In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob zerebrale Mikroblutungen (CMB) bereits im frühen Verlauf nach ischämischem Schlaganfall (IS) oder Transitorisch-Ischämischer Attacke (TIA) mit kognitivem Abbau assoziiert sind und ob spezifische kognitive Domänen besonders betroffen sind. Der Vergleich zweier Probandengruppen mit IS/TIA und CMB bzw. IS/TIA ohne CMB hinsichtlich ihrer Ergebnisse in der neuropsychologischen Testbatterie CERAD ergab, dass CMB bereits sechs Monate nach dem zerebrovaskulären Ereignis mit einem kognitiven Abbau assoziiert sind. Multilokuläre CMB zeigen eine stärkere Auswirkung auf die Kognition als solche CMB, die in einer einzigen Hirnregion gefunden wurden. Zudem wurde eine signifikante Korrelation zwischen dem Grad der kognitiven Einschränkung und der Anzahl der CMB errechnet. Die separate Betrachtung derjenigen Testungen, welche das episodische Gedächtnis erfassen, zeigte eine Beeinträchtigung der Testpersonen beim Wiedererkennen von zuvor gelernten Wörtern. Bei der Untersuchung des semantischen Gedächtnisses der ProbandInnen fiel eine signifikant eingeschränkte phonematische Wortflüssigkeit auf, die semantische Flüssigkeit und das Benennen jedoch waren weniger betroffen. Die Domäne „Visuokonstruktive Fähigkeiten“ wurde ebenfalls in drei Untertests beurteilt. Hierbei zeigten sich keine Defizite der Testgruppe beim Abzeichnen der dargebotenen Figuren, die Reproduktion hingegen war signifikant gestört. Es zeigte sich keine CMB-bedingte Einschränkung der exekutiven Funktionen. / In this study, we aimed to investigate (1) whether cerebral microbleeds (CMB) are associated with cognitive decline 6 months after ischemic stroke and if so (2) whether there are some cognitive domains that are affected more preferentially by CMB. In a prospective cohort study, cognitive function was investigated in 33 patients with ischemic stroke or transient ischemic attack (TIA) and ≥ 1 CMB valuated by the Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Diseases (CERAD)-plus test battery. The cognitive performance of these patients was compared with 33 stroke survivors without CMB . Both groups were matched for age, gender, clinical and radiological characteristics. This study yielded the following main findings: (1) within 6 months after ischemic stroke or TIA, CMB-positive patients revealed cognitive decline in more than one cognitive domain; (2) among tested domains, memory and phonemic fluency were most affected in CMB-positive patients, and (3) an occurrence of CMB in more than one of the predefined brain regions was associated with more pronounced cognitive deficits.

Eine Vielzahl von Studien konnte den nützlichen Effekt einer Knochenmarkzelltherapie nach Schlaganfall an Ratten nachweisen. Diese Ergebnisse ließen sich jedoch in klinischen Studien nicht reproduzieren. Eine mögliche Ursache können die Unterschiede zwischen den eingesetzten Versuchstieren und Zellspendern sowie den Patienten im klinischen Bereich sein. Während die eingesetzten Tiere und Spender meist jung und gesund waren, ist der typische Schlaganfallpatient in der Regel älter und leidet an einer Vielzahl von Begleiterkrankungen. Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen von erhöhtem Alter und Begleiterkrankungen auf die Effektivität einer Knochenmarkzelltherapie des Schlaganfalles zu untersuchen. Zu diesem Zwecke wurde die Arteria cerebri media von 18 Monate alten spontan-hypertensiven Ratten operativ verschlossen. Nach 24 Stunden wurden entweder Zellen eines jungen oder eines alten Spender transplantiert. Tiere, die eine äquivalente Menge an PBS erhielten, dienten als Kontrolle. Im Anschluss wurden das neurofunktionelle Defizit und das Infarktvolumen über einen Zeitraum von 63 Tagen mittels verschiedener Verhaltenstest und magnetresonanztomographischer Bildgebung analysiert. Nach Induktion des Schlaganfalls kam es zu einer Abnahme der funktionellen Leistung in allen Verhaltensversuchen, die sich jedoch bis zu Tag 27 wieder erholte. Im MRT war im gleichen Zeitraum eine Reduktion des Infarktvolumens zu beobachten. In der zweiten Versuchshälfte kam es anschließend zu keinen weiteren Veränderungen, weder funktional noch morphologisch. Ein Einfluss der Therapie auf die Regeneration oder die Größe des Infarkts, war zu keinem Zeitpunkt feststellbar. Anhand dieser Ergebnisse muss in Frage gestellt werden, ob gealterte und komorbide Tiere durch einer Zelltherapie nach Schlaganfall profitieren können und ob sich Zellen älterer Spender als Therapeutikum für einer Knochenmarkzelltherapie des Schlaganfalls eignen.

