Universiẗat, Diss., 2004--München.

Th.--Sci. phys.--Nancy--I.N.P.L., 1984.

Th.--Pharm.--Paris 5, 1982. N°: 75.

A resposta de células eucarióticas após exposição a estresse genotóxico é a ativação de uma intrincada rede de sensores, transdutores e efetores envolvidos em vias de reparação de DNA e controle de ciclo celular. Para garantir a fidelidade dessas vias regulatórias, existem mecanismos celulares evolutivamente conservados, chamados pontos de checagem, que monitoram a estrutura dos cromossomos, coordenando reparação de DNA e progressão do ciclo celular, controlando a capacidade da célula em parar o ciclo celular como resposta a danos no DNA, concedendo tempo para que ocorra a reparação. Os processos de reparação de danos no DNA são bem estabelecidos, porém, a sinalização para ativação de parada de ciclo celular na resposta a estas lesões é menos conhecida. A proteína Kin3 é uma serina treonina cinase de Saccharomyces cerevisiae estruturalmente relacionada à NIMA, um regulador mitótico descrito inicialmente no fungo Aspergillus nidulans, o qual está envolvido na regulação da progressão da fase G2/M e na organização de alguns eventos mitóticos. Como a maioria dos reguladores de ciclo celular é conservada, neste trabalho avaliou-se a função de Kin3p na resposta a danos no DNA. Nossos resultados demonstram que a deleção do gene KIN3 induz sensibilidade a cisplatina, doxorubicina, mustarda nitrogenada e MMS. Além disso, o mutante kin3 não apresenta uma parada de ciclo celular eficiente no ponto de checagem G2/M e uma diminuição da reparação das quebras no DNA após estes tratamentos, sugerindo que Kin3p possa estar envolvida no reconhecimento ou sinalização destas quebras. A expressão do gene KIN3 em resposta a estresse genotóxico está aumentada, assim como há um aumento da expressão da proteína codificada por este gene. O co-tratamento com cafeína, um inibidor das proteínas de sinalização de danos no DNA Mec1 e Tel1, induz um aumento da sensibilidade aos agentes genotóxicos no mutante kin3 e diminui a expressão do gene KIN3 na linhagem selvagem, sugerindo que a proteína Kin3 possa atuar em uma via de sinalização dependente de Mec1p/Tel1p. Na busca por esclarecimentos a respeito da via de atuação da proteína Kin3, avaliou-se a interação da mesma com as proteínas do complexo Mre11p/Rad50p/Xrs2p, já que previamente Mrellp tinha sido apontada como parceira molecular da proteína relacionada a NIMA de humanos Nek1. Nossos resultados de interação in vitro utilizando o sistema duplo híbrido, demonstraram que a proteína Kin3 interage com cada uma das proteínas do complexo MRX. Esta interação foi confirmada pela epistasia entre os mutantes kin3Δ e mrelΔl, rad50Δ ou xrs2Δ em ensaios de sensibilidade a cisplatina, mustarda nitrogenada e 8-MOP foto-ativado. A expressão do gene KIN3, que como mencionada anteriormente está aumentada na resposta a estresse genotóxico na linhagem selvagem, também está aumentada nos mutantes do complexo MRX, demonstrado que a ativação do gene KIN3 independe da formação do complexo MRX. O conjunto de dados apresentados nesta tese demonstra, pela primeira vez, o envolvimento da proteína Kin3 na resposta a agentes indutores de adutos no DNA, em uma via dependente de Tel1p/Mec1p, através da interação com o complexo MRX. Embora, o progresso no entendimento dos mecanismos de detecção, sinalização e reparação de danos no DNA tem sido grande, muitos detalhes moleculares ainda esperam por respostas e o estudo de novas proteínas pode ser importante para o entendimento destas lacunas. / The eukaryotic cells response to genotoxic stress is the activation of an intricate network of sensors, transducers and effectors involved in DNA repair pathways and cell cycle control. These regulatory pathways must be quite faithful. To reach this fidelity, there are cellular mechanisms evolutively conserved, called cell cycle checkpoints, which monitor the structure of chromosomes and coordinate DNA repair, cell cycle progression by controlling the cell's ability to stop the cell cycle in response to DNA damage, providing time for repair to occur. The DNA damage repair mechanisms are well established. However, the signaling for cell cycle arrest activation in response to these lesions is less well known. Kin3 protein is a serine/threonine kinase of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae that is related to the NIMA (Never-In Mitosis, gene A) protein of Aspergillus nidulans, which is involved in the response to DNA damage, regulation of G2/M phase progression and is important for orderly mitotic events. Since the majority of cell cycle regulators are conserved throughout the eukaryotic domain, in this work we show