure of the control mechanism for Ar expression in antral follicles. Using the mass-array technique, the methylation patterns of different transcription factor binding sites were found to be associated with the Ar gene. NBRE, the response element of nerve growth factor-induced B (Ngfi-b), was hypomethylated in the Ar gene from the EV-treated ovaries. There was also an increase in anti-Müllerian hormone (AMH) expression in adult ovaries (mRNA and protein) that was induced by the neonatal exposure to estradiol. The EV-treated rat ovaries had a higher level of AMH immunoreactivity in the antral follicles than did the controls; however, no significant differences were seen between the preantral follicles of the treated and control groups. The methylation pattern of the Amh gene from the ovaries of EV-treated adult rats showed differential methylation in the CpGs related to the estradiol response element (ERE) in the Amh gene. The neonatal ovary samples had hypermethylated CpGs in comparison to the 30- and 60-day old rats; the samples (granulosa cells) from the 60-day old rats had more methylation of the CpGs than did those from the 30-day old rats; thus, the methylation pattern depended on the stage of development. When we compared the EV-exposed and control rats, we found more methylation of the CpGs in the samples from the 60-day old EV-exposed rats than in those from the controls; there were no differences between the groups for the 2- and 30-day old rats. This work demonstrated that the neonatal exposure to estradiol induces an overexpression of AMH and AR in the rat ovary. The mechanism by which these changes are induced may involve an increase in the methylation of the ERE associated with the Amh gene, suggesting that the change in methylation allows ESR1 to induce Amh expression. The hypomethylation of NBRE associated with the AR gene suggests that AR expression may be induced in response to nerve growth factor or luteinizing hormone. These epigenetic modifications found in the current rat model provide a new framework for understanding the genesis of the polycystic ovary and its maintenance in humans, allowing more focus on the effects due to estrogen exposure / Die Fortpflanzung in Säugetieren wird durch Signale aus dem Hypothalamus, der Hypophyse und der Gebärmutter gesteuert. Während der Anlage der Gebärmutter in der Embryonalentwicklung gibt es ein kritisches Zeitfenster bei dem die Entwicklung durch veränderte Hormonspiegel oder andere äußere Einflüsse gestört werden kann. Dabei kann es zur permanenten Schädigung der reproduktiven Organe kommen. Studien am Menschen und in Tiermodellen legen nahe, dass das sogenannte Polyzystische Ovarialsyndrom durch erhöhte Steroidhormonspiegel verursacht wird. So konnte unsere Arbeitsgruppe kürzlich zeigen, dass bei neugeborenen Ratten die Gabe einer einzigen Dosis Estradiolvalerat (EV) ausreicht um ein Polyzystisches Ovarialsyndrom in den erwachsenen Tieren zu erzeugen. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind allerdings bis heute nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die Expression bestimmter Gene in erwachsenen Ratten durch die Estradiolvaleratgabe im neonatalen Stadium permanent verändert wird und ob die veränderte Genexpression mit epigenetischen Veränderungen auf der Ebene der DNA Methylierung einhergeht. Hierzu wurden neugeborene Ratten mit einer einzigen Dosis EV (10 mg/Kg) behandelt um anschließend die Genexpression von Wachstumsfaktoren, nukleären Hormonrezeptoren und ihre Kofaktoren mittels PCR Arrays und quantitativer RT-PCR zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Ovarien von EV-behandelten Ratten das Androgenrezeptorgen (Ar) nach 24h stärker exprimierten als die Kontrollen. Nach 60 Tagen ging die ovariale Ar Expression allerdings um das 4-6-fache gegenüber unbehandelten Tieren zurück. Histologisch war die Ar Expression in antralen Follikeln und im Interstitium vom EV-behandelten adulten Tieren stärker als in preantralen Follikeln, was auf eine Störung von Regulationsmechanismen in antralen Follikeln hindeutet. Mittels MassArray-Technologie konnte außerdem gezeigt werden, dass die veränderte Ar Expression in EV-behandelten Tieren mit der verringerten DNA Methylierung einer potentiellen Transkriptionsfaktorbindestelle (NBRE: nerve growth factor-induced B response element) korreliert. Daneben war die Expression des Anti-Müller-Hormons (AMH) in Ovarien von EV-behandelten adulten Tieren sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene erhöht. Immunhistologisch zeigten insbesondere die antralen Follikeln von EV-behandelten adulten Tieren (nicht aber Interstitium und preantrale Follikeln) eine stärkere Färbung für AMH. Auch im Amh Gen konnten entwicklungs- und behandlungsabhängige Veränderungen