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Schlaganfälle gehören zu den drei häufigsten Todesursachen und stellen das Gesundheitssystem vor große Herausforderungen. Behandlungsstrategien des ischämischen Schlaganfalls sind immer noch begrenzt, wobei enorme Anstrengungen in der präklinischen Forschung zwar erfolgreich waren, aber unter klinischen Bedingungen keine Effektivität zeigen konnten. Zu den Voraussetzungen einer Translation präklinischer Ergebnisse zählen klinisch relevante Schlaganfallmodelle sowie die Berücksichtigung potentieller Komorbiditäten und altersabhängiger Effekte. Eine umfassende Betrachtungsweise des schlaganfallbedingten Gewebeschadens gilt als vielversprechend, wie es das Konzept der neurovaskulären Einheit (neurovascular unit, NVU) erlaubt. Dieses Konzept beinhaltet Neurone, Gefäße und Gliazellen mit Astrozytenendfüßen, die in enger Beziehung zur extrazellulären Matrix (EZM) stehen. Die Rolle der EZM-Bestandteile während der Entwicklung von schlaganfallbedingten Gewebeschäden wird bislang nur wenig verstanden und kann daher nicht für Behandlungsstrategien genutzt werden. Die bereits Ende des 19. Jahrhunderts erstmals von Camillo Golgi beschriebenen perineuronalen Netze (PN) sind ein wichtiger Bestandteil der EZM, die in vielen Hirnregionen zu finden sind. PN bilden eine aus Proteoglykanen, Glykoproteinen und Hyaluronsäure bestehende netzartige Struktur, die um Neurone und deren proximalen Dendriten sowie um die Initialsegmente von Axonen nachweisbar ist. Weitere Studien zeigten PN häufig als Umhüllung von inhibitorischen GABAergen Zellen, die das Kalzium-bindende Protein Parvalbumin und die Untereinheit des spannungsabhängigen Kaliumkanals Kv3.1b koexprimieren. Zu den diskutierten Funktionen gehört eine neuroprotektive Wirkung gegenüber neuropathologischen Veränderungen und oxidativem Stress, die Stabilisierung von Synapsen, die Kontrolle neuronaler Plastizität und eine Pufferfunktion um hochaktive Neurone. Die vorliegende tierexperimentelle Studie fokussiert auf Veränderungen der PN als Teil der EZM und Parvalbumin-enthaltender GABAerge Neurone in Mäusen. Dabei lag der Schwerpunkt auf dem Nucleus reticularis thalami (NRT), der in enger Beziehung zur ischämischen Läsion steht, die durch ein Filament-basierendes Schlaganfallmodell induziert wurde. Der NRT erfüllt wichtige neurophysiologische Funktionen, z. B. bei der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus. Die Neurone des NRT sind als GABAerg bekannt und von zahlreichen PN umhüllt. Um PN darzustellen, können Lektine genutzt werden, die an N-Azetylgalaktosamin binden wie z. B. das Wisteria floribunda Agglutinin (WFA). Zum Nachweis der durch Ischämie induzierten Schädigung von Neuronen und Netzkomponenten dienten Immunfluoreszenztechniken. Um den Verlust von PN und die Veränderung von Parvalbumin-immunpositiven Neuronen abzubilden, wurden Färbeserien mittels einer Doppelmarkierung von WFA und Parvalbumin durchgeführt. Ausgewertet wurden insgesamt vier Tiergruppen mit je 7 Mäusen: 3- und 12-Monate alte Wildtyp-Mäuse und komorbide triple-transgene (3xTg) Mäuse mit Alzheimer-ähnlichen Veränderungen. Es erfolgten qualitative und semiquantitative Vergleiche zwischen der ischämischen und der nicht ischämischen Hemisphäre einen Tag nach Induktion des Schlaganfalls. Zur Überprüfung der statistischen Signifikanz kamen der Wilcoxon-Test und der Mann-Whitney-U-Test zur Anwendung. Ergänzend wurden durch Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen detektierte Veränderungen zusätzlicher Netzkomponenten sowie von neuronalen Markern des NRT qualitativ erfasst. Einen Tag nach Induktion der Ischämie ergaben die semiquantitativen Analysen einen drastischen Verlust der PN im ischämischen NRT. Konkret zeigte die WFA-Markierung einen Verlust von Intensität und Zellzahl in allen 4 analysierten Tiergruppen. Die Zahl Parvalbumin-positiver Zellen im ischämischen NRT nahm ab, wobei sich die Intensität der Färbung von betroffener und nicht betroffener Hemisphäre nicht unterschied. Ältere Tiere zeigten eine deutliche Verringerung der Färbeintensität und der Fläche gegenüber jüngeren Tieren in Bezug auf Parvalbumin-Immunreaktivität und