that KIN3 gene deficient cells present sensitivity and fail to arrest properly at G2/M-phase checkpoint in response to the DNA damage inducing agents MMS, cisplatin, doxorubicin and nitrogen mustard, suggesting that Kin3 can be involved in DNA strand breaks recognition or signaling. In addition, there is an increase in KIN3 gene expression in response to the mutagenic treatment, which was confirmed by the increase of Kin3 protein. We also showed that co-treatment with caffeine, a Mec1 and Tel1 signaling DNA damage proteins inhibitor, induces a slight increase in the susceptibility to genotoxic agents in kin3Δ cells and abolishes KIN3 gene expression in wild-type strain, suggesting that Kin3 protein can play a role in Tel1/Mec1-dependent pathway activation induced after genotoxic stress. In search for understanding the Kin3 action mechanism in DNA damage response, we evaluated the interaction of this protein with each component of Mre11/Rad50/Xrs2 complex, since Mre11 had previously been identified as Nek1 (NIMA-related human protein) molecular partner. Taking into account that the phenotype of Kin3-deficient cells is rather similar to Nek1-deficient cells and that the MRX complex is highly conserved, we show that the Kin3 protein interacts with each protein of the MRX complex using a two-hybrid assay. These results were confirmed by the epistasis observed between KIN3 and MRX in the sensitivity to cisplatin, nitrogen mustard and photo-activated 8-methoxypsoralen. The KIN3 gene expression was upregulated in the wild type strain after mutagenic stress, in the same way, is also increased in MRX mutants demonstrated that KIN3 gene activation is independent of MRX complex formation. The data presented in this thesis demonstrate, for the first time, the involvement of Kin3 DNA adducts damage response in Tel1/Mec1 dependent pathway, by MRX complex interaction. Although progress in understanding the mechanisms of detection, signaling and repair of DNA damage has been increased, many molecular details are still waiting for answers and the study of new proteins may be important for the understanding of these gaps.

A ecteinascidina-743 (ET-743) é um alcalóide marinho que tem apresentado potente atividade antitumoral contra uma variedade de tumores humanos, incluindo sarcomas, câncer de mama e de ovário. Em resposta aos resultados promissores que a ET-743 tem mostrado na clínica, o seu mecanismo de ação vem sendo amplamente investigado. Sabe-se que a ET-743 se liga na volta menor do DNA e influencia a dinâmica da hélice. Neste trabalho, o mecanismo de ação da ET-743 foi estudado em modelos eucarióticos de células da levedura Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos, incluindo linhagens tumorais humanas. A utilização do modelo de levedura revelou que o sistema de reparação por excisão de bases está envolvido com o mecanismo de citotoxicidade da ET-743. Além disso, o emprego de mutantes de levedura permitiram explicar como ocorre a tolerância e a reparação dos danos gerados pela ET-743 nas linhagens que são resistentes à ação da droga. Além do mecanismo molecular proposto, este trabalho proporcionou uma possível explicação para a especificidade da ET-743 em tumores do tipo sarcomas. Considerando que a resistência dos sarcomas à maioria das drogas clássicas seja devido a superexpressão de APE1, entre outros fatores, e que a ausência desta proteína torna as células eucarióticas resistentes à ET-743, os resultados obtidos nesta tese contribuem para explicar por que sarcomas, tumores que superexpressam esta proteína, são sensíveis ao tratamento com ET-743. Além dos dados envolvendo o BER, este estudo permitiu explicar como ocorre o processamento da lesão gerada pela ET-743 no DNA. A utilização de linhagens celulares de mamíferos com deficiências em proteínas específicas combinado a técnicas bioquímicas e moleculares revelaram que a ET-743 forma adutos no DNA que são convertidos em uma lesão secundária durante a replicação do DNA. Pela primeira vez foi mostrado que a ET-743 induz a formação de quebras duplas dependentes de replicação e que o sistema de recombinação homóloga é responsável pela reparação destes danos. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a funcionalidade das vias de reparação de DNA é uma ferramenta útil para predizer a resposta clínica da droga e, dessa forma, contribuir na seleção de pacientes que mais podem se beneficiar do tratamento. / Ecteinascidin 743 is a marine alkaloid that has shown potent antitumor activity against several human tumor types, including soft tissue sarcomas, breast and ovarian cancer. Because of these promising data, there is a strong interest in evaluating its mechanism of action. ET-743 binds to the minor groove of DNA and induces helix unwinding. Here, we studied its mechanism of action in both yeast Saccharomyces cerevisiae and mammalian cells, including human tumor cell lines. Using the yeast model, we have demonstrated that the base excision repair pathway is strongly involved in ET-743 cytotoxicity. Moreover, this work clarified how ET-743-induced DNA damages can be tolerated and repaired in yeast resistant cell lines. In addition to the molecular model we have suggested to explain the mechanism of action of ET-743, this work brings new insights to explain the specificity of ET-743 towards soft tissue sarcomas. Indeed, sarcomas, while resistant to most of the chemotherapeutic agents, over-express APE1. Thus, the involvement of APE1 in cell killing, could explain why sarcomas, as well as tumors expressing high levels of APE1, are sensitive to the treatment with ET-743. This work was extended to mammalian cells in order to better understand the processing of the ET-743-induced DNA damage. Molecular and biochemical experiments were combined and revealed that the primary ET-743 DNA-adducts is transformed in DNA double strand breaks, a secondary type of more toxic DNA lesion. This formation is entirely dependent on the progression of the DNA replication fork. The use of mammalian cell lines, deficient in specific repair proteins, demonstrated for the first time that these lesions were uniquely processed by the homologous recombination repair pathway. Thus, our data establish a new rational, based on the measure of the expression levels of selected repair fa ctors, both to predict clinical response and to facilitate the selection of the patients particularly likely, or not, to benefit from the treatment with ET-743.

O cádmio é um metal pesado com propriedades tóxicas e carcinogênicas. A toxicidade deste metal pode ser resultado da sua habilidade de (i) formar complexos com a glutationa, gerando aumento do estresse oxidativo, (ii) competir com o zinco por sítios de ligação em proteínas, (iii) causar quebras de fita simples no DNA e (iv) inibir a via associada ao reparo de erros no emparelhamento de bases do DNA. A absorção de cádmio para o interior celular pode ser feita por proteínas que transportam metais essenciais como zinco, cálcio, manganês e ferro, tal como a proteína Zrt1 de leveduras (transportador de alta afinidade para zinco). Em Saccharomyces cerevisiae, o mecanismo de desintoxicação de cádmio mais conhecido envolve a conjugação do metal com glutationa, formandos complexos Cd.[GS]2, que são transportados para o interior do vacúolo pela proteína Ycf1. Além disso, sabe-se que alguns poucos metais essenciais são capazes de reduzir a toxicidade do cádmio. O objetivo do presente estudo foi verificar o efeito protetor de íons de magnésio e cálcio contra os danos causados pelo cádmio em linhagens de S. cerevisiae mutantes para proteínas envolvidas com a homeostase de cádmio (gsh1 , ycf1 e zrt1 ). Além disso, foi avaliado o envolvimento de proteínas transportadoras de cálcio presentes no complexo de Golgi e vacúolo (Pmr1p e Pmc1p, respectivamente) com a desintoxicação de cádmio por vesículas da via secretória de S. cerevisiae. Os resultados demonstram que, tanto na linhagem selvagem quanto nas mutantes gsh1 , ycf1 e zrt , a presença de íons de cálcio ou magnésio é capaz de proteger as células contra os efeitos tóxicos do cádmio. Essa proteção está associada a uma redução do conteúdo intracelular de cádmio que ocorre nos tratamentos simultâneos com magnésio e cálcio. Em relação aos transportadores de cálcio, foi possível observar que a linhagem pmc1 não é sensível à cádmio enquanto que a linhagem pmr1 é altamente sensível a presença do metal. Para confirmar o envolvimento da proteína Pmr1 com a desintoxicação de cádmio, a linhagem pmr1. foi submetida a um ensaio de complementação fenotípica utilizando-se um vetor centromérico contendo o gene PMR1. Os resultados deste ensaio confirmaram que o fenótipo de sensibilidade a cádmio da linhagem pmr1. pode ser revertido pela presença de uma cópia funcional do gene PMR1. Adicionalmente, os resultados utilizando PIXE (Particle Induced X- Ray Emission) para quantificar o conteúdo intracelular de cádmio mostraram que na pmr1. o acúmulo intracelular de íons Cd2+ é três vezes maior doque na linhagem selvagem e na linhagem pmr1. contendo o vetor com o gene PMR1 funcional. A proteína Pmr1 é responsável pelo acúmulo de cálcio em vesículas do complexo de Golgi, as quais podem ser destinadas para a via secretória de S. cerevisae. Considerando os resultados obtidos neste trabalho e a similaridade entre os íons Ca2+ e Cd2+ em termos de raio atômico, é