der DNA Methylierung gemessen werden. Eine Bindungsstelle für den Estrogenrezeptor (ERE: estradiol response element) im Amh Gen zeigte Methylierungsunterschiede in Ovarien von adulten EV-behandelten Ratten. In normalen Tieren war der Methylierungsstatus dieser Region abhängig vom Entwicklungsstadium: im Vergleich zu 30 und 60 Tage alten Ratten war das Element in neugeborenen Ratten hypermethyliert und in Granulosazellpräperaten von 30 Tage alten Ratten weniger methyliert als in Präparaten von 60 Tage alten Tieren. Im Vergleich mit EV-behandelten Tieren zeigten Proben von 60 Tage alten Tieren eine signifikant erhöhte DNA Methylierung, während EV-behandelte neugeborene und 30 Tage alte Tiere sich nicht signifikant von den Kontrollen unterschieden. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass bei Ratten die Gabe von Estradiol im neonatalen Stadium zu einer ovarialen Überproduktion von AMH und AR führt. Die Mechanismen die zu diesen Veränderungen führen könnten mit dem Verlust der DNA Methylierung im ERE des Amh Gens zusammenhängen, was vermutlich zu einer erhöhten ESR1-Bindung und AMH Expression führt. Die Hypomethylierung des NBRE im Ar Gen deutet darauf hin, dass hier NGF (nerve growth factor) oder LH (luteinisierende Hormon) an der veränderten Regulation beteiligt sind. Die im Rattenmodel gefundenen epigenetischen Veränderungen bieten neue Anhaltspunkte um die Entstehung und die Persistenz des Polyzystische Ovarialsyndroms im Menschen besser zu verstehen und zukünftige Forschung wird sich noch gründlicher mit den Effekten der Estrogenexposition auseinandersetzen müssen / Conicyt Mecesup Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Bioquímica / Antecedentes: El síndrome de ovario poliquístico (SOP), patología endocrinometabólica, afecta alrededor del 15% de mujeres en edad fértil, afectando principalmente la función del ovario, aunque también altera la función de otros tejidos de importancia reproductiva, como el endometrio. El 70% de las mujeres con SOP son obesas y entre el 60 – 80 % de ellas presentan resistencia a la insulina. La obesidad genera un ambiente pro-inflamatorio leve pero crónico, caracterizado por una alta producción de citoquinas pro-inflamatorias. Además, adiponectina y TNF-α, marcadores de obesidad, tienen un papel importante en la sensibilidad y la acción de insulina en los tejidos. Los niveles de adiponectina (sensibilizador de insulina) disminuyen, mientras que los de TNF-α (regulador negativo de la vía de la insulina) aumentan en mujeres obesas. Estos cambios podrían afectar el estado energético del endometrio, tejido que exhibe una anormal señalización de insulina bajo la condición SOP (ambiente hiperandrogénico / hiperinsulínico). Objetivo: Evaluar si el ambiente proinflamatorio representado por TNF-α, afecta la señalización de insulina a través de una disminución de la señalización de adiponectina o por la inactivación de IRS1, en endometrios de mujeres obesas con SOP. Metodología: En muestras de suero provenientes de cuatro grupos de estudio: Delgadas (peso normal), Delgadas-SOP, Obesas y Obesas-SOP (este último grupo es el único con hiperinsulinemia / hiperandrogenemia) (n=7 para cada grupo), se determinaron mediante ELISA los niveles de adiponectina, TNF-α e IL-6. En endometrios provenientes de los cuatro grupos de estudio, se determinó los niveles de proteína / mRNA de moléculas asociadas a las vías de señalización de TNF-α (TNF-α, TNFR1, TNFR2, NFκB (p65), IKK, IκB) y adiponectina (adiponectina, AdipoR1, AdipoR2, APPL1, AMPK) por IHQ / WB y qPCR; además, se evaluó el ambiente pro-inflamatorio a través de la proteína CD68 y los niveles de IL-6 e IL-6R, mediante IHQ. Los estudios in vitro se realizaron en cultivos de células estromales endometriales humanas (líneas T-HESC / St-T1b) bajo condiciones hiperandrogénicas / hiperinsulínicas, y se determinó el efecto de TNF-α sobre moléculas asociadas a su vía de señalización y a la vía de adiponectina. Se analizó además, la participación de NFκB, usando un inhibidor de NFκB (PDCT), en el efecto de TNF-α sobre la expresión de adiponectina en células St-T1b, por ICQ / WB; finalmente, se evaluó el efecto de TNF-α sobre los niveles de IRS1 fosforilado en tirosina (activante) o serina (inactivante) y sobre la activación de quinasas (S6K, JNK, AKT), posiblemente involucradas en la inactivación de IRS1 en una condición de resistencia a la insulina. Resultados: Se observó una menor concentración de adiponectina en sueros de Obesas-SOP (p<0,05), no se observaron cambios en las concentraciones de TNF-α sérica, mientras que IL-6 aumenta en sueros de Delgadas-SOP y ambos grupos de Obesas versus Delgadas (p<0,05). A nivel tisular, los niveles de adiponectina disminuyen (p<0,05) y los de TNF-α aumentan (p<0,001) en