WFA-Bindung. Unter Berücksichtigung des genetischen Hintergrundes war die Fläche unabhängig verringert, wobei Wildtypen gegenüber transgenen Tieren in Bezug auf die Zellzahl einen stärkeren Verlust aufwiesen. Die Färbeintensität von Parvalbumin-positiven Zellen hingegen zeigte bei 3xTg Mäusen gegenüber Wildtypen eine geringe Zunahme auf. Zusätzliche qualitative Analysen detektierten im NRT sowohl den Ischämie-induzierten Verlust von PN und im umgebendem Neuropil EZM-Immunreaktivität für Aggrecan und Neurocan als auch verringerte Immunreaktivität für Calbindin, die Kaliumkanal-Untereinheit Kv3.1b sowie die Glutamatdekarboxylase-Isoformen GAD65 und GAD67. Zusammenfassend bestätigen die vorgelegten Daten PN als hochsensitive Bestandteile der EZM. Die Befunde favorisieren EZM-Bestandteile als vielversprechende Angriffspunkte für aussichtsreich erscheinende, künftige Behandlungsmethoden des ischämischen Schlaganfalls.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Grundlagen 2 2.1 Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls 2 2.2 Translation 4 2.3 Komorbidität 5 2.4 Neurovaskuläre Einheit 6 2.5 Perineuronale Netze 8 2.5.1 Chemischer Aufbau der perineuronalen Netze 9 2.5.2 Funktionen perineuronaler Netze 11 2.5.3 Verteilungsmuster im ZNS 13 2.6 Nucleus reticularis thalami 14 3 Zielstellung 15 4 Material und Methoden 16 4.1 Material 16 4.1.1 Versuchstiere 16 4.1.2 Chemikalien 17 4.1.3 Antikörper 18 4.2 Methoden 19 4.2.1 Gewebeaufarbeitung 19 4.2.2 Auswahl der Hirnschnitte 20 4.2.3 Immunhistochemie und indirekte Immunfluoreszenz 20 4.2.4 Lektinhistochemie 21 4.2.5 Fluoreszenz-Doppelmarkierung von perineuronalen Netzen und Parvalbumin 21 4.2.6 Fluoreszenz-Mehrfachmarkierungen für qualitativeAnalysen 22 4.2.7 Kontrollfärbungen 23 4.2.8 Mikroskopie und Bildgebung 23 4.2.9 Semiquantitative Auswertung 24 5 Ergebnisse 26 6 Diskussion 41 6.1 Technische Aspekte 41 6.2 Ischämie und GABAerge Neurone im NRT und anderen Hirnregionen 43 6.3 Schlaganfall-induzierte Veränderungen von perineuronalen Netzen des Nucleus reticularis thalami und anderer Hirnregionen 44 6.4 Perineuronale Netze bei anderen neuropathologischen Veränderungen 45 6.5 Abbau perineuronaler Netze mit Metalloproteinasen, Chondroitinasen und Aggrecanasen 47 6.6 Perineuronale Netze nach Ischämie 49 7 Zusammenfassung 51 8 Literaturverzeichnis 54 8.1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 83 9 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 84 10 Danksagung 85 11 Curriculum Vitae 86

Der ischämische Schlaganfall gehört wegen seiner Folgen wie beispielsweise persistierenden Lähmungen und Sprachstörungen bis hin zum Versterben des Patienten angesichts der hohen Inzidenz zu den derzeit sozioökonomisch bedeutsamsten Krankheitsbildern (Ward et al. 2005, Kolominsky-Rabas et al. 2006). Die Möglichkeiten der Akutbehandlung sind trotz intensiver Forschungsbemühungen während der letzten Jahrzehnte nicht zufriedenstellend, da hierfür nur ein vergleichsweise geringer Anteil der Patienten in Frage kommt. Der Einsatz von neuroprotektiven Substanzen stellt eine vielversprechende Option dar, auch wenn bisher kein Neuroprotektivum den regelhaften klinischen Einsatz erreicht hat. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit an Ratten analysierte den Einfluss der beiden intravenös applizierten Faktoren pigment epithelium-derived factor (PEDF) und epidermal growth factor (EGF) auf die Bestandteile der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bei zerebraler Ischämie. Diese Arbeit basiert ganz wesentlich auf der Studie von Pillai et al. (2013), in der intravenös appliziertes PEDF im Schlaganfall-Tiermodell zum Einsatz kam: Beide Faktoren verkleinerten nach einstündigem filamentären Verschluss der Arteria cerebri media und anschließender Reperfusion die mittels Magnetresonanztomographie (MRT) bestimmte ischämische Läsionsgröße. Darüber hinaus führten sie im geschädigten Gebiet - verglichen mit der Kontrollgruppe - zu einer verringerten Ödembildung. Dabei erzielte die Intervention durch PEDF stärkere Effekte gegenüber der Behandlung mit EGF, im Besonderen wurde in der PEDF- Gruppe die weitere Zunahme des Ödems im Infarktareal und dem unmittelbar angrenzenden