possível inferir que o cádmio, assim como o cálcio, pode ser bombeado para o interior do Golgi pela Pmr1p e posteriormente transportado pela via secretória. Sendo assim, este trabalho descreve desintoxicação de cádmio envolvendo a eliminação do metal pela via secretória de S. cerevisiae. / Cadmium is a heavy metal with toxic and carcinogenic properties. The toxicity of this metal depends on its ability to: (I) produce complexes with glutathione, therefore increasing oxidative stress, (II) compete with zinc for binding to proteins, (III) cause DNA chain single breaks, and (IV) inhibit the mismatch repair pathway associated. Cadmium uptake into the cell occurs through proteins that transport essential metals, such as calcium, zinc, manganese, and iron, such as the yeast Zrt1 protein transporter with high zinc affinity. In Saccharomyces cerevisiae, the best known cadmium detoxification mechanism involves metal coupling with glutathione, forming the complex Cd[GS]2, which is carried inside to the vacuole through the Ycf1 protein. Moreover, it is well known that some essential metals are capable of reducing cadmium toxicity. The aim of the present study was to verify the protective effect of magnesium and calcium ions against the damages caused by cadmium in S. cerevisiae strains mutant for proteins involved with cadmium homeostasis (gsh1 , ycf1 e zrt1 ). In addition, the involvement of a calcium transporter present in the Golgi apparatus and in the vacuole (Pmr1p and Pmc1p, respectively) with the detoxification of cadmium by vesicles of the secretory pathway of S. cerevisiae was evaluated.The results demonstrated that both in the wild type strain and in gsh1 , ycf1 , and zrt mutant strains, the presence of calcium or magnesium ions was able to protect cells against the toxic effect of cadmium. This protection was associated with a reduction of intracellular cadmium content that occurs in the simultaneous treatments with magnesium and calcium As to calcium transporters, it was possible to observe that pmc1. is not sensitive to cadmium, whereas pmr1. is highly sensitive to the presence of this metal. In order to confirm the involvement of Pmr1p with cadmium detoxification, pmr1. strains were submitted to a phenotypic complementation assay using centromeric vector containing PMR1 gene. The results of this assay confirmed that pmr1. cadmium sensitive phenotype can be reversed by the presence of a functional copy of PMR1 gene. Additionally, when using PIXE (Particle Induced X Ray Emission) to quantify intracellular cadmium content, results showed that pmr1. intracellular accumulation of Cd2+ ions is three times higher than in the wild type strain, and the pmr1. containing the vector with PMR1 functional gene.Pmr1 protein is responsible for the accumulation of calcium in vesicles of Golgi apparatus, which can be directed to the secretory pathway of S. cerevisae. Considering the results obtained in this study, and the similarity between Ca2+ and Cd2+ ions in terms of atomic radius, it is possible to infer that both cadmium and calcium can be pumped inside the Golgi apparatus by Pmr1p, and later transported by the secretory pathway. Therefore, this work describes cadmium detoxification involving the elimination of this metal by the secretory pathway of S. cerevisiae.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o gene KIN3 codifica uma serina-treonina cinase cuja função ainda é desconhecida. A proteína Kin3 é homóloga estrutural da proteína NIMA, de Aspergillus nidulans, a qual é necessária para a transição da fase G2/M do ciclo celular, e ainda possui papel na resposta a danos no DNA. Cinases relacionadas à NIMA (Nek´s) foram identificadas em diferentes espécies, e mamíferos contêm 11 Nek´s. Algumas destas cinases apresentam propriedades semelhantes a NIMA, estando envolvidas na progressão do ciclo celular e na resposta a danos no DNA. A proteína Kin3 possui propriedades semelhantes a Nek1 e Nek2. Nek1 interage com proteínas envolvidas na sinalização e reparação de danos no DNA. Linhagens mutantes kin3Δ são defectivas na parada da fase G2/M do ciclo celular em resposta a danos no DNA e apresentam uma pronunciada sensibilidade a diversos agentes mutagênicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do gene KIN3 com os genes do complexo MRX (MRE11/RAD50/XRS2), envolvido na sinalização e reparação de danos no DNA, bem como na manutenção da integridade dos cromossomos. O perfil de sensibilidade dos simples e duplos mutantes sugerem uma interação epistática entre o gene KIN3 e os genes do complexo MRX, na resposta a danos causados por 8-metoxipsoraleno fotoativado, cisplatina e mustarda nitrogenada. A expressão do gene KIN3 durante estresse mutagênico não apresentou diferenças significativas entre a linhagem selvagem e as linhagens mutantes mre11Δ, rad50Δ e xrs2Δ. Os resultados obtidos ainda indicam que a proteína Kin3 possa estar agindo junto com o complexo MRX na via Mec1/Tel1 de sinalização de danos no DNA. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the KIN3 gene codifies a serine-threonine cinase whose function is still unknown. The Kin3 protein is a structural homolog of NIMA protein of Aspergillus nidulans, which is necessary to G2/M transition, and has a role in DNA damage response. NIMA-related kinases (Nrk´s) were identified in different species, and mammals contain eleven Nrk´s. Some of these kinases display similar properties with NIMA, being involved in cell cycle progression and DNA damage response. The Kin3p have similar properties with Nek1 and Nek2. Nek1 interacts with proteins involved in signaling and repair of DNA damage. Mutant strains in KIN3 are defective in the G2/M-phase checkpoint in response to DNA damage and display a pronounced sensitivity to several mutagens. The aim of this work was to evaluate the interaction between KIN3 gene and the genes of MRX complex (MRE11/RAD50/XRS2), involved in signaling and repair of DNA damage, as well in the maintenance of chromosome integrity. The sensitivity profile of single and double mutants suggests an epistatic interaction between the KIN3 gene and the genes of MRX complex, in damage response induced by photo-activated methoxypsoralen, cisplatin and nitrogen mustard. The KIN3 gene expression during mutagenic stress does not show significant differences between the wild type and mutant strains mre11Δ, rad50Δ and xrs2Δ. The obtained results indicate that the Kin3 protein can act together with the MRX complex in the Mec1/Tel1 pathway of DNA damage signaling.

Os vinhedos estão entre as formas mais intensivas de plantio e a diversidade de leveduras associadas a estes vinhedos ainda não foram caracterizadas e, informações concernentes à ecologia e diversidade ainda é limitada. Neste contexto, o trabalho tem como objetivo estudar a diversidade e riqueza de leveduras associadas a regiões produtoras de vinho, selecionar linhagens do gênero Saccharomyces com fenótipos desejáveis para vinificação. As leveduras foram isoladas de três vinhedos localizados em Pinheiro Preto, Serra do Marari e Campos Novos no sul do Brasil. Em Pinheiro Preto, o mais antigo, foi coletado 20 pontos localizados nos vinhedos e na cantina para um estudo transversal, nos outros dois vinhedos foram coletados cachos de uvas. Após o isolamento em meio enriquecido (YPD), foram incubados por 48 horas a 28°C. Foi utilizado um procedimento de triagem consistindo de agrupamento de leveduras com o mesmo perfil obtido com (GTG)5 MSP-PCR fingerprinting, seguido de identificação por sequenciamento do domínio D1/D2 (LSU rDNA) ou região ITS1-5.8S-ITS2 de um ou alguns representantes selecionados de cada grupo de leveduras, porém espécies não relacionadas foram agrupados em um mesmo grupo. Resultando em sensibilidade alta e especificidade baixa de (GTG)5 MSP-PCR fingerprinting. Para análise da biodiversidade e riqueza de espécies foram sequenciados 106 linhagens identificadas em 22 espécies. Os índices de estimativas de riqueza aplicados variaram entre as espécies para cada vinhedo (ICE1, ACE, Jackknife 2, Bootstrap, p<0,001). A comparação da diversidade taxonômica de leveduras provenientes destas regiões usando o índice Recíproco de Simpson apresentou diferença significativa entre os vinhedos de Serra do Marari e Campos Novos (5,72±1,18 e 2,92±0,36, p<0,0001). Em geral, observamos que os vinhedos diferenciaram entre si para os índices avaliados (FAD2, FDc e Rao p<0,0001). Foi observada uma possível dispersão de S. cerevisiae entre a cantina e o parreiral em Pinheiro Preto. Através da análise fenotípica sugere-se que os isolados 06CE, 11 CE e 33CE sejam de Saccharomyces cariocanus. Foi possível determinar 4 perfis genotípicos com o primer EI1. De acordo com o perfil de compostos voláteis produzidos foi possível agrupar as linhagens. Os vinhedos apresentaram uma biodiversidade de leveduras, demonstrando ser um ambiente para o isolamento de linhagens do gênero de Saccharomyces de interesse industrial e enológico. / The vineyards are among the most intensive forms of crop and the diversity of yeasts associated with vineyards have not yet been characterized, and information concerning the ecology and diversity is restricted. In this context, the work aims to study the diversity and richness of yeasts associated with wine-producing regions, select Saccharomyces strains with desirable phenotypes for winemaking. The yeasts were