endometrios de Obesas-SOP. El contenido proteico de los receptores de TNF-α son mayores en grupos Delgadas-SOP y ambos grupos de Obesas (p<0,05); sin embargo, el nivel de TNFR2 y de NFκB nuclear presenta un importante aumento en endometrios de Obesas-SOP (p<0,001). En relación a IL-6 endometrial, ésta es menor en Delgadas versus los otros grupos (p<0,05), mientras que su receptor no cambia. Además, un mayor ambiente pro-inflamatorio se observó en endometrios de Obesas-SOP versus los otros grupos (p<0,01). Los ensayos in vitro, los cuales confirman en gran medida lo observado en el modelo ex vivo, muestran que la condición hiperandrogénica / hiperinsulínica disminuye los niveles de adiponectina y moléculas asociadas a su vía (APPL1 / AMPK), al igual que el efecto observado con TNF-α a través de la activación de NFκB (p<0,05). Además, TNF-α induce la expresión de su propia vía de señalización, aumentando los niveles de TNFR1 y -2, moléculas que activan NFκB y el contenido nuclear de NFκB. Por último, TNF-α aumenta la fosforilación en serina de IRS1 y la activación de S6K, JNK y AKT. Conclusión: En consecuencia, la obesidad podría afectar la señalización de insulina en el endometrio, a través del aumento del ambiente pro-inflamatorio y la producción de TNF-α local, lo que generaría una disminución de la señalización de adiponectina a través de NFκB y/o una inactivación de IRS1 a través de S6K/JNK bajo condiciones hiperandrogénicas / hiperinsulínicas, lo que comprometería el metabolismo energético necesario para el normal funcionamiento del tejido endometrial, lo que explicaría, en parte, las fallas reproductivas observadas en endometrios de mujeres obesas e hiperinsulínicas con SOP / Background: Polycystic ovary syndrome (PCOS), an endocrine-metabolic disorder, affects about 15% of women of childbearing age, mainly affecting ovarian function, but also alters the function of other tissues of reproductive importance, such as the endometrium. Seventy percent of women with PCOS are obese and between 60 - 80% of them have insulin resistance. Obesity generates a mild but chronic pro-inflammatory environment, characterized by high production of pro-inflammatory cytokines. In addition, TNF-α and adiponectin, obesity markers, have an important role in insulin sensitivity and action in tissues. In fact, adiponectin level (insulin sensitizer) decreases, whereas those of TNF-α (negative regulator of insulin pathway) increases in obese women. These changes could affect the energy state of the endometrium, tissue exhibiting abnormal insulin signaling under the SOP condition (hyperandrogenic / hyperinsulinemic environment). Objective: To evaluate whether the proinflammatory environment represented by TNF-α, affects insulin signaling through a decrease in adiponectin signaling or inactivation of IRS1, in endometrium of obese women with PCOS. Methodology: In serum samples from the four study groups: Lean (normal-weight), Lean-PCOS, Obese and Obese-PCOS (the latter group is the only one with hyperinsulinemia / hyperandrogenaemia) (n = 7 for each group) were determined: adiponectin, TNF-α and IL-6 levels by ELISA. In endometrium from the four study groups, was determined the levels of protein / mRNA of molecules associated with the signaling pathways of TNF-α (TNF-α, TNFR1, TNFR2, NFκB (p65), IKK, IκB) and adiponectin molecules (adiponectin, AdipoR1, AdipoR2, APPL1, AMPK) by IHC / WB and qPCR; additionally, the proinflammatory environment through CD68 protein and IL-6 / IL-6R levels, was evaluated by IHC. In vitro studies were conducted in human endometrial stromal cells (lines T-HESC / St-T1b) under hyperandrogenic / hyperinsulinic conditions, and the effect of TNF-α on molecule levels associated with its signaling pathway and adiponectin pathway, was determined by WB. NFκB participation was further analyzed using a NFκB inhibitor (PDCT) of TNF-α action on adiponectin expression in St-T1b cells by ICC; finally, it was evaluated the effect of TNF-α on in tyrosine phosphorylated levels of IRS1 (activating) or serine (inactivating) and kinases activation (S6K, JNK, AKT), possibly involved in the inactivation of IRS1 in an insulin resistance condition. Results: A lower concentration of adiponectin in serum from Obese- PCOS (p <0.05) was observed, no changes were found in serum concentrations of TNF-α, whereas IL-6 increases in serum from Lean-PCOS and both Obese groups versus the Lean group (p <0.05). At tissue level, adiponectin content decreases (p <0.05) and TNF-α increases (p <0.001) in Obese-PCOS endometrium. The protein content of TNF-α receptors are higher in Lean-PCOS groups and both Obese groups (p <0.05); however, nuclear NFκB and TNFR2 levels present an important increase in endometrium from Obese-PCOS (p <0.001). Regarding endometrial IL-6, a lower level in Lean versus the other groups was observed (p <0.05), while receptor content does not change. In addition, a higher pro-inflammatory environment was observed in Obese-PCOS endometrium versus the other studied groups (p <0.01). In vitro assays, which largely confirm what was observed in the ex vivo model, show a decrease of adiponectin levels and molecules associated with their pathway (APPL1 / AMPK) under hyperandrogenic / hyperinsulinic conditions, as well as, the effect observed with TNF-α through NFκB activation (p <0.05). In addition, TNF-α induces the expression of their own signaling pathway, increasing levels of TNFR1 and -2, molecules that activate NFκB and nuclear NFκB content. Finally, TNF-α increases phosphorylated IRS1 levels in serine and activation of S6K, JNK and AKT. Conclusion: Consequently, obesity may affect insulin signaling in the endometrium, by increasing the proinflammatory environment and local production of TNF-α, generating a decrease in adiponectin signaling through NFκB and / or inactivation of IRS1 through S6K / JNK under hyperandrogenic / hyperinsulinic conditions, which compromise the energy metabolism necessary for normal functioning of endometrial tissue. These abnormalities may explain in part, reproductive failures observed in endometria from obese and hyperinsulinic women with PCOS / Conicyt; Fondecyt

Objetivo: Determinar la asociación entre el hiperinsulinismo (HI) y embarazo en mujeres con síndrome de ovario poliquístico (SOP). Diseño: Revisión Sistemática y Meta-Análisis de estudios observacionales que evaluaron la asociación entre hiperinsulinismo y desenlaces obstétricos. Se realizó la búsqueda de la literatura a través de las bases PubMed-MEDLINE, Web of Science, Embase, Scopus y Cochrane hasta junio del 2015. Paciente(s): Mujeres en edad reproductiva con síndrome de ovario poliquístico. Principales medidas del resultado: El desenlace primario fue embarazo; los desenlaces secundarios fueron aborto espontaneo, diabetes gestacional y preeclampsia. Para el análisis del estudio se utilizó el modelo de efectos aleatorios. Resultados: Encontramos siete cohortes prospectivas y cuatro estudios de casos y control (n=711). La proporción de embarazo en las mujeres con hiperinsulinemia fue significativamente menor que en las mujeres sin hiperinsulinemia (45/213 [21.1%] vs 114/273 [41.8%], OR 0.36, IC 95% 0.21-0.62, P<0.001). No hubo diferencia en porcentaje de abortos entre aquellas con hiperinsulinemia y aquellas sin hiperinsulinemia (9/100 [9.0%] vs 15/147 [10.2%], OR 0.90, IC 95% 0.36-2.22, P˃0.001). La información fue escasa respecto a los efectos de en diabetes gestacional y pre-eclampsia. Conclusiones: Existe asociación significativa e inversa entre hiperinsulinismo y embarazo en mujeres con síndrome de ovario poliquístico. Asimismo, no se encontró diferencias entre pacientes SOP con HI y pacientes SOP sin HI respecto al riesgo de aborto. Por otro lado, no hubo información suficiente para analizar los desenlaces diabetes gestacional y preeclampsia. / OBJECTIVE: To determine the association between hyperinsulinism (HI) and pregnancy in women with polycystic ovarian syndrome (PCOS). PATTERN: Systematic Review and Meta-Analysis of observational studies that evaluated the association between hyperinsulinism and obstetric outcomes. We searched the literature through the databases of PubMed-MEDLINE, Web of Science, Embase, Scopus and Cochrane databases until June 2015. PATIENT(s): Women on reproductive age with polycystic ovarian syndrome. MAIN EFFECTS OF RESULTS: The primary outcome was pregnancy; The secondary outcomes were miscarriage, gestational diabetes and preeclampsia. For the analysis of the study we used the random effects model. RESULTS: We found 7 prospective cohorts and 4 case-control studies (n = 711). The percentage of pregnancy in women with hyperinsulinemia was significantly lower than in women without hyperinsulinemia (45/213 [21.1%] vs 114/273 [41.8%], or 0.36, 95% ci 0.21-0.62, p <0.001). There was no difference in the percentage of miscarriages between women with hyperinsulinemia and women without hyperinsulinemia (9/100 [9.0%] vs 15/147 [10.2%], or 0.90, 95% ci 0.36-2.22, p0.001). The information was scarce regarding the effects of gestational diabetes and pre-eclampsia. Conclusions: There is a significant and inverse association between hyperinsulinism and pregnancy in women with PCOS. Likewise, we do not found differences between PCOS patients with HI and PCOS patients without HI regarding the risk of miscarriage.On the other hand, there was not enough information to analyze the results of gestational diabetes and preeclampsia. / Tesis

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