Gewebe nach 48 Stunden verringert. Beiträge zur Aufklärung hierfür verantwortlicher molekularer Mechanismen durch histochemische Untersuchungen des Hirngewebes waren Ziel der vorliegenden Arbeit. Hierzu wurde den Tieren das Hirngewebe an Tag 7 nach induziertem Infarkt entnommen und für die immunhistochemische Analyse aufgearbeitet. Mit einem Gefrierschnittmikrotom wurden 30 μm dicke Frontalschnitte der Paraformaldehyd- fixierten Vorderhirnblöcke von 26 Tieren angefertigt. Als Regions of Interest (ROI) innerhalb der Schnitte wurden die striatale Ischämiezone (Infarktkern), eine ipsilateral striatal gelegene, weniger Ischämie-betroffene Zone (Grenzzone), das kontralaterale Striatum (Kontrolle) sowie ein ischämisches Kortexareal festgelegt. Qualitative Analysen umfassten neben wichtigen zellulären Komponenten der BHS, den Astrozyten und Endothelzellen, auch Mikroglia/Makrophagen sowie das azelluläre Basalmembranprotein Kollagen IV. Alle Versuchsgruppen zeigten eine deutliche Hochregulierung von Kollagen IV im zentralen Infarktgebiet, verglichen mit der kontralateralen Hirnregion. Andere Arbeiten hatten diese Überexpression von Kollagen IV zu früheren Zeitpunkten nach Schlaganfall bereits beschrieben (Beaten und Akassoglou 2011, Ji und Tsirka 2012, Summers et al. 2013); neu ist die Persistenz der Hochregulierung bis mindestens Tag 7 nach fokaler zerebraler Ischämie. Im gleichen Ischämie-beeinflussten Gebiet konnten morphologische Zeichen eines veränderten Aktivitätszustandes von Mikroglia/Makrophagen festgestellt werden. In den Regionen, die nicht direkt von der Ischämie betroffen waren (z.B. dem kontralateralen Striatum), stellten sich ramifizierte Mikrogliazellen in mäßiger Dichte dar. Im Gegensatz dazu akkumulierten amöboide Mikroglia/Makrophagen im Infarktareal. In der Übergangszone zwischen geschädigtem Gewebe und nicht direkt Ischämie-betroffenen Regionen zeigte sich in allen Tieren die Ausprägung einer Astroglianarbe, bestehend aus einer dichten Formation von stark GFAP-markierten Astrozyten. Bei der semiquantitativen Gegenüberstellung der einzelnen Untersuchungsgruppen wiesen die mit PEDF behandelten Ratten in Relation zur Kontrollgruppe eine um den Faktor 3 geringere Hochregulierung von Kollagen IV im Infarktgebiet auf. Im Areal der Infarktpenumbra war die Intensität des GFAP-Immunsignals der PEDF-Gruppe im Vergleich zur EGF-Gruppe verdoppelt. Darüber hinaus schienen die Faktoren keinen Einfluss auf die Akkumulation/Morphologie von Mikroglia/Makrophagen im Infarktgebiet zu haben. Hervorzuheben ist die in PEDF-behandelten Ratten gegenüber EGF-behandelten Tieren und Kontrolltieren verringerte Kollagen IV-Hochregulierung im Infarktgebiet und die verstärkte Bildung einer GFAP-immunopositiven Astroglianarbe in der ischämischen Grenzzone. Beide Befunde eignen sich zur Erklärung der durch Pillai et al. (2013) erzielten Ergebnisse. Hinweise für den molekularen Mechanismus, der der Verringerung der BHS-Permeabilität zugrunde liegt, finden sich in vorausgegangenen Studien, die einen antiangiogenetischen Effekt von PEDF über eine Abschwächung des VEGF-Pathways beschrieben haben (Dawson 1999, Liu et al. 2004, Zhang et al. 2006). Die Wirkung von intravenös appliziertem PEDF als neuroprotektive Therapieoption des Hirninfaktes benötigt weitere Untersuchungen um die in beiden Arbeiten festgestellten Effekte zu bestätigen. Hierbei erscheint ein Tiermodell sinnvoll, das – analog zur klinischen Situation – rekanalisierende Therapien wie die Thrombolyse oder mechanische Rekanalisation berücksichtigt. Zusätzliche Mehrfachmarkierungen ermöglichten neue qualitative Aussagen zur zerebralen Ischämie im Rattenmodell, die Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen bieten. Die nähere Charakterisierung von Gefäßveränderungen nach fokaler zerebraler Ischämie gelang durch eine Dreifachmarkierung von STL, Kollagen IV und Fibronektin. Hier zeigte sich neben der bereits oben beschriebenen Hochregulation von Kollagen IV auch eine verstärkte Expression von Fibronektin im Bereich des Infarktkerns, kolokalisiert mit STL-markierten Mikroglia/Makrophagen. Das Areal mit deutlicher Fibronektinmarkierung war flächenmäßig erheblich größer als der