isolated from three vineyards located in Pinheiro Preto, Serra do Marari and Campos Novos in southern Brazil. Samples were collected from 20 sites located in the vineyards. In Pinheiro Preto cross evaluation since it is the oldest of the vineyards studied, were collected 20 points located in the vineyards and in the winery, the other two vineyards were collected bunches of grapes. After isolation in YPD enrichment medium were incubated for 48 hours at 28 °C. We used a screening procedure group consisting of yeast with the same profile obtained (GTG)5 MSP-PCR fingerprinting, followed by sequencing to identify the D1/D2 domain (LSU rDNA) or ITS1-5.8S-ITS2 region of one or some selected representatives from each group of yeasts, but unrelated species were clustered into one group. For analysis of biodiversity and species richness were sequenced 106 strains identified in 22 species. The estimated species richness applied varied between species for each vineyard (ICE1, ACE, Jackknife 2, Bootstrap, p <0.001). A comparison of the taxonomic diversity of the yeasts from these regions using the reciprocal Simpson index showed a significant difference between the Serra do Marari and Campos Novos vineyards (5.72 ± 0.36 and 2.92 ± 0.36, p <0.0001). The possible spreading of Saccharomyces cerevisiae from the winery to the vineyard in Pinheiro Preto was observed. By phenotypic analysis suggests that the isolated 06CE, 33CE and 11CE is Saccharomyces cariocanus. Was determined 4 genotypic patterns using primer EI1.By the determination of the volatile profile was possible to group the strains of Saccharomyces. The vineyards showed a biodiversity yeast, demonstrating to be an environment for the isolation of the strains Saccharomyces of industrial interest oenological.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:38:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328840.pdf: 1962015 bytes, checksum: f9c31db016f4d9a0a403abed6e0281ea (MD5) Previous issue date: 2014 / Durante a produção industrial de álcool combustível, um dos fatores limitantes no processo é o estresse promovido às células de levedura pelas altas concentrações de etanol presentes no meio. Este trabalho teve por objetivo incrementar a tolerância ao etanol de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae através da modificação da região promotora de dois genes: o gene TRP1 envolvido na síntese de triptofano, ou o gene MSN2 que codifica para um fator de transcrição que regula a resposta ao estresse geral em S. cerevisiae. As linhagens recombinantes foram desenvolvidas usando técnicas de engenharia genômica baseadas em PCR, para inserir o promotor forte e constitutivo PADH1 na região promotora dos genes alvo. Embora a linhagem industrial utilizada (CAT-1) seja diplóide, apenas um dos alelos do gene alvo foi modificado. Após confirmação por PCR das modificações realizadas no genoma das linhagens recombinantes, a sobre-expressão dos genes foi quantificada por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a linhagem de levedura industrial é mais tolerante ao etanol (podendo crescer em até 14% do álcool), quando comparado com uma linhagem de laboratório (nessa última 10% de etanol inibe totalmente o crescimento). Em ambas a linhagens a sobre-expressão do gene TRP1 claramente incrementou a tolerância ao etanol. As linhagens industriais sobre-expressando o gene MSN2, ou uma versão truncada do gene (MSN2-T, sem os primeiros 48 aminoácidos), mostraram-se igualmente mais tolerantes ao etanol. A linhagem que sobre-expressa o gene MSN2 mostrou-se também mais resistente ao estresse salino, mas mais sensível ao estresse oxidativo, enquanto que a linhagem que sobre-expressa o gene MSN2-T foi mais resistente a esse último estresse. A análise dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) revelou que o estresse provocado pelo etanol aumenta significativamente os níveis de ROS nas células, sendo que ocorreu uma redução na quantidade desses compostos nas linhagens modificadas no gene MSN2. Em seguida, foi investigado se essa melhora no crescimento celular na presença de altas concentrações de etanol leva a produtividades mais elevadas de etanol durante a fermentação de altas concentrações (200 g/L) de sacarose, inclusive na presença de diferentes concentrações estressantes de etanol no início das fermentações. Os resultados revelaram que não ocorreram diferenças significativas entre a linhagem industrial CAT-1 e as linhagens recombinantes nos diferentes parâmetros fermentativos analisados, tanto em processos de bateladaXsimples quanto na batelada alimentada, com reciclo celular. O estresse alcoólico afetou principalmente o consumo dos monossacarídeos (glicose e frutose) produzidos na hidrólise da sacarose. Em conclusão, os resultados sugerem que uma maior tolerância ao etanol (através das modificações genômicas realizadas neste trabalho), não significa necessariamente uma maior produção de etanol pela linhagem industrial de S. cerevisiae.<br> / Abstract : During fuel alcohol industrial production, one of the limiting factors in the process is the stress promoted to yeast cells by high ethanol concentrations in the medium. This study aimed to improve the ethanol tolerance of an industrial Saccharomyces cerevisiae strain by modifying the promoter region of two genes: the TRP1 gene involved in the synthesis of tryptophan, or the MSN2 gene encoding for a transcription factor that regulates the general stress response in S. cerevisiae. The recombinant yeast strains were developed using PCR-based genomic engineering techniques, to insert the strong and constitutive PADH1 promoter in the promoter region of the target genes. Although the industrial strain used (CAT-1) is diploid, only one allele of the target gene was modified. After confirmation by PCR of the changes made in the genome of the recombinant strains, gene overexpression was quantified by qRT-PCR. Our results show that the industrial yeast strain is more tolerant to ethanol (being able to grow in up to 14% alcohol), when compared to a laboratory strain (10% ethanol completely inhibited growth of these cells). In both types of strain overexpressing the TRP1 gene clearly improved ethanol tolerance. The industrial strains overexpressing the MSN2 gene, or a truncated version of the gene (MSN2-T, without the first 48 amino acids), were also more ethanol tolerant. The strain that overexpresses the MSN2 gene was also more resistant to a salinity stress, but more sensitive to an oxidative stress, while the strain that overexpresses MSN2-T was more resistant to this last stress. The analysis of the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) revealed that stress promoted by ethanol significantly increases the levels of ROS in cells, and there was a reduction in the amount of these compounds in the strains modified in the MSN2 gene. Afterwards, it was investigated whether this improvement in the cellular growth under high ethanol concentrations leads to higher ethanol productivity during fermentation of high (200 g/L) sucrose concentrations, even in the presence of different stressful ethanol concentrations at the beginning of fermentation. The results revealed that there were no significant differences between the industrial strain CAT-1 and the recombinant strains in the different fermentation parameters analyzed, both in simple batch and fed batch processes with cell recycle. The alcoholic stress affected mainly the consumption of monosaccharides (glucose and fructose) produced by the hydrolysis of sucrose. In conclusion, the results suggest that increased tolerance toXIIethanol (through genomic modifications carried out in this work), does not necessarily mean a higher ethanol production by an industrial S. cerevisiae strain.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-04-29T21:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327368.pdf: 3063519 bytes, checksum: c6a97882368c09a154ff5d56dc381fc3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A biomassa lignocelulósica é uma atrativa matéria prima para a produção de bioetanol, visto que este é um resíduo abundante, renovável e que não compete com a produção de alimento. Saccharomyces cerevisiae, entretanto, não é capaz de fermentar o principal açúcar presente nesta biomassa, a xilose. Para solucionar este problema é necessária a inserção da via para metabolismo de xilose nesta levedura, mas o transporte deste açúcar, todavia persiste como um dos passos limitantes para a sua eficiente fermentação. A levedura Spathaspora arborariae, por outro lado, é naturalmente capaz de fermentar xilose com alta capacidade. Neste trabalho analisamos diversas sequências no genoma de S. arborariae, relacionadas ao transporte e metabolismo de xilose. Paralelamente, estudamos o papel dos transportadores de hexose codificados pelos genes HXT no transporte de xilose em linhagens de S. cerevisiae deletadas para um dos genes HXT1-HXT5 (linhagens hxt-knockout) ou para todos os genes HXT1-HXT7 e GAL2 (linhagem hxt-null). Avaliamos também o impacto da hidrólise extracelular de sacarose na co-fermentação de xilose em duas linhagens industriais recombinantes de S. cerevisiae. Os resultados indicaram que S. arborariae possui pelo menos dez sequências que codificam para possíveis transportadores de açúcar, embora possua apenas uma cópia dos genes para o metabolismo de xilose e via das