Kollagen IV-immunpositive Bereich. Die Analyse der Basalmembranbestandteile kann neue Erkenntnisse zum Mechanismus der ischämischen Schädigung der BHS bei fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell liefern und bietet sich möglicherweise als Indikator für das Schädigungsausmaß an. Darüber hinaus waren im stark Kollagen IV-markierten ischämischen Kernbereich Aquaporin 4 (AQP4)-immunpositive Astrozytenfortsätzen fast vollständig eliminiert. Mit größerer Entfernung vom ischämischen Kern nahm in der Grenzzone die AQP4-Dichte zu, während die Kollagen IV-Immunmarkierung schwächer wurde. Dieser Befund deutet auf eine Regulation der Kollagen IV-Expression durch einen intakten Endothelzell-Astrozytenendfuß-Kontakt hin, der in der Ischämiezone aufgehoben scheint. Ein Verlust von Astrozytenendfuß-Endothelzell-Kontakten im Schlaganfall- Tiermodell wurde in einer vorangegangenen Arbeit bereits beschrieben (Ito et al. 2011). Zudem fanden Kwon et al. (2009) eine positive Korrelation zwischen der Anzahl von intakten Astrozyten-Basalmembran-Kontakten zur Dicke der BM im striatalen Kapillargebiet von Ratten. Darüber hinaus konnten Yang und Rosenberg (2011) zeigen, dass in der frühen Phase der zytotoxischen Ödemformation nach Schlaganfall Tiere mit Deletion von AQP4 eine verringerte Ödembildung aufwiesen, wogegen in einer späteren Phase, in der das vasogene Ödem dominiert, AQP4 als passives Wasserkanalprotein die Beseitigung des Ödems beschleunigte (Zador et al. 2007). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen die pathophysiologische Bedeutung AQP4- positiver Astrozytenfortsätze und ihrer Gefäßkontakte speziell im Periinfarktgebiet nahe, sodass diese Strukturen in weiterführenden Studien hinsichtlich ihrer therapeutischen Modulierbarkeit fokussiert werden sollten.:1 Einleitung 1.1 CharakterisierungdesSchlaganfalls 1.1.1 Begriffsdefinition 1.1.2 Epidemiologie 1.2 Blut-Hirn-Schranke (BHS) und Neurovaskuläre Einheit (NVU) 1.2.1 Zelluläre und azelluläre Bestandteile der BHS 1.2.2 DiffusionundaktiverTransport 1.2.3 ElektrolyteundWasserhomöostase 1.2.4 Astrozyten 1.2.5 MikrogliaundMakrophagen 1.2.6 Perizyten 1.3 PathophysiologiedesSchlaganfalls 1.3.1 PerfusionundexzitatorischeReaktion 1.3.2 Zelluläre und molekulare Mechanismen der Inflammation 1.4 TherapiedesSchlaganfalls 1.4.1 ThrombolysemittelsAlteplase(rtPA) 1.4.2 IntraarterielleBehandlung 1.4.3 Basistherapie 1.5 Experimentelle Grundlagen der vorliegenden Arbeit 2 Zielstellung 3 Studiendesign, Material und Methoden 3.1 Studiendesign 3.2 Material 3.2.1 UntersuchtesGewebe 3.2.2 Chemikalien 3.2.3 Lösungen 3.2.4 Mehrfachmarkierungen 3.3 Methoden 3.3.1 OperativesVorgehen 3.3.2 Behandlung mit EGF und PEDF 3.3.3 Gewebevorbereitung 3.3.4 Fluoreszenzmarkierungen 3.3.5 Ausschlusskriterien 3.4 Auswertung 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie 3.4.2 Semiquantitative Analyse von Kollagen IV, GFAP und Iba 3.4.3 QualitativeAnalysen 4 Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Tiermodell 5.2 OperativesVerfahren;tMCAO 5.3 VEGFundAQP4 5.4 KollagenIVundFibronektin 5.5 DetektionvonAstroglia 5.6 DarstellungvonMikrogliaundMakrophagen 5.7 PEDFundEGFalsNeuroprotektiva 6 Zusammenfassung der Arbeit

Die erfolgreiche Übertragung der vielversprechenden Ergebnisse aus zahlreichen Kleintierstudien zu den neuroprotektiven und -regenerativen Eigenschaften des Wachstumsfaktors G-CSF auf eine multizentrische randomisierte Phase-IIa-Studie misslang. Bei näherer Betrachtung fiel eine deutlich höhere Dosierung des Wachstumsfaktors in der humanen Studie im Vergleich zu den erfolgreichen präklinischen Studien auf, sodass Fragen nach einem schädigenden Einfluss möglicher immunologischer Veränderungen aufkamen.Um dies zu überprüfen, wurde in einem murinen Schlaganfallmodell eine quantitative FACS-Analyse des frühen entzündlichen Hirninfiltrats und der Immunzellpopulationen im peripheren Blut mit besonderem Augenmerk auf neutrophile Granulozyten 24 Stunden nach (Schein-)Schlaganfall durchgeführt. Ergänzend erfolgte eine immun-histochemische Beurteilung des Infiltrationsverhaltens neutrophiler Granulozyten, wobei neben der räumlichen Verteilung die Zellmorphologie untersucht wurde.:Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI Abkürzungsverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Der Schlaganfall 1 1.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Relevanz 1 1.1.2 Ätiologie und Pathogenese 1 1.1.3 Klinische Symptomatik 2 1.1.4 Rekanalisierende Therapie 2 1.2 Immunologie des Schlaganfalls 3 1.2.1 Das Gehirn als immunprivilegiertes Organ 3 1.2.2 Immunantwort nach Schlaganfall 3 1.2.3 Bedeutung neutrophiler Granulozyten für die Immunantwort 6 1.2.4 Rolle des neutrophilen Granulozyten im Schlaganfall 7 1.3 Der Granulozyten Kolonie-stimulierende Faktor 10 1.3.1 G-CSF im Schlaganfall 10 1.3.2 Einführung 12 1.3.3 Präklinische Schlaganfallstudien mit G-CSF 14 1.3.4 klinische Schlaganfallstudien mit G-CSF 14 1.4 Dosistranslation von experimentellen zu klinischen Studien 16 2 Zielstellung der Arbeit 17 3 Material und Methoden 18 3.1 Versuchstiere 18 3.2 Schlaganfallmodell 18 3.3 Ein- und Ausschlusskriterien 19 3.4 Versuchsplan 20 3.5 Behandlung mit G-CSF 21 3.6 Euthanasie und transkardiale Perfusion 22 3.7 Quantifizierung der Leukozytenzahl im Vollblut 23 3.8 Durchflusszytometrische Aufarbeitung 23 3.8.1 Lyse- und Färbeprotokoll Blut 23 3.8.2 Isolation von Immunzellen aus dem Maushirn und Färbeprotokoll 24 3.9 Durchflusszytometrische Analyse 25 3.10 Histopathologische Aufarbeitung 26 3.10.1 Anfertigung histologischer Schnitte im Kryostat 26 3.10.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 27 3.10.3 Immunfluoreszenz 27 3.10.4 Differenzierung von Granulozyten und Monozyten 29 3.10.5 Immunhistochemische Auszählung 29 3.10.6 Darstellung der räumlichen Verteilung 31 3.11 Statistische Auswertung 33 4 Ergebnisse 34 4.1 Durchflusszytometrie 34 4.1.1 Veränderungen des Körper- und Milzgewichts 34 4.1.2 Immunzellpopulationen im peripheren Blut 35 4.1.3 Immunzellpopulationen im Hirnisolat 38 4.2 Immunhistochemie 42 4.2.1 Differenzierung von Monozyten und Granulozyten 42 4.2.2 Quantitative Analyse 43 4.2.2.1 Ipsilateral / kontralateral 44 4.2.2.2 Meningeal / intrazerebral 45 4.2.2.3 Rund / stäbchenförmig 46 4.2.3 Räumliche Verteilung der neutrophilen Granulozyten 47 5 Diskussion 51 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse 51 5.2 G-CSF und die Einwanderung neutrophiler Granulozyten 53 5.3 G-CSF und die Zusammensetzung des frühen entzündlichen Infiltrats im Gehirn 54 5.4 G-CSF und die räumliche Verteilung einwandernder neutrophiler Granulozyten 56 5.5 G-CSF und die Zellmorphologie einwandernder neutrophiler Granulozyten 58 5.6 G-CSF und die periphere bzw. systemische Immunantwort 60 5.7 Methodische Einflussfaktoren und Limitationen der Arbeit 63 5.7.1 Berechnung der murinen Äquivalenzdosis 63 5.7.2 Wahl des Schlaganfallmodells 64 5.7.3 Immunologische Unterschiede zwischen Maus und Mensch 65 5.7.4 Methoden und Versuchstieranzahl 66 5.7.4.1 Durchflusszytometrie 66 5.7.4.2 Immunhistochemie 67 5.8 Ausblick 68 6 Zusammenfassung 70 Literaturverzeichnis XI Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XXVII Tabellarischer Lebenslauf XXVIII Publikationen XXIX Danksagung XXX

Aufgrund der steigenden Prävalenz und der bisher unzureichenden Behandlungsmöglichkeiten ist der Schlaganfall Gegenstand intensiver Forschung. Ein vielversprechender therapeutischer Ansatz ist die Hemmung der überwiegend destruktiven Entzündungsantwort nach dem ischämischen Ereignis, zum Beispiel durch die Applikation von potentiell neuroprotektivem hyperbarem Sauerstoff (HBO). Die vorliegende experimentelle Arbeit am thrombembolischen Rattenmodell untersuchte die Einwanderung Makrophagen-artiger Zellen sowie längerfristige mikrogliale und astrozytäre Veränderungen nach akuter fokaler zerebraler Ischämie. Dabei erhielten die Tiere eine Monotherapie mit rekombinantem Gewebsplasminogenaktivator (rtPA), die einzige bisher zugelassene medikamentöse Therapieoption, oder eine Kombinationstherapie von rtPA mit HBO. Mit Hilfe des immunhistochemischen Nachweises gegen CD68 konnten einwandernde Makrophagen-artige Zellen erfasst und semiquantitativ ausgewertet werden. Verschiedene Immunfluoreszenz-Mehrfachmarkierungen und konfokale Laserscanningmikroskopie ermöglichten die simultane Detektion von mehreren