pentose-fosfato. Com relação aos transportadores codificados pelos genes HXT, constatamos que somente através da sobre-expressão destes genes foi possível observar melhorias no desempenho fermentativo das linhagens hxt-knock ou hxt-null. Quando sobre-expresso na linhagem hxt-null, o transportador codificado pelo gene HXT1 permitiu o máximo consumo de açúcar e produção de etanol, mas foi incapaz de permitir o consumo de somente xilose. O gene HXT7 possibilitou a eficiente fermentação de xilose, mas em co-fermentações de glicose e xilose mostrou uma clara preferência por glicose. O gene HXT5 não possibilitou a utilização de xilose, enquanto que HXT2 codificou para o transportador que permitiu o consumo e fermentação de xilose com a mesma velocidade que glicose, mesmo em co-fermentações de glicose e xilose, embora tenha apresentado fermentações incompletas com consumo de apenas 58% da xilose. Com relação às linhagens industriais, foi observado que ambas as linhagens industriais consumiram xilose mais rapidamente nas co-fermentações, embora este consumo tenha sido mais eficiente em co-fermentações de sacarose com xilose. Foi observado ainda uma produção de etanol 23% superior para a linhagem que não hidrolisa sacarose extracelularmente nas co-fermentações de sacarose e xilose. Concluindo, os transportadores de açúcar de S. arborariae encontrados no genoma apresentam grande potencial para a expressão heteróloga em S. cerevisiae, e a sobre-expressão dos genes HXT1, HXT2 ou HXT7 endógenos de S. cerevisiae, aliado ao emprego de linhagens que hidrolizem a sacarose preferencialmente de maneira intracelular, permitirão a produção de etanol integrando as tecnologias de primeira e segunda geração no Brasil.<br> / Abstract : The lignocellulosic biomass is an attractive feedstock for bioethanol production, since this is an abundant and renewable waste that does not compete with food production. Saccharomyces cerevisiae, however, is not able to ferment the main sugar present in this biomass, the xylose. To solve this problem the insertion of the pathway for xylose metabolism is required in this yeast, the transport of sugar, however, remains as one of the limiting steps for the efficient xylose fermentation. The yeast Spathaspora arborariae, on the other hand, is naturally capable of fermenting xylose with high capacity. In this work we analyzed several sequences in the genome of S. arborariae related to the transport and metabolism of xylose . Parallel to this, we have studied the role of hexose transporters encoded by the HXT genes for the transport of xylose in S. cerevisiae strains deleted for the HXT1-5 genes (hxt-knockout strains) or all HXT1-7 and GAL2 genes (hxt-null strain). We also investigated the impact of extracellular hydrolysis of sucrose in fermentation and co-fermentation of xylose using two recombinant industrial strains of S. cerevisiae. Our results indicate that S. arborariae has at least ten sequences encoding for sugar transporters, although has only one copy of the genes for the metabolism of xylose and pentose phosphate pathway. Regarding the transporters encoded by the HXT genes, we saw that only by the overexpression of these genes it was observed improvements in the fermentation performance of the hxt-knockout or hxt-null strains. When overexpressed in the hxt-null strain, the transporter encoded by the HXT1gene achieved the higher sugar consumption and ethanol production, but was unable to grow on xylose only, HXT7, however, enabled the efficient fermentation of xylose, but in co-fermentation of glucose and xylose showed a clear preference for glucose. HXT5 was not able to consume xylose, while the transporter encoded by HXT2 gene allowed the consumption of xylose at the same rate as glucose, even in glucose and xylose co-fermentation, albeit exhibited truncated fermentation with less than 58% of the xylose consumption. Regarding the industrial strains, we observed a 23% higher ethanol production from the strain that does not hydrolyze sucrose extracellularly in sucrose and xylose co-fermentation assays. We also observed that both industrial strains consumed xylose faster in co- fermentations, although this consumption has been more efficient in sucrose co-fermentation rather than in glucose. In conclusion, the S. arborariae sugar transporters found here have great potential for heterologous expression in S. cerevisiae, furthermore the overexpression of the endogenous HXT1, HXT2 or HXT7 genes from S. cerevisiae and strategies employing strains that preferentially hydrolyze sucrose intracellularly will contribute in a scenario for ethanol production using technologies from the first and second generation in Brazil.