Mikrogliapopulationen, Astroglia und Neuronen. Zwei bis vier Wochen nach Infarkt konnte in der rtPA + HBO-Gruppe eine abnehmende Tendenz akkumulierter Zellen nachgewiesen werden. In Tieren der Kontrollgruppe zeigte sich reaktive Mikroglia vor allem im Infarktkern, während Astrozyten im Randbereich des Infarktes eine zirkuläre Form annahmen. Die vorliegende Arbeit konnte einen Einfluss von HBO auf die Einwanderung von Makrophagen-artigen Zellen nachweisen sowie neue Erkenntnisse über regionale Unterschiede langfristiger Gliareaktionen liefern.:Inhaltsverzeichnis Bibliografische Beschreibung I Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung 1 1.1 Charakterisierung des Schlaganfalls 1 1.2 Zelluläre und molekulare Vorgänge nach zerebraler Ischämie 2 1.2.1 Inflammationsreaktionen 3 1.2.1.1 Einwanderung peripherer Leukozyten 4 1.2.1.2 Aktivierung von Mikroglia 5 1.2.1.3 Eigenschaften von Matrix-Metalloproteinasen 6 1.3 Penumbra als Zielgewebe therapeutischer Interventionen 7 1.4 Lysetherapie mit rekombinantem Gewebsplasminogenaktivator 8 1.5 Hyperbare Sauerstofftherapie 9 1.5.1 Physiologische Grundlagen 9 1.5.2 Potentielle Effekte bei fokaler zerebraler Ischämie 11 2. Zielstellung 14 3. Studiendesign, Material und Methoden 15 3.1 Studiendesign 15 3.2 Material 15 3.2.1 Tierisches Gewebe 15 3.2.2 Chemikalien 16 3.2.3 Lösungen 16 3.3 Methoden 17 3.3.1 Operatives Vorgehen 17 3.3.1 Behandlung mit medikamentöser Lyse und hyperbarem Sauerstoff 18 3.3.3 Gewebepräparation 19 3.3.2 Immunhistochemie 19 3.3.2.1 Immunperoxidasefärbungen 19 3.3.2.2 Immunfluoreszenz-Markierungen 22 3.3.3 Auswertung 25 3.3.3.1 Licht- und Fluoreszenzmikroskopie 25 3.3.3.3 Erfassung eingewanderter Makrophagen-artiger Zellen 26 4. Ergebnisse 28 4.1 Lokalisation und Ausdehnung der fokal zerebralen Ischämie 28 4.2 Einwanderung Makrophagen-artiger Zellen in den Infarktbereich 31 4.2.1 Ischämiezone 31 4.2.2 Ischämischer Randbereich 33 4.3 Veränderungen von Mikroglia, Astrozyten und Nervenzellen nach fokaler zerebraler Ischämie 34 5. Diskussion 40 5.1 Verwendung des thrombembolischen Rattenmodells 41 5.2 Antikörper gegen CD68 für die Detektion Makrophagen-artiger Zellen 44 5.3 Lokalisation der Infarkte nach thrombembolisch induzierter fokaler zerebraler Ischämie 46 5.4 Zeitlich- räumlicher Verlauf der Akkumulation Makrophagen-artiger Zellen 48 5.5 Inflammationsreaktion 4 Wochen nach Schlaganfall 54 5.6 Resümee 56 6. Zusammenfassung 57 Tabellenverzeichnis VIII Abbbildungsverzeichnis IX Literaturverzeichnis X Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XXV Lebenslauf XXVI Publikationen XXVII Danksagung XXVIII

Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um experimentelle Untersuchungen zu funktionellen Aspekten der neurovaskulären Einheit im Tiermodell. Mittels Licht,- Fluoreszenz- und der Elektronenmikroskopie sowie diverser immunhistochemischer Nachweisverfahren konnten wir verschiedene Populationen der neurovaskulären Einheit näher charakterisieren. So konnten wir nachweisen, dass im Hirnparenchym eine Population CD11c-positiver, dendritischer Zellen existiert, welche im gesunden Gehirn hauptsächlich an Prädilektionsstellen für Entmarkungsherde im Rahmen der Multiplen Sklerose vorkommt. Weiterhin zeigten wir im Tiermodell, dass die über Diphterietoxin vermittelte Oligodendrozytendepletion mit einer Demyelinisierung der Axone im Gehirn einhergeht, wobei die Freisetzung und Drainage der Antigene in zervikale Lymphknoten keine gegen das Gehirn gerichtete Autoimmunität auslöst. Ebenso untersuchten wir den Beitrag endothelialer Tight junctions zur Bluthirnschrankenstörung im Modell der fokalen Ischämie an der Ratte. Hierbei waren wir in der Lage nachzuweisen, dass entgegengesetzt zur herrschenden Lehrmeinung diese nicht verantwortlich für die erhöhte Gefäßpermeabilität im Rahmen des Schlaganfalls im Tiermodell zu sein scheint. Vielmehr konnten wir mit Hilfe der Elektronenmikroskopie einen neuen Mechanismus aufzeigen. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse bezüglich der Interaktion der verschiedenen Populationen der neurovaskulären Einheit und können somit zur Entwicklung neuer Modelle verschiedener Pathologien des Zentralnervensystems beitragen.

Die systemische Thrombolyse mit rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) stellt das einzige pharmakologisch evidente und kausale Therapiekonzept für die Behandlung der akuten zerebralen Ischämie dar. Dieses Be-handlungskonzept ist nur in einem kurzen therapeutischen Zeitfenster anwendbar und birgt das Risiko unerwünschter zum Teil lebensbedrohlicher Nebenwirkungen. Darüber hinaus ist rtPA potenziell neurotoxisch. In der vorliegenden Arbeit sollten am thrombembolischen Schlaganfallmodell der Ratte die Effekte der hyperbaren Sauerstofftherapie (HBO) nach induzierter fokaler zerebraler Ischämie in Kombination mit rtPA erstmals im Langzeitverlauf von 4 Wochen untersucht werden. Grundlage hierfür waren die in früheren Studien nachgewiesenen potenziell neuroprotektiven Effekte der HBO. In 4 verschiedenen Infarkt-assoziierten Arealen wurden durch Immunperoxidasemarkierung Neuronale Nuklei (NeuN) im Gehirn von Ratten detektiert und durch den Vergleich mit der kontralateralen Hemisphäre der Neuronenverlust erfasst. Mithilfe einer Dreifach-immunfluoreszenzfärbung und konfokaler Laserscanningmikroskopie wurden neben dem Neuronenverlust sowohl Astrogliose als auch Mikrogliaaktivierung, als wesentliche Bestandteile der neurovaskulären Einheit (NVU), qualitativ analysiert. Für die Ischämie-assoziierten Gebiete ergab sich ein über den gesamten Beobachtungszeitraum konstantes und mit dem Penumbramodell korres-pondierendes schalenförmiges Muster des Neuronenverlusts. Die Hypothese einer Neuroprotektion durch HBO in Kombination mit rtPA konnte im Vergleich zu früheren experimentellen Studienergebnissen nicht bestätigt werden.:Bibliografische Beschreibung I Abkürzungsverzeichnis II Inhaltsverzeichnis V 1. Einleitung 1 1.1 Sozioökonomische Bedeutung des Schlaganfalls 1 1.2 Pathophysiologische Grundlagen der zerebralen Ischämie 1 1.2.1 Neuronale Zellen und Peri-Infarkt-Depolarisation 2 1.2.2 Oxidativer Stress und Stickstoffmonoxid 4 1.2.3 Nekrose und Apoptose 5 1.2.4 Inflammatorische Prozesse 5 1.2.5 Wechselwirkungen zwischen Neuronen, Astroglia und Mikroglia 7 2. Therapiekonzepte bei zerebraler Ischämie 8 2.1 Thrombolyse mit rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator 8 2.2 Experimentelle Therapieansätze 10 2.3 Physiologische Grundlagen der hyperbaren Sauerstofftherapie 10 2.4 Nebenwirkungen der hyperbaren Sauerstofftherapie 12 3. Zielstellung 13 4. Material und Methoden 14 4.1 Gewebeproben 14 4.2 Studiendesign 14 4.3 Material 15 4.3.1 Verwendete Chemikalien 15 4.3.2 Verwendete Lösungen 16 4.4 Methoden 17 4.4.1 Operativ induzierte thrombembolische Ischämie 17 4.4.2 Applikation von rtPA und hyperbarem Sauerstoff 19 4.4.3 Gewebeaufbereitung 19 4.4.4 Auswahl der Hirnschnitte 19 4.4.5 Erfassung der Infarktlokalisation im Rattenhirn 20 4.4.6 NeuN-Immunperoxidase Färbung 21 4.4.7 Immunfluoreszenzmarkierung von Neuronen, Astro- und Mikroglia 22 4.4.8 Kontrollfärbungen 24 4.4.9 Mikroskopie und Bildgebung 24 4.4.10 Semiquantitative Auswertung 25 5. Ergebnisse 27 5.1 Lokalisation der fokal zerebralen Ischämie im Rattenhirn 29 5.2 Neuronenverlust in Abhängigkeit von zuvor definierten „Regions of Interests“ 30 5.3 Interventionsabhängiger Verlauf des Neuronenverlusts 31 5.4 Aktivierung von Astro- und Mikroglia in Abhängigkeit vom Neuronenverlust 35 6. Diskussion 41 6.1 Translationale Aspekte 42 6.2 Die Penumbra als potenziell rettbares Hirngewebe 45 6.3 Neuronenverlust in Abhängigkeit von zeitlichen Verlauf und Interventionskonzept 47 6.4 Interaktionen von Neuronen, Astro- und Mikroglia nach fokaler zerebraler Ischämie 51 7. Zusammenfassung 56 8. Literaturverzeichnis 59 Tabellenverzeichnis VII Abbildungsverzeichnis VIII Lebenslauf X Publikationen XI Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XII Danksagung XIII

Der Schlaganfall stellt die häufigste Ursache für dauerhafte körperliche Behinderungen im Erwachsenenalter dar. Derzeit steht aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters lediglich für 10% aller Schlaganfallpatienten die kausale Thrombolysetherapie zur Eröffnung des verschlossenen Blutgefäßes zur Verfügung. Eine vielversprechende Therapieoption stellen humane Nabelschnurblutzellen dar, deren Effektivität bisher ausschließlich bei jungen und meist gesunden Tieren nachgewiesen wurde. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Wirksamkeit intravenös applizierter, kryokonservierter mononukleärer Zellen des humanen Nabelschnurblutes auf die Entwicklung eines experimentellen Schlaganfalles in jungen und alten hypertensiven Ratten. Die sensomotorische Regeneration der Tiere wurde anhand der BeamWalk- und mNSS-Tests untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde außerdem der LadderRung Walking-Test etabliert. Parallel durchgeführte MRT-Untersuchungen dienten zur Analyse des Infarktvolumens. Nach Ablauf des 64-tägigen Beobachtungszeitraumes wurde die Proliferationsaktivität von Astrozyten im Randbereich des Infarktes überprüft. Die Auswertungen sensomotorischer Fähigkeiten, der Infarktvolumina und der Zellproliferation ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen Therapie- und Kontrollgruppe beider Altersstufen. Junge und alte Ratten entwickelten vergleichbare Infarktvolumina und wiesen ähnliche motorische Fähigkeiten auf. Ein erhöhtes Alter der Versuchstiere war darüber hinaus mit methodischen Problemen behaftet, was die sensomotorische Funktionalitätsprüfung alter Tiere eingeschränkte und eine histopathologische